文摘
孤立的干细胞之间的异质性水平使他们更有价值的临床使用。本研究的目的是了解人类间的异质性程度派生间充质干细胞通过牙髓基本细胞生物学和蛋白质组学方法。细胞被孤立的纳塔尔(NDPSCs),一个清新落叶(干细胞从人类剥落了落叶(棚)),和一个影响第三磨牙(DPSCs)牙齿的三种不同的捐赠者。所有三个干细胞显示类似的功能与形态,增殖率、各种细胞表面标记物的表达,和分化潜力进入脂肪细胞,骨细胞和软骨细胞。此外,使用2 de方法加上MALDI-TOF / TOF,生成一个共同2 de概要文件为所有三个干细胞。我们发现%的蛋白质斑点是守恒的三间充质干细胞系。六十一年这些守恒的点被确定MALDI-TOF / TOF分析。分类识别的基于生物功能的蛋白质显示结构重要的蛋白质和蛋白质参与蛋白质折叠机制主要是表达的所有三个干细胞系。这些蛋白质可能在理解人类牙髓的特定属性重要性派生的间充质干细胞。
1。介绍
干细胞是未分化的细胞,可以分裂,分化和自我更新产生新的干细胞在多细胞生物1]。他们可以用于生物医学研究,药物发现,和毒性测试,作为一个模型在理解疾病的治疗的目的,更重要的是再生医学(2]。使用干细胞成功在上述地区,同质干细胞的数量必须隔离,识别和特征。然而,鉴于内部异质性的程度和干细胞系中,同质干细胞种群隔离的似乎是一个具有挑战性的任务(3]。
虽然是一个描述性定义为间充质干细胞(MSC)的范围内异质性和MSC行是压倒性的4]。这将创建一个缺乏广泛的重叠执行的研究与msc。除了遗传背景、方法的推导过程,增长条件下,细胞周期的阶段在样本收集、供体的年龄和性别,捐赠者的疾病状态的可能因素导致异质性的问题(5]。一般来说,描述的msc严重依赖于使用的方法,如免疫荧光显微镜、逆转录PCR,流式细胞术建立干细胞身份和函数。然而,促进干细胞通过细胞表型概要文件定义,基因和蛋白质表达的比较分析研究应该执行。目前没有公认的和常用的细胞表型的干细胞特性。基因表达谱的首选是由于相对容易,但他们有很大区别与生物体的状态和环境的方式不容易解释。签名获得总细胞蛋白质组或细胞表面的蛋白质组分析(“蛋白质条形码”)承诺和蛋白质组学方法可以强大的描述整个蛋白质的干细胞表型不同的细分市场。
msc理解程度的异质性,我们从牙科纳塔尔的果肉分离msc,剥落了落叶,影响第三臼齿的三个不同的捐赠者。孤立的干细胞被培养在相同的生长条件和类似的通道。细胞进行比较的基础上,细胞形态和MSC特定的标记和多能转录因子的表达。此外,端粒酶活性的测量信息进行收集年龄相关的变化和细胞衰老。最后,我们比较了未分化细胞蛋白质表达谱利用2 de凝胶电泳MALDI-TOF / TOF MS / MS分析紧随其后。我们确认了61个蛋白质,主要是表达的所有三个干细胞系。我们相信,这些蛋白质可能在理解人类牙髓的特定属性重要性派生的间充质干细胞。
2。材料和方法
2.1。隔离和msc从人类文化牙科纸浆(Natal,落叶和第三臼齿)
隔离和人类文化派生msc根据协议进行牙髓(其它地方描述的6]。短暂、牙科纸浆脱落落叶及影响第三磨牙收集通过削减在cement-enamel结用消毒牙裂缝的钻头,揭示了髓室。natal牙髓的复苏相比是不同的,难纸浆从成人的牙齿,牙齿被削减在cementoenamel结使用牙裂的钻头打开髓室和分离果肉组织的皇冠和根的挖掘机。natal复苏的牙髓,钳用于骨折牙冠和牙髓成几个部分被发现。每个样本的果肉组织轻轻分开的皇冠和根用无菌挖掘机和胶原酶消化I型生成单个细胞悬浊液。MEM-Earle介质含15%胎牛血清和100国际单位/毫升青霉素- 100μ使用g / mL链霉素和细胞培养在25厘米2塑料组织培养瓶,在37°C的环境在湿润的气氛中含有5%的股份有限公司2。干细胞分离的基础上,坚持文化板块的能力。第三天,红色的血液和其他不依从细胞被移除,介质替换允许进一步增长。贴壁细胞生长至70% confluency被定义为通过零(P0)细胞。后来的段落是相应的标记。0.25% trypsin-EDTA解决方案是用来使分离的细胞板和分离细胞离心,享年2000岁g 10分钟,在一毫升resuspended完全培养基,统计两次使用Thoma计数室,然后镀在75厘米2水瓶(美国BD生物科学)的密度细胞/瓶。生长介质在10-14-day每三天更换一次。
2.2。通过流式细胞仪对msc
确认msc维持他们的表型特征在体外,未分化的细胞受到流式细胞术分析。通过三个后,干细胞收获和resuspended在培养基的浓度为106细胞/毫升。流式细胞术是由使用FACSCalibur(美国BD生物科学)根据Karaoz et al。(2010)6]。数据分析与CellQuest软件(美国BD生物科学)。
Immunophenotyping表征msc与下面的人类抗体抗原进行:CD3, CD4, CD13、CD14、CD29、CD44, CD34, CD45, CD73, CD90、CD106, CD117, CD146 CD166 HLA-DR, HLA-ABC(表1)。抗原的选择是基于MSC定义标准规定Dominici et al。(2006)7]。所有抗体来自BD生物科学。染色50%以上被认为是积极的。
2.3。在体外干细胞分化
诱导分化脂肪形成的3000细胞/厘米2被播种到six-well板块和培养Mesencult MSC基础培养基补充10%脂肪形成的补充(干细胞技术有限公司、加拿大)和1%青霉素和链霉素三个星期。每两天中被刷新。细胞内脂滴指示去经油红O染色。
成骨分化,3000细胞/厘米2被播种到胶原蛋白(I型)涂布cover-slips six-well盘子。每周两次分化培养基的改变。四个星期后,成骨分化进行茜素红染色。
诱导chondrogenic分化、颗粒状micro-mass在1300×g细胞是由离心5分钟然后用chondrogenic培养基培养了两个星期。媒介改变了两次一个星期。球,与4%多聚甲醛固定和嵌入到石蜡沾Haematoxylin-Eosin和红色染料O评估chondrogenic分化。
2.4。测量端粒酶活性
端粒酶活性被传统测量端粒重复扩增协议(陷阱)使用TeloTAGGG PCR-ELISA工具包(罗氏诊断、德国)根据制造商的指示。总之,经过溶解的细胞,三μL上层清液的孵化与预拌缓冲20分钟25°C到显示端粒酶活性,和产品放大biotin-labeled PCR引物。链霉亲和素涂ELISA板被用来量化过氧化物酶的活动除了特定的底物(3、3′,5、5′-tetramethylbenzidine盐酸盐;三甲)和阅读光密度在450海里。计算相对端粒酶活性(等)对控制模板相当于0.001摩尔/μL DNA。
2.5。细胞周期分析
细胞周期决定了流式细胞仪利用BD Cycletest +工具包(美国BD生物科学)后,协议由制造商提供。
2.6。蛋白质的提取和2 de凝胶电泳
蛋白质组分析的概要文件,细胞生长在定义媒体(DMEM、低葡萄糖、丙酮酸、生命科技。Inc .)、美国)。文化开始,相同数量的细胞()被播种到t - 75烧瓶一式三份。当达到70% confluency充足数量的细胞被洗冰冷的清洗缓冲(10毫米Tris-HCl, pH值7.0,250毫米蔗糖)的三倍,从刮板。10分钟后在4°C 2000离心g,过度清洗缓冲提供了250人μL细胞裂解缓冲2 de补液缓冲区(8 M尿素,2 M硫脲,4%的皮套裤,30毫米三pH值8.5和1 x蛋白酶抑制剂的鸡尾酒)添加在每个细胞颗粒。实现完整的细胞溶解,细胞被大力涡1分钟裂解缓冲和包含可溶性蛋白质的上层清液离心获得的分数是20.000g为30分钟在4°C和存储在lobind管(美国埃普多夫)−在液氮snap-frozen后80°C。蛋白质浓度测定用洛瑞与BSA试验标准(美国Bio-Rad)。80年μ克蛋白质被加载到固定化pH梯度带(IPG)(11厘米,pH值5 - 8)(美国Bio-Rad)通过被动补液。基于等电点分离是由使用千变万化的等电聚焦单元使用推荐的条件(美国Bio-Rad)。电压逐步增量程序应用于每一个地带(250 V 20分钟(线性),4000 V为2小时(线性),和10000 V /人力资源(快速))通过千变万化的系统(美国Bio-Rad)。条接受了一个两步平衡平衡缓冲区包含6 M尿素,2% SDS, 0.375米三羟甲基氨基甲烷氯液pH值8.8,20%甘油、2%德勤的第一步和同一个缓冲区没有德勤但碘乙酰胺为第二步(2.5%)。等电点聚焦后,受到sds - page。预制凝胶(美国Bio-Rad标准TGX任何kD)是使用标准Dodeca凝胶运行系统(美国Bio-Rad)减少凝胶凝胶变异。凝胶是沾胶态Coomassie染色(美国KeraFast)和可视化VersaDoc4000议员(美国Bio-Rad)。一个进步(美国Bio-Rad) 2 de分析软件被用于比较的蛋白质发现概要文件。使用自动点检测、参数敏感性(13.8),光斑大小规模(3),和最小峰值强度(258)。
2.7。图像分析和现场切割
的外边缘的图像剪辑相同使用自动化工具的一个推进软件(美国Bio-Rad)。污渍斑点是过滤和标准化领域的凝胶被匹配和扭曲,每个点的数量被总有效点强度归一化。现货数量和总量在规范化区域内测定的自动分析。手动编辑工具被用来检查确定蛋白质斑点检测到该软件。那些容易变异的地方被排除在外,如果他们被目测很难识别。每一个成员选择匹配的蛋白质斑点三间充质干细胞。斑点减少使用自动点刀具,ExQuest现货刀(美国Bio-Rad),并处理成96 -孔板的蛋白质鉴定。
2.8。识别的蛋白质
蛋白质识别实验DEKART科喀艾里大学蛋白质组学实验室(http://kabiproteomics.kocaeli.edu.tr/)通过使用ABSCIEX MALDI-TOF / TOF 5800系统。凝固态胰蛋白酶消化的蛋白质是由使用一个为胶液消化设备制造商按照推荐方案(皮尔斯,美国)。在沉积到MALDI板之前,所有样本脱盐和浓缩10μl按照推荐方案(美国微孔)。肽是一卷1中筛选了μ我使用一个集中的解决方案α-CHCA 50%乙腈和0.1%三氟乙酸在水和MALDI目标板上发现。TOF光谱被记录在正离子反射器模式的质量范围从400年到2000年。每个光谱是200年的累积平均激光枪。胰蛋白酶自体溶解离子峰的光谱被校准m / z(842.510和2211.1046)作为内部标准。十的最强峰TOF光谱/ MS / MS分析样本选择。
所有的搜索及吉祥物version 2.5(矩阵科学)通过使用一个简化的软件,ProteinPilot(美国ABSCIEX),用以下标准:国家生物技术信息中心nonredundant (NCBInr);物种的限制智人;胰蛋白酶酶;至少五个独立肽匹配;最多一个错过的裂解位点;宽容女士将±50 ppm和MS / MS宽容设置为±0.4 Da;固定的修改被carbamidomethyl(半胱氨酸)和变量修改被氧化(满足);肽1 +和单一同位素的收费。定义的重大打击,吉祥物概率分析(),被接受(见补充材料1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2014/457059)。
蛋白质是由分类使用免费的分类系统豹(http://www.pantherdb.org/)以及NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)和Swiss-Prot / TrEMBL注释(http://www.expasy.org/)[8]。
2.9。验证所选的蛋白质免疫印迹分析
相同的蛋白质制剂中使用的细胞2 de凝胶实验用于免疫印迹(WB)验证MALDI-TOF / TOF鉴定蛋白质。蛋白质提取(30μg蛋白为每个车道)与SDS混合样品缓冲(Laemmli解决方案)和他们接受12% SDS - page凝胶。凝胶转移到硝化纤维素膜(0.45μm, Bio-Rad) 30 mA恒流(TurboBlot Bio-Rad)。为了防止非特异性绑定,细胞膜被封锁在室温下1 h在5%脱脂奶粉,1% (v / v)渐变20 TBS(50毫米三,150毫米氯化钠,调整酸碱与HCl 7.6)。一夜之间,阻塞后,膜被孵化与适当稀释4°C多克隆抗体主要在TBS-T Galectin-1(1: 2000年,圣克鲁斯,sc - 28248), DJ-1 (Abcam 1: 1000年,ab - 4150), HNRNPH1(1: 10000年,Abcam ab10374) GAPDH (Abcam 1: 2500年,ab - 9485),和单克隆UCHL-1(1: 5000年,皮尔斯,mai - 46079)。GAPDH是用于每个蛋白质样品,以确保平等正常化装载。三个洗TBS-T后,膜与二次孵化anti-mouse免疫球蛋白合抗体(Bio-Rad)或anti-rabbit免疫球蛋白(Bio-Rad)在室温下1 h。蛋白质是可视化与发射极耦合逻辑+免疫印迹检测系统(通用电气医疗集团)。乐队是量化使用数量一个一维图像分析软件(Bio-Rad)。
2.10。统计分析
流式细胞术、干细胞分化和三个细胞端粒酶活性进行测量通道。任何数据显示一组分析的结果展示在所有类型的细胞。实验复制的数量,技术和生物保持在三。
当有必要的时候,统计分析的数据是由单向方差分析(方差分析),其次是图基的测试多个比较确定的值明显不同。被认为具有统计显著性差异。
3所示。结果
MSC线隔离,整个研究从三个不同的捐赠者。NDPSCs被隔绝的牙齿牙髓属于一个女婴儿出生与一个牙齿。摆脱孤立于牙髓的女性青少年失去了她的一个乳牙在六岁时和DPSCs从牙髓的影响第三臼齿,属于一个27岁的女性。所有三个干细胞系在一定程度上表征。每个干细胞线形态分析显示存在的细胞大,夷为平地,或呈形状(图1(一))。没有值得注意的变化形态和生长特性观察整个段落。与流式细胞术分析常见的MSC标记表明CD13、CD29、CD44, CD73, CD90、CD146, CD166和HLA-ABC表达的所有三个干细胞系(表1)。增殖率通过测量细胞生存能力评估在不同时间点表明NDPSCs增殖率高于棚,DPSCs(图1 (b))。
(一)
(b)
流式细胞仪分析,大多数的干细胞(78%)在细胞周期G1期表明细胞增长的规模和他们的信使rna和蛋白质合成(图2)。在年代和G2阶段的细胞都出现在较低的比率(12%和10%,分别地。);因此细胞进行有丝分裂的数量还不到积极增长的细胞。
年龄相关的端粒缩短由于端粒酶活性损失是干细胞衰老的指标(9- - - - - -11]。我们观察到供体年龄相关的降低端粒酶的活动。最高的端粒酶活性与NDPSCs观察(图3相对比)(被认为是100%)。有端粒酶活性降低30% NDPSCs相比。端粒酶活性观察在DPSCs最低。
测量评估所需的分化潜能是multipotential干细胞的特征。组织化学和免疫荧光方法被用来展示每个细胞系分化潜力成脂肪形成的,成骨,chondrogenic状态。在脂肪形成的分化过程中,脂滴放大和入侵整个细胞质(图4。(a1), (b1), (c1)),而在成骨分化钙沉积显然是被茜素红染色(图4。(a2), (b2), (c2))。Chondrogenic分化特征的圆形细胞的存在,仿佛hyalin软骨细胞。插科打诨的存在被红色染料O染色(图所示4。(a3), (b3)和(c3))。相同的染色过程进行的未分化的干细胞,被当作负染法在补充图2。
比较蛋白质组学分析来识别蛋白质斑点,通常表示牙髓中派生的msc。为此干细胞生长在媒体和蛋白质样本每个MSC类型定义是可溶性和通过使用带组和sds - page分离。胶体Coomassie染色后,解决和可再生的2 de凝胶地图产生了如图5。
(一)
(b)
(c)
平均好每分析凝胶染色斑点检测凝胶时受到自动检测和分析。然而,好看点的数量匹配每个成员是183(主凝胶)的总体平均系数60.8%。其余的地方都是不匹配的所有三个干细胞表达的类型。通过使用一个预先凝胶分析软件,点强度的变化在这些183匹配点进行比较。点上涨或下调2倍以上被认为是受到监管(补充图1),我们发现%的蛋白质斑点是守恒的。率,和表达下调的蛋白质斑点图5。在总体上,分析散射点的情节和保护分数表明NDPSCs细胞蛋白质组更类似于蛋白质组比DPSCs蛋白质组。
进一步描述守恒的蛋白质斑点,斑点从制备凝胶的自动化切割工具和受到凝固态胰蛋白酶消化MALDI-TOF / TOF分析紧随其后。总的来说,61个蛋白质斑点确定(表2)。确定蛋白受到分析基于他们的分子功能和参与生物过程(表3)(图6)。
提供证据证明蛋白质组学分析的结果是可靠的,世行分析选定的蛋白质(图执行7)。同意蛋白质组分析结果表明蛋白质斑点2中的观察到的变化de凝胶是可靠的和真实的。
大部分的识别蛋白质被证明在细胞结构中扮演角色。同时,蛋白质蛋白质折叠机制的一部分。这些蛋白诱导表达了在压力条件下的说法。转录、蛋白质生物合成和降解相关的蛋白质,我们发现指出存在活跃的细胞生长与细胞周期预测实验。氧化还原代谢相关的食腐动物蛋白质,发现可能是一个活跃的细胞生长指标。细胞凋亡的存在、转录、蛋白质生物合成/退化,和能量代谢相关蛋白质的存在表示细胞自我更新和增殖。
4所示。讨论
在当前研究中,我们试图比较multilineage势和蛋白质组的牙髓msc隔离来自牙科三个捐助者的果肉。我们的目的是减少样品的复杂性,将样本数量保持在3。有人可能会认为,使用更多的材料更多的捐助者可能产生更多的科学相关数据。然而,增加捐赠的数量使分析更复杂的每个捐赠者都有不同的代谢状态(年龄、吸烟、肥胖、代谢疾病,种族,性别,和待定/未知条件)。的确,我们最初的试验使用样本的蛋白质组比较多个捐献者生成更多的可变数据和捐赠者数量增加组蛋白质组概要开始偏离。因此,虽然有例子在文献中使用多个样本捐助者(12- - - - - -14),我们更倾向于使用单一捐赠者为每个组。
MSC比较的基础上他们的形态特性,扩散率,表达共同MSC的标记在体外分化潜能进入脂肪细胞,成骨细胞和软骨细胞。端粒酶的活动也测量监控每个细胞的增殖历史类型。最后,蛋白质组分析是由2 de凝胶电泳MALDI-TOF / TOF MS / MS创建一个蛋白质表达模式来帮助与理解的代谢途径之间共享这些msc。为蛋白质组学鉴定实验,更好的控制环境是由使用定义的媒体。
在这项研究中,我们表明,类似的孤立和msc从人类种植牙髓相似的形态,显示抗原表型,分化潜能。这些发现并不不同于以前的研究报告的其他研究[12,15- - - - - -17]。然而,在这项研究中,我们表明,类似的孤立和msc从牙科种植果肉蛋白质组的三个不同的个体进行相当大的变化。最近的一项研究报告了类似的结果在msc的蛋白质组分离牙科组织(卵泡、纸浆和乳头组织)的一位捐赠者(12]。他们报道平均65%的蛋白点匹配比孤立的msc。我们还发现低地方保护成绩即使我们采取一个极端的预防措施在细胞培养和2 de预防实验差异凝胶电泳。预防措施包括以下。(我)干细胞从三个不同的牙科果肉分离干细胞隔离通过使用相同的协议。(2)细胞生长在增长媒体在同样条件下定义。(3)在每个通道之前,细胞被允许增加到70% confluency和相同数量的细胞被用来启动新的文化。(IV)为了防止手手的变化,相同的人员进行隔离,增长,使实验。(V)蛋白质分离和2 de实验也由一组相同的研究人员所作的。(VI)防止凝胶凝胶2 de的变化实验,预制凝胶。 They ran and stained under the same conditions by using Criterion gel running and staining systems under appropriate conditions.
六十一的每一个成员匹配蛋白质斑点被MALDI-TOF / TOF MS / MS。确定蛋白受到分析基于他们的分子功能和参与生物过程。共10组可以形成(图6)。分类识别蛋白质分子功能显示,11日的基础上蛋白质可以作为结构重要的分组。其中,肌动蛋白相关蛋白复合物2/3调节紧密连接和功能建立支肌动蛋白网络(18]。我们所知,这种蛋白质的存在没有被描述在msc。Calponin,薄filament-associated蛋白质与平滑肌收缩的监管和调制,也表达了我们所有的干细胞类型。calponin的表达在人类毛囊干细胞和骨髓衍生干细胞以前报道(19]。Calponin是偶尔用作标记描述平滑肌细胞衍生的干细胞(20.]。Caldesmon是一个肌动蛋白和myosin-binding运动和肌肉收缩蛋白和细胞组成部分[21]。之间存在强相互作用caldesmon和calponin22]。识别caldesmon和calponin干细胞数量可能表明某些神经干细胞”的现象,在我们的文化中可能会致力于血管平滑肌血统。然而,肌动蛋白的表达interactin蛋白质可能是由于众所周知的能动的msc的性质。此外,表达caldesmon和膜联蛋白A1提出是缓慢增长的标志(23]。因为我们的干细胞被定义中他们的增长速度预计将放缓,因此他们可能表示这两个蛋白一个可观的水平。Zyxin alpha-actinin和c反应蛋白结合蛋白,帮助细胞粘附[24),在这项研究中使用的细胞表达Zyxin。Zyxin也决心在hMSCs表达和提出参与细胞矩阵联系(25]。以前,coactosin-like蛋白质是羊水中高度表达派生msc (26]。Coactosin-like蛋白质参与通过结合肌动蛋白细胞骨架组织和运动。Coactosin-like蛋白和肌动蛋白表达都确定在本研究中。
我们已经确定了五个蛋白在氧化还原代谢和解毒作用的细胞。其中,谷胱甘肽S-transferase-P已知从外源性物质的解毒功能细胞,减少癌症易感性。在先前的研究中,谷胱甘肽S-transferase-P是用来区分多功能从骨髓msc孤立27]。观察表达谷胱甘肽S-transferase-P的干细胞可能表明我们的细胞有多功能MSC属性。
增加代的活性氧(ROS)可能与分化过程。沿着这条思路,克莱尔et al。(1994)证明MnSOD的表达在细胞分化成纤维细胞(28]。他们发现MnSOD极大地增强了纤维母细胞分化为成肌细胞。此外,SOD的保护作用是证明在骨髓中干细胞和造血干细胞(29日,30.]。我们也发现SOD表达干细胞。除了SOD外,其他三个蛋白质参与清除ROS在这项研究中发现。这些都是peroxiredoxin-2,硫氧还蛋白domain-containing蛋白质12,thioredoxin-dependent过氧化物还原酶。酶类减少过氧化物减少等价物通过硫氧还蛋白系统提供。蛋白质的表达显示抗氧化活动msc以前公认的(31日]。事实上msc提出了作为一个工具来清除ROS的利基市场,受到氧化应激(32]。我们相信,所有四个我们这里报告从抗氧化剂,保护细胞的酶可能通过减少过氧化物有增殖的影响。
大部分的蛋白质,我们确定了在蛋白质折叠机制的角色。例如,peptidyl-prolyl顺反异构酶(PIN1)加速通过催化蛋白质的折叠顺反异构化的脯氨酸imidic债券寡肽(33]。的作用PIN1牙原性的和脂肪形成的人类衍生出来的牙髓干细胞分化进行了研究[34]。结果表明:PIN1充当一个重要的调制器DPSCs牙原性的和脂肪形成的分化。PIN1也促进生存,提高修复,提高差异化,对抗衰老(35]。PIN1信使rna和蛋白质水平调节时间的方式在人类衍生出来的牙髓干细胞分化脂肪形成的(34]。PIN1可能充当一个重要的调制器派生人类牙髓干细胞和再生医学有着重要的意义。在中村et al .(2012)的一项研究,萧条PIN1表明抑制神经元分化而超表达增强(36]。我们组已经证明人类牙髓干细胞显示更好的神经和上皮干细胞属性(37]。一个明显的作用PIN1被分配在诱导和维持多能性38]。PIN1被描述成为一个不可或缺的因素多能干细胞的自我更新和维护,因为它可以调节Oct4和其他基质通过磷酸化途径的激活。因此,PIN1的存在在我们的干细胞具备干细胞可能与人类衍生出来的牙髓干细胞的性质。
有四个热休克蛋白(60 kDa热休克蛋白,热休克蛋白质同源71 kDa,热休克蛋白beta 1,和78 kDa glucose-regulated蛋白质),我们发现,他们所表达的所有三个干细胞。诱导和本构HSP蛋白质具有协同作用的抵抗代谢变化(39]。蛋白质DJ-1是另一个伴护蛋白质,保护细胞免受氧化应激和细胞死亡。在帕金森病的作用是众所周知的,但它的重要性在干细胞研究尚未研究[40]。UPF0556蛋白质C19orf10 (interleukin-25)是另一个我们发现凝胶的蛋白质。提出了这种蛋白是一种分泌蛋白,激活信号通路参与展开的蛋白质反应(41]。最后一个蛋白质,我们发现,在蛋白质折叠过程中发挥作用是tubulin-specific伴侣参与早期步骤的微管蛋白折叠途径42]。说法的存在或蛋白质,蛋白质折叠机制中扮演的角色可能表明干细胞的努力保存完整。
我们确定几个蛋白在转录和核苷酸代谢中扮演角色。其中,PSPC1很有趣因为paraspeckles在真核细胞的功能仍不清楚。存在paraspeckle蛋白(PSP1α)据报道在人类胚胎干细胞虽然paraspeckles在人类胚胎干细胞的存在只是报道发生在分化(43]。细胞表达了paraspeckle组件,PSP1C,这表明paraspeckle组件不仅表达了人类胚胎干细胞,也表达了人类间充质干细胞及其表达可能不需要一个分化的过程。
百分之二十的确定蛋白质显示绑定活动和五个蛋白质参与钙或钙绑定新陈代谢(蛋白质S100-A6膜联蛋白A1,蛋白质S100-A11 peptidyl-prolyl顺反异构酶,gelsolin)。钙代谢的重要性早已被公认在干细胞。事实上,氢氧化钙显示增加招聘、迁移、增殖和矿化的牙髓中msc (44]。在最近的一项研究中,陈et al。(2013)证明S100A4的影响,另一种钙结合蛋白,在细胞增殖、生存和人类骨肉瘤细胞的分化45]。在最近的一项研究中,提出了SA100A6小说神经干细胞的标志,可能是重要的一代的星形胶质细胞在成年人的海马(46]。膜联蛋白与SA100A6交互,需要中间体形成和胞质分裂的终端阶段完成,在我们的研究中被确定为绑定钙代谢的一部分。
四个细胞凋亡相关蛋白的存在表明,干细胞的自我更新和增殖人口是由诱导细胞凋亡。因此,总是有一个平衡的积极增长的干细胞和干细胞的凋亡。在总体上,干细胞种群的动态特性存在明显的细胞凋亡相关蛋白以及参与蛋白质生物合成的蛋白质/退化,能量代谢、转录。
5。结论
在本研究中我们使用基本细胞生物学和蛋白质组学技术发现蛋白质的异质性及其特征三种干细胞类型之一。显示的细胞形态学相关类似的特性,扩散率,各种细胞表面标记物的表达,分化潜能。此外,使用2 de MALDI-TOF / TOF MS / MS方法,生成的蛋白质组学概要文件。我们主要集中在61年所表达的蛋白质,主要是三种干细胞类型。我们意识到其他在每种细胞的差异表达蛋白也可能是重要的理解特定蛋白质代表三个来自不同年龄组和msc这些蛋白质可能是另一项研究的主题。一些确定的蛋白质在这项研究可能在理解人类牙髓的特定属性重要性派生的间充质干细胞。澄清的相似点和差异蛋白质组的人类牙髓派生的间充质干细胞将有助于更好的理解这些细胞,本研究采取朝着这个方向迈出的一步。
缩写
| DP: | 牙髓中 |
| hNDP: | Natal牙髓派生 |
| 流: | 干细胞从人类清新落叶 |
| msc: | 间充质干细胞 |
| 谱: | 基质辅助激光解吸电离 |
| TOF: | 飞行时间 |
| 白平衡: | 免疫印迹 |
| EDTA: | 乙二胺四乙酸 |
| 三甲: | 3、3′,5、5′-Tetramethylbenzidine盐酸盐 |
| 等: | 相对端粒酶活性 |
| 家伙: | 3 - ((3-Cholamidopropyl) dimethylammonio) 1-propanesulfonate |
| 德勤: | 二硫苏糖醇 |
| IPG: | 固定化pH梯度 |
| 女士: | 质谱分析 |
| sds - page: | 钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳。 |
伦理批准
这项研究是由科喀艾里大学的伦理委员会批准。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
这项研究的总体设计,包括规划、和解释结果的各个方面做的缪拉Kasap Gurler Akpinar,和Erdal Karaoz。Murat Kasap和Gurler Akpinar写和修改论文和设计和飞行时间质谱仪进行了蛋白质组学的实验包括MALDI-TOF / / MS分析。Ayca Aksoy和Erdal Karaoz做了所有的细胞培养实验。Duruksu端粒酶进行测定。Gulcin Gacar进行流式细胞分析仪/ immunophenotyping和细胞周期分析。
补充材料
补充图1为被选中代表蛋白质斑点,受到监管every-member-matching景点之一。补充图2是由图像代表负染法NDPSCs资料,剥离和DPSCs。
