文摘
闭塞的毛细支气管炎(OB)仍然是最重要的死因肺移植的长期生存。使用一个建立小鼠异位移植气管模型,不同路线的政府的影响来源于多功能的骨基质细胞(msc) OB的发展进行评估。气管从BALB / c小鼠植入皮下组织的主要组织相容性复合体(MHC)不同的C57BL / 6小鼠。移植的时候,骨骨髓来源msc管理系统或本地或通过结合这两种路线。移植后的同种异体移植在不同时间点和上皮完整性进行评估,炎性细胞浸润、纤维化,细胞腔的消亡。我们发现最有效的路线骨骨髓来源MSC政府系统性和当地的交付。受体小鼠msc抑制中性粒细胞、巨噬细胞和t细胞浸润减少纤维化。这些有利影响被观察到,尽管缺乏重要的MSC上皮移植或新的上皮细胞生成。我们的研究表明,最佳组合的系统性和当地的msc可以通过调制改善闭塞的气道疾病的发展的免疫反应。
1。介绍
肺移植是为数不多的治疗方法可用于终末期肺部疾病,如慢性阻塞性肺疾病、特发性肺纤维化,囊性纤维化,alpha1-antitrypsin疾病,原发性肺动脉高压。肺移植的5年生存率明显低于其他实体器官移植1- - - - - -4),和并发症的慢性肺排斥负责大部分的死亡。慢性肺排斥临床上称为闭塞性细支气管炎综合征和病理分类为闭塞的毛细支气管炎(OB)。在疾病的发展过程中,慢性炎症和fibroproliferative过程导致小气道阻塞,目前没有有效的治疗方法是(5,6]。OB最初被认为是由于供体抗原的免疫反应(7];然而,多发地机制也可以发挥重要作用在疾病的自然历史8- - - - - -10]。最近的研究强调先天的角色多形核中性粒细胞(中性粒细胞)和炎症细胞如巨噬细胞在慢性排斥反应5,11]。中性粒细胞是第一批炎症细胞中检测到支气管肺泡灌洗和肺活检的患者标本OB (12- - - - - -14),他们也在增加小鼠气管移植模型(15,16]。巨噬细胞中也扮演着重要的角色在慢性排斥反应的发病机制消耗巨噬细胞改善OB (17]。此外,越来越多的证据支持淋巴细胞的重要作用的发病机制OB (5,11]。
来源于多功能的骨基质细胞(msc)评价实验和临床治疗各种病理条件。虽然最初是从骨髓msc已经被孤立的从多种来源,包括脂肪组织,胎盘组织,牙髓,其他几个人。缺乏类MHC I和缺乏MHC II类和其他costimulatory分子允许政府这些细胞没有明显的宿主反应(18]。实质性的进展仍然是由msc在肺损伤和修复19,20.]。肺损伤修复能力最初猜测是由于骨髓间充质获得上皮表型的潜在能力和灌输结构性肺细胞。然而,与msc移植,与大多数其他细胞类型调查到目前为止,是一种罕见的肺部生理意义不确定的事件。因此,强调日益转向深刻的免疫调节,抗炎,nonimmunogenic msc的属性。在体外模型系统中,msc的抑制增殖和功能广泛的免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞和树突细胞。值得注意的是,msc抑制t细胞增殖、活化和细胞因子释放对同种抗原(21]。此外,msc也会影响行为的巨噬细胞(22,23]。在这种背景下,一些研究报道MSC政府在不同的功效在小鼠肺损伤模型,例如,肺动脉高压(24),支气管肺的发育不良(25],OB (26]。本研究的目的是评估不同路线的MSC交付和使用建立各自的功效异位OB的气管移植小鼠模型27]。我们的数据表明,骨骨髓来源的最有效途径MSC政府的组合系统和本地交付。治疗受体小鼠msc抑制炎症细胞浸润和纤维化没有显著减少上皮移植。
2。材料和方法
2.1。动物维护和异位气管移植模型
C57BL / 6和BALB / c小鼠(6 - 12周)从查尔斯河实验室购买(马威尔明顿)。的β肌动蛋白/增强型绿色荧光蛋白(eGFP)转基因小鼠最初成立于Irving Weissman的实验室(28]。老鼠被安置在波士顿儿童医院在特定的无菌条件下动物设施。建立模型涉及异位移植气管的OB MHC-mismatched组合C57BL / 6 (h - 2 b)和BALB / c小鼠(H-2d)是用作前面描述的27]。简单地说,捐赠者BALB / c小鼠安乐死和气管切除并立即放置在冰冷的磷酸盐(PBS)。收件人C57BL / 6小鼠麻醉,气管移植插入皮下口袋里的老鼠。在2天,1周、2周和4周后移植,收件人小鼠安乐死和气管立即收获。所有动物协议是经儿童医院动物保健和使用委员会。
2.2。骨骨髓来源MSC隔离、文化和分化
骨骨髓来源msc被隔绝的股骨和胫骨6至9-week-old C57BL / 6小鼠和GFP小鼠如前所述[29日]。简而言之,每个胫骨和股骨的两端剪暴露骨髓的骨头被插入到适应离心管。管是离心机1分钟400 g收集骨髓。颗粒是resuspended 3毫升α最小基本介质(MEM)介质(英杰公司)通过21-gauge针过滤通过70紧随其后μ米尼龙网过滤器。骨髓细胞分层在Ficoll-Paque (Amersham,皮斯卡塔韦,新泽西)密度梯度离心,镀。细胞被允许坚持25厘米的塑料表面2组织培养瓶(猎鹰3081)48 h在不干扰αmem培养基补充10% non-heat-inactivated的边后卫(Hyclone) [30.),10%马血清(σ),1 x谷酰胺(表达载体),和1%的P / S,所描述的Peister et al。29日]。塑料贴壁细胞在文化与媒体保持改变每2 - 3天。后2 - 3段,immunodepletion按出版协议和执行国际社会细胞治疗指南(31日]。FITC-CD14,细胞被消极地选择FITC-CD11b FITC-CD19, PE-CD31, PE-CD34, FITC-CD45,积极选择为APC-Sca-1 fluorescence-activated细胞分选仪(MoFlo, beckman coulter数字1(一)- - - - - -1 (d))。Fluorescence-conjugated抗体购自BD生物科学,BioLegend, eBioscience。MSC文化的分化潜能评估后出版协议(29日)(图1 (e)- - - - - -1 (h));脂肪生成被培养诱导msc在完成αmem培养基,补充了5μ50 g / mL胰岛素μ吲哚美辛,1μ0.5 M地塞米松,μM 3-isobutyl-1 methylxanthine (IBMX)。三周后,这些细胞被固定用10%福尔马林和沾0.5%油红O甲醇(图1 (f))。对软骨形成,StemXVivo鼠标chondrogenic补充和基础媒体(从研发系统)。简单地说,msc在0.5毫升resuspended chondrogenic分化培养基(基地中加上chondrogenic补充和青霉素、链霉素)和离心机形成颗粒的介质。文化与新媒介的MSC丸仍然每3天。三个星期后,介质被小心翼翼地吸气和MSC-pellets 10%福尔马林固定,石蜡嵌入式,分段。羊抗体II型胶原蛋白和anti-sheep免疫球蛋白二次抗体共轭NorthernLights 557(从研发系统)被用来评估软骨形成的鼠标msc(图1 (g))。骨生成,细胞补充20毫米β甘油磷酸,50 ng / mL甲状腺素,1 nM地塞米松,0.5μM抗坏血酸盐与媒体变化2-phosphate每周3次。最后3周,细胞与10%福尔马林固定和染色茜素红(图1 (h))。GFP-MSCs GFP小鼠中分离,从卡拉获得金正日的实验室(干细胞项目,波士顿儿童医院)。
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2.3。骨骨髓来源msc
骨骨髓来源msc是同种异体移植物移植前通过不同的路线。气管内的注入(T),msc在20μL PBS的腔注入新鲜的孤立的捐赠气管,两端的仔细与手术缝合。静脉注射,msc在100年μL PBS通过retroorbital静脉注射(IV)。这两个组合的路线(IV + T)气管移植之前,msc在气管内的和静脉注射。高剂量的msc的功效,(2 x)和(10倍),也检查了我们的同种异体移植物模型。PBS是用作控制而不是msc在所有实验。
2.4。准备气管外植体
受体小鼠安乐死通过窒息和植入气管立即被移除,重,放在冰。航空公司是固定在formalin-free锌固定剂(圣地亚哥BD生物科学Pharmingen CA),切成两半,石蜡包埋,砍倒了一边。截面的气管组织(5μ米)受到苏木精和伊红染色()),马森的三色的染色,或各种特定的抗体染色如下所述。
2.5。评估气管腔的毁灭以及上皮的完整性
)染色进行所有气管移植在2天,1周,2周,4周后移植。部分是由两个独立的调查人员然后显微镜下检查实验群体也不清楚。规模,从0(没有删除)到4(最大删除),用于年级腔的消亡。气管上皮细胞的部分是分级的覆盖率百分比腔的表面。
2.6。免疫组织化学
多形核中性粒细胞(中性粒细胞)沾鼠anti-mouse粒细胞抗体标记Ly-6C / 6 g (Gr-1)。巨噬细胞是沾染了老鼠anti-mouse Mac-3 (BD生物科学Pharmingen),与兔子anti-mouse CD3-positive细胞CD3 (Abcam),与鸡anti-GFP GFP-positive细胞(绿色荧光蛋白)抗体(鸟类实验室),分别。标准的ABC向量工具包(向量实验室,伯林盖姆,CA)和民建联试剂。可视化CD3-positive细胞TSA生物素系统(珀金埃尔默)被用来提高染色。特异性的染色证实了使用同形像控制抗体。中性粒细胞是手动计算在整个部分(气管腔的内外)的同种异体移植物CD3-positive细胞,巨噬细胞数在4在显微镜下随机大功率领域。
2.7。评估肝纤维化、羟脯氨酸含量的分析
我们染色的胶原蛋白在石蜡包埋的幻灯片来评估肝纤维化的程度通过光学显微镜使用马森的三色的染色工具(σ)根据制造商的指示。气管羟脯氨酸含量测定,确定使用方法概述了胶原蛋白沉积Woessner Jr。32]。短暂,移植气管在汉克斯手动均相平衡盐溶液(哈佛商学院)和speed-vac干。样本在6 M盐酸水解后18小时在110°C。整除(100μL)分析了羟脯氨酸含量的混合chloramine-T和埃利希试剂生产羟脯氨酸量化为550 nm spectrophotometrically发色团。标准曲线生成每个实验在96孔板使用trans-4-Hydroxy-L-proline(σ)。
2.8。统计分析
未配对学生的以及用于统计分析。一个值小于0.05被认为是表明两组之间的显著差异。
3所示。结果
3.1。msc移植抑制中性粒细胞浸润
组织病理学改变在疾病发展的初始阶段OB显示入侵的中性粒细胞作为炎症反应(5]。探讨msc在同种异体移植物的影响模型,细胞染色granulocyte-antibody Ly6C / 6 g在气管组织2天,1周,2周,4周后移植数。我们观察到大量中性粒细胞浸润在气管实质PBS-control集团,而中性粒细胞的数量在MSC / IV +指善待老鼠明显降低在为期两天的1周组(图2)。这种抑制作用不显著以后点(两组:控制= 255,实验= 526,;四周组:控制= 34,实验= 36)。有趣的是,在中性粒细胞的数量无显著差异被发现在MSC / IV -或MSC /指善待老鼠在任何时间点(数据未显示)。这些数据表明,msc通过IV + T会抑制中性粒细胞浸润在移植早期的炎症反应。
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3.2。msc减少巨噬细胞在移植的积累
类似于我们的观察中性粒细胞,积累的Mac 3-positively气管同种异体移植物的彩色巨噬细胞显著减少在MSC / IV +指善待老鼠在1周,2周,4周后移植(图3)。这有益的巨噬细胞积累由于巨噬细胞数量减少,可比在MSC / IV +指善待组和PBS-control组在移植后2天。一致与中性粒细胞,我们发现没有显著差异在MSC / IV - MSC /指善待团体在任何时间点(数据未显示)。这些数据表明,msc通过IV + T可以减少长期积累的巨噬细胞移植。
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3.3。msc抑制同种异体t细胞反应
T -和淋巴细胞的先天免疫细胞损伤后已经入侵到同种异体移植物。独立于交付的路线,显著减少CD3-positive T细胞被认为在所有MSC-treated组,第四,第四,T,在移植后4周(图+ T4)。在其他时间点(2天、1周、2周),然而,没有显著差异在MSC-treated CD3阳性细胞的数量和PBS-control团体(数据没有显示)。这些数据表明,msc可以降低同种异体t细胞反应路线的独立交付。
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3.4。减少纤维化MSC-Treated接受者
在疾病过程中维修响应启动涉及纤维母细胞增殖和细胞外基质沉积5]。调查是否管理MSC对纤维化的发展有益,羟脯氨酸含量MSC-treated气管进行了分析。我们发现显著降低羟脯氨酸浓度在移植后4周IV + T组(图5)。没有显著差异IV + T组在2天,移植后1周和2周(数据没有显示)。再次,类似于我们发现中性粒细胞和巨噬细胞,羟脯氨酸含量的差异不显著的MSC / IV - MSC /指善待团体在任何时间点(数据未显示)。这些数据表明,msc通过IV + T能阻止纤维化在同种异体气管移植后4周。
3.5。msc对同种异体移植物保护剂量独立的方式
当msc通过气管内的(细胞)和静脉(细胞)的路线,两倍的msc给收件人老鼠。我们设计实验,以排除的可能性更大的有益影响MSC / IV +医疗实现的高剂量MSC。在随后的同种异体移植物移植,msc及msc被注射或气管内的静脉注射。比较Ly6C / 6 g-positive细胞(中性粒细胞)数据显示没有区别MSC-treated和细胞或MSC-treated老鼠(数据未显示)。这些结果表明,msc对同种异体移植物保护剂量独立的方式。
3.6。免疫调节的msc不需要上皮移植
我们还进行了气管同种异体移植物移植实验使用GFP-labeled msc。我们发现msc局部或系统没有明显集成在气管上皮细胞(图6)。这个结果表明上皮移植可能不是一个先决条件msc在这项研究中观察到的免疫调节。此外msc似乎并不导致新的气管上皮细胞移植。
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3.7。缺乏改善腔的闭塞或上皮的完整性
OB的发展特点是失去上皮细胞在移植后的初始阶段和后续fibroproliferative过程导致腔的闭塞的航空公司。我们调查了msc是否可以预防或减缓这些过程。如图7气管移植的导管闭塞程度可比MSC-treated和PBS-control团体之间在所有情况下。同样,组织病理评价气管腔的完整性的MSC-treated收件人没有显示显著的改善与对照组相比(数据没有显示)。缺乏改善腔的闭塞或上皮完整性似乎符合缺乏上述气管移植MSC移植。
(一)
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4所示。讨论
肺移植是唯一可用的治疗方案对许多终末期肺部疾病。然而,在肺移植同种异体移植物长期存活是受到慢性移植物功能障碍。主要的外科技术的改进,管理与免疫抑制药物,感染和控制改善了生存1年70 - 80%,但是由于OB死亡率仍然高得惊人,只有40 - 50%生存5年之后OB发展(5,9,33,34]。肺有最高的排斥率在所有实体器官移植,可能由于上皮免疫脆弱性和损伤由于其不断暴露在空气中的抗原,病原体和污染物。虽然病理生理学导致OB不是完全理解,对供体抗原的免疫反应在疾病的发展中扮演着重要角色。使用异位气管移植模型实验证明alloimmunity是必需的(7]。目前治疗没有疗效。因此,OB仍然是一项艰巨的挑战与有限的治疗方案和死亡率高得令人无法接受。因此,继续寻找新策略来减少肺移植后慢性移植物功能障碍是十分必要的。
细胞再生治疗肺部疾病提供了巨大的希望,包括应用程序的广泛研究msc (20.]。虽然最初认为移植msc将受伤的灌输和迁移到网站来取代不正常细胞和炎症细胞相互作用,越来越多的证据表明,大多数系统管理msc被困在毛细血管网络,例如,肺初步的效果,寿命较短,分布在身体其他器官瞬态和可以忽略不计35- - - - - -38]。在目前的研究中,我们调查了msc在异位气管移植模型的影响。我们的研究结果表明,治疗与msc抑制受体小鼠中性粒细胞,巨噬细胞和t细胞浸润减少纤维化支持msc在限制组织损伤的关键作用调节免疫反应。msc的有益的免疫调节作用,不需要表明上皮移植的细胞旁分泌的影响。当刺激损伤和炎症,msc可能释放大量的可溶性因子可能对组织施加净营养作用,刺激血管生成,限制细胞凋亡和招募免疫细胞的损伤,并最终减少纤维化。这些影响可能发生独立的MSC移植和分化39]。早期的研究调查了msc在异位气管移植模型(26,40),但上皮集成没有检查。此外,MSC管理的最有效方法是未知的和特别重要的在考虑未来的临床应用。我们的研究表明,结合本地和系统性的msc更有效地改善在闭塞的气道炎症疾病的发展,这表明当地以及系统性免疫调节是很重要的。此外,我们的研究表明,msc没有灌输他们似乎也没有导致新的上皮细胞。自改善上皮完整性防止腔的闭塞后气管注入上皮/祖细胞(41),缺乏上皮集成的msc可以解释缺乏改善腔的毁灭在我们的实验。
虽然临床研究刚刚开始检查的有效性msc在实体器官移植排斥反应的预防(ClinicalTrials.gov标识符NCT01668576:在肺移植间充质干细胞的特性),动物模型充分的证据表明,这种方法可能会有好处。在大多数这些调查,同种异体器官移植msc当时coinfused。改进的同种异体移植物存活率和减少并发药理免疫抑制的必要性已报告(42- - - - - -44]。毫不奇怪,msc的强有力的免疫调节效应t细胞反应似乎是最重要的预防同种异体移植物排斥反应的能力。有趣的是,在当前的研究中msc对同种异体移植物保护剂量独立的方式,底层的机制需要进一步调查。先前的研究与遗传谱系追踪和上皮细胞的选择性消融表明肺部祖细胞的存在(19,20.]。充分的困难,扩大这些假定的肺部祖细胞治疗应用的一个主要挑战。最近的一份报告表明,注入受体上皮细胞祖细胞防止上皮损失和减少OB发展(41]。因此,msc和肺上皮细胞祖细胞可能代表一个理性命题未来的实验,在上皮细胞祖细胞保持腔的完整性和msc减弱炎症。多管齐下治疗可能是最好的方法复杂的排斥的免疫原性环境问题不断暴露的肺引发炎症。许多可取的属性msc可能使这些细胞有用的各种条件,包括肺移植的治疗方法。进一步努力阐明msc的有利影响的分子机制将帮助我们了解使用这些细胞临床最有效的方法。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
艾丽西亚凯西,拖延时间的短剑,和奥林·d·梁同样这项工作。
确认
费边短剑从勃林格殷格翰集团是由一个医学博士奖学金基金和丹妮拉和尤尔根•韦斯特法尔基金会。艾丽西亚凯西被囊性纤维化基金会奖学金培训支持格兰特三年的奖学金。米拉均是由美国国立卫生研究院拨款支持1 KO8 HL084242-01和哈利Shwachman SUBRAM06Q0囊性纤维化临床研究员奖。