文摘

本研究的目的是确定和比较检查参与组成分泌腺的影响的间充质干细胞(msc)隔绝人类骨髓(bmsc)和静脉和动脉周围的沃顿果冻的脐带(人类脐带血管周的细胞(HUCPVCs))的生存和分化人类神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y)。为此,SH-SY5Y细胞分化与条件媒体(CM)的msc人群之上。视黄酸培养细胞被用作控制神经元分化SH-SY5Y细胞。检查参与组成分泌腺SH-SY5Y细胞生存能力评估显示,bmsc HUCPVCs, CM的形式,能够引发他们的生存。此外,采用实验表明,厘米从msc是SH-SY5Y细胞诱导神经元分化的能力。最后,神经突的长度和定量评估实时逆转录聚合酶链反应(rt - pcr)分析表明,厘米从bmsc HUCPVCs不同诱导神经突神经元标记的结果和mRNA水平表现出由SH-SY5Y细胞。总体而言,我们的研究结果表明,检查参与组成分泌腺的bmsc和HUCPVCs是能够支持SH-SY5Y细胞生存和促进其向神经元分化表型。

1。介绍

中枢神经系统(CNS)神经障碍/损伤治疗常常构成重大挑战由于中枢神经系统的有限能力自我更新和再生1]。这些中枢神经系统特性促使寻找新疗法,如使用间充质干细胞(msc)。msc被定义为多功能细胞,能够自我更新(2]。此外,他们会坚持组织培养瓶和显示msc表面标记的存在(CD105, CD73, CD90),以及缺乏造血msc的细胞表面标记(CD45、CD34、CD14或CD11b CD79a或CD19和人类白细胞抗原DR) (2,3]。当前msc的来源包括骨髓、脂肪组织、牙髓、胎盘、羊水、脐带血,脐带沃顿商学院的果冻、肝、肺、脾(3,4]。

msc孤立从不同来源提出了中枢神经系统相关的应用程序。事实上,msc移植已经证明在缺血的动物模型的治疗效果5,6),脊髓损伤(SCI) (7,8),和帕金森病(PD)9,10]。msc移植的潜在机制介导的有益结果仍有待阐明。尽管公认的msc分化成神经元血统已经定意为中枢神经再生的主要因素在神经退行性疾病的动物模型11- - - - - -15),msc分化成完整功能的神经元血统仍有待澄清(16- - - - - -18]。相比之下,健壮的数据表明,中枢神经系统检查参与组成分泌腺组织恢复效应是由msc,也就是说,生物活性因子和囊泡的面板,与neuroregulatory属性,这些细胞释放到细胞外环境(10,19- - - - - -42]。

例如,我们已经证明,人类检查参与组成分泌腺bmsc促进细胞生存和增加细胞的可行性大鼠产后海马神经元和大脑皮层神经胶质细胞(19]。Nakano检查参与组成分泌腺等人也显示,bmsc的上层清液的培养缺血性脑提取物能增加神经元生存和神经突的产后鼠海马神经元,通过抑制细胞凋亡机制(20.]。这些研究结果与igf - 1的表达和分泌(胰岛素样生长因子1),HGF(肝细胞生长因子),VEGF(血管内皮生长因子),和TGFβ1(转化生长因子β1)的bmsc [20.]。这是进一步证实了其他研究,在培养提取物缺血性和创伤性脑,bmsc改变其基因表达谱与受伤相比控制大脑提取(21,22]。此外,在中描述的功能恢复也显著改善在活的有机体内缺血的模型,在静脉注射bmsc [23- - - - - -25]。在这些研究中,改善神经功能,伴随着减少梗塞大小和/或增加内源性细胞增殖和细胞凋亡的减少。这些神经保护和神经恢复效果因此被归因于bmsc的分泌白细胞介素- 6 (il - 6)的神经营养和抗炎细胞因子,生长因子(GFs)如神经生长因子(神经生长因子),脑源性神经营养因子(BDNF)、神经胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF), VEGF, TGFβ1,IGF - 1,胰岛素样生长因子2 (IGF - 2)、表皮生长因子(EGF)和基本的纤维母细胞生长因子(bFGF)。

中也发现了类似的结果在体外(26- - - - - -29日),在活的有机体内(30.- - - - - -32脊髓损伤模型。例如,Fuhrman et al。28和顾et al。29日)报道,coculture bmsc的背根神经节(DRG)外植体和神经元显著增强神经细胞生存和神经突产物,通过分泌神经生长因子、脑源性神经营养因子,bFGF,并据(纤毛神经营养因子),HGF, SDF-1(基质细胞衍生因子1),VEGF, EGF, NT-3 (neurotrophin-3),并请GFs(生成4),以及il - 1 (interleukin-1)、il - 6,引发(interleukin-8)细胞因子。这个表达式模式是按照公布的数据被别人在bmsc移植动物模型的SCI (30.- - - - - -32]。另一方面,一些作者也报道,bmsc的BDNF的表达,GDNF, EGF, bFGF, VEGF, HGF, SDF-1, NT-3可能与多巴胺能神经元(DAergic)防止6-hydroxydopamine (6-OHDA)神经毒素在体外和在活的有机体内PD模型(33- - - - - -35]。

同样,检查参与组成分泌腺的msc孤立的脐带沃顿的果冻的(WJ-MSCs)为中枢神经系统再生医学还透露了一些有趣的属性。例如,里贝罗et al。36)和弗拉格et al。37检查参与组成分泌腺)显示,分离的间叶细胞祖细胞从脐带沃顿的果冻的神经细胞生存能力和细胞密度增加。这些效应是由于神经生长因子的表达和检查参与组成分泌腺的水泡分数,分别含有蛋白质通常参与神经保护。几项研究也显示,神经保护的表达,神经源性,以及血管生成GFs生长-细胞因子,如BDNF, GDNF, bFGF, g - csf(粒细胞集落刺激因子),SDF-1, PDGF-AA血小板源生长因子(AA), angiopoietin-2, VEGF受体3 (VEGF-R3) CXCL-16(趋化因子配体16),和NAP-2 (neutrophil-activating protein-2),可能与WJ-MSCs有益的结果对缺血性中风的老鼠(38- - - - - -40]。另一方面,杨et al。41和胡锦涛et al。42)与运动功能的改善,神经保护,和轴突再生在老鼠SCI模型NT-3 WJ-MSCs分泌,GDNF, bFGF, VEGF-R3, NAP-52 (neutrophil-activating protein-52),和GITR(激素性肿瘤坏死因子受体)。最后,维斯et al。10)表明,WJ-MSCs移植可以改善hemi-Parkinsonian鼠模型的条件通过分泌GDNF、FGF 20(纤维母细胞生长因子20)DAergic营养因素。

尽管这些研究很少有报道,msc的检查参与组成分泌腺的影响,从不同来源分离,在神经细胞群直接比较。因此,在本研究旨在确定检查参与组成分泌腺的程度上从骨髓msc孤立和脐带血管周围结缔组织影响人类的生存和分化成神经细胞瘤细胞系。我们的结果表明,检查参与组成分泌腺的bmsc HUCPVCs, CM的形式,可以本身诱导SH-SY5Y细胞生存、分化成neuron-like细胞和神经突结果。此外,检查参与组成分泌腺的bmsc HUCPVCs,收集在不同的时间点,能够增加SH-SY5Y神经元分化的程度随着维甲酸(RA),通常用于区分SH-SY5Y细胞(43]。最后,厘米从bmsc HUCPVCs显示不同的时间配置文件关于刺激神经突和神经元标记的基因表达产物表现出由SH-SY5Y细胞。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

2.1.1。骨髓组织中干细胞

bmsc是从PROMOCELL收购(德国海德堡)。细胞解冻和扩展根据协议之前所描述的席尔瓦et al。44]。短暂,综合培养αmem(美国纽约GIBCO,大岛)和碳酸氢钠(NaHCO补充₃美国默克公司),10%的胎牛血清(的边后卫,BIOCHROM AG),英国),和1%的penicillin-streptomycin抗生素(GIBCO)。融合性的细胞trypsinised,镀在新T75组织培养烧瓶(NUNC、丹麦),血压得到较好的控制细胞密度为4.000 /厘米²在37°C,孵化湿润有限公司5%₂的气氛。培养基是改变每两到三天。通道6 bmsc被用于实验(P6)。

2.1.2。人类脐带血管周的细胞

HUCPVCs成员去教授j·e·戴维斯(加拿大多伦多大学)。细胞隔离从脐带执行根据Sarugaser和同事所描述的程序(45]。扩张的细胞进行bmsc根据上述协议。在P6 HUCPVCs被用于实验。

2.1.3。人类神经母细胞瘤细胞系

SH-SY5Y后细胞培养方法之前发表的洛佩斯et al。46]。短暂,细胞被解冻,生长在T75烧瓶(NUNC)包含杜尔贝科的血压得到较好的控制修改鹰培养基营养混合物F12 (LABCLINICS DMEM / F-12 PAA, M,西班牙),添加1%的glutamax (GIBCO)的边后卫(BIOCHROM AG)的10%,和1%的硫酸卡那霉素(GIBCO)。融合性的细胞使胰蛋白酶化镀和细胞密度为42.105 /厘米²在13毫米玻璃盖玻片,双预镀与poly-D-lysine (SIGMA-ALDRICH,圣路易斯,密苏里州,美国)和猪皮明胶(SIGMA-ALDRICH),插入24-well板块(NUNC)细胞代谢活力,采用免疫,神经突化验产物。分析SH-SY5Y关于几个神经元细胞的基因表达标记,细胞被镀在6-well板块(NUNC)细胞密度为42.105 /厘米²。之后,细胞被孵化与上述相同的介质湿润有限公司5%₂大气在37°C 24 h后,媒体被改变,实验进行如下所述。SH-SY5Y细胞用于实验章节11至15。

2.1.4。条件媒体收集和实验

CM收集从P6 bmsc HUCPVCs之前报道的弗拉格et al。37]。不久,细胞被镀的密度4.000细胞/厘米²并允许增长5%湿润3天有限公司₂气氛在37°C。培养基是然后重新收集24小时和96小时之后(细胞培养没有更新或添加在这个时间段)。收集厘米冻结和解冻只有当天的实验。CM收集、DMEM / F-12媒体补充glutamax的1%和1%的硫酸卡那霉素。

分化化验,SH-SY5Y细胞孵化bmsc HUCPVCs厘米和各自的积极控制神经元分化(SH-SY5Y细胞培养与DMEM / F-12 (PAA LABCLINICS)补充1%的glutamax (GIBCO)的边后卫(BIOCHROM AG)的1%,1%的硫酸卡那霉素(GIBCO)和10μRA (SIGMA-ALDRICH) M)。额外的组,SH-SY5Y增殖/未分化的细胞,也是进行(见补充资料在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2014/438352)。培养基是改变了7天,每天最后的细胞代谢活力,分化和神经突结果进行评估与其他实验条件。

2.2。细胞生存能力评估

细胞代谢活力被MTS试验评估。5-dimethylthiazol-2-yl MTS [3 - (4) 5 - (3-carboxymethoxyphenyl) 2 - (4-sulfophenyl) 2 h-tetrazolium]测试(美国WI PROMEGA,麦迪逊)是细胞生存能力分析基于衬底(MTS)的bioreduction布朗甲瓒产品。细胞培养盖玻片(复制)被设置在培养基含有MTS 5: 1比和37°C和5%湿润孵化有限公司₂的气氛。三个小时后孵化,100年μL(每个样本都被转移到96孔板(复制)和光学密度(OD)测定490海里。

2.3。免疫细胞化学

在双预镀盖玻片(细胞培养 )、固定有4%多聚甲醛(美国默克公司),在室温下和孵化30分钟(RT)。孵化后,细胞被孵化permeabilised 0.3% triton - 100(默克公司)/ PBS 1 x (GIBCO)。膜受体被封锁了60分钟(RT)的边后卫(BIOCHROM AG) / PBS为10%。之后,细胞被孵化(60分钟)用鼠标anti-rat microtubule-associated蛋白2 (MAP-2)抗体(SIGMA-ALDRICH)检测成熟SH-SY5Y神经元。细胞被洗过之后有0.5%的边后卫/ PBS溶液和孵化60分钟(RT) Alexa萤石488山羊anti-mouse免疫球蛋白g .最后,样本孵化与DAPI 5分钟(4′,6-diamidino-2-phenylindole盐酸盐),染色细胞细胞核(美国罗克福德热科学),和一个奥林巴斯ix - 81荧光显微镜下观察(奥林巴斯,德国)。

2.4。细胞计数

细胞计数,5代表领域每个盖玻片的条件(选择复制)20 x放大和分析使用Cell-P软件(奥林巴斯,德国)。此外,根据文献,MAP-2阳性细胞与一个或多个被算作分化细胞(神经突47]。

2.5。评估神经突的长度

神经突的长度评估在SH-SY5Y neuron-like细胞,多个代表字段的细胞形态学沾MAP-2标签与一个ix - 81奥林巴斯荧光显微镜拍摄(奥林巴斯、德国)安装在dp - 711数码相机(奥林巴斯,德国)。捕获的图像被贴上规模根据记者显微镜放大(40 x)。图像规模用于像素单位转换成微米(μ米),使用为此NIH图像J (Rasband WS、图像J, NIH) 1.41版。此外,渠道提取灰度和神经突的长度5到10场跟踪和测量,此后,末端的神经元生长锥,使用国家卫生研究院的神经突示踪插件形象(48,49]。

2.6。实时定量rt - pcr

总细胞核糖核酸(RNA)提取SH-SY5Y分化细胞与RA或msc厘米(复制),使用试剂盒试剂(美国应用生物系统公司,生活技术,CA)细胞裂解和氯仿(默克公司)/异丙醇(热科学)RNA隔离。RNA提取的数量及其纯度测定通过测量在260 nm和280 nm OD nd - 1000分光光度计(ALFAGENE, PT)。RNA是核糖核酸酶处理(核糖核酸酶)免费desoxirribonuclease (DNAse,热科学)和1μg总RNA的使用上标reverse-transcribed工具包(BIO-RAD、钙、美国)获得互补脱氧核糖核酸(互补)。在获得cDNA、1μ克cDNA /定量实时PCR反应是放大的CFX96检测系统(BIO-RAD)通过SSOfast Evagreen supermix (BIO-RAD)和引物序列(1的浓度μ米)前所述,使用一个退火温度60°C (50]。每一个整除的cDNA受到40 PCR扩增循环(94°C 20年代,引物退火60°C 30年代,扩展为40年代在72°C)。引物序列使用对应于多个基因,即synaptophysin,β三世微管蛋白、MAP-2 DRD2(多巴胺受体D2)和DAT(多巴胺转运体)。神经元标记的表达水平是决定之前报道(51]。

2.7。统计分析

统计评估使用单向方差分析其次是执行Bonferroni的事后测试来评估视黄acid-differentiated细胞之间的统计相关性(RA-differentiated细胞)和条件媒体集团(每个样本的统计评估,3复制被用来执行MTS试验和rt - pcr,而五个复制被用来评估采用免疫和神经突结果数据(/;时间点RA-differentiated细胞/厘米±SEM))。这些统计测试与学生的补充- - - - - -测试以确定之间的统计相关性RA和条件媒体集团(/;RA-differentiated细胞/厘米之间的时间点±SEM)或条件对应于同一时间点(媒体集团/;CM时间点±SEM)。被定义为统计意义95%的置信区间。

3所示。结果与讨论

在目前的研究中我们检查参与组成分泌腺旨在确定和比较两个msc人口,来源于骨髓或沃顿果冻脐带血管周围,会影响人类的生存能力和神经元分化神经母细胞瘤细胞系。为此,SH-SY5Y细胞孵化的组合低比例的边后卫和RA的治疗被用作积极控制SH-SY5Y细胞分化(RA-differentiated细胞)。结果显示,细胞孵化bmsc和HUCPVCs厘米有类似水平的代谢活力文化(图7天后1)。然而,值显著降低()比获得控制样本。这些差异在预期的控制文化孵化了的边后卫的1%,这可以增加他们的代谢能力。值得注意的是,SH-SY5Y细胞无法生存超过5天在体外文化在孵化平原neurobasal媒体,没有添加任何其他补充剂(CM控制;数据未显示)。这一事实是一个很强的指标,本身检查参与组成分泌腺,msc的人群能够支持neuronal-like细胞生存能力,不使用其他任何外源性生长因子。

这个初始细胞可行性分析后,分析SH-SY5Y细胞分化的孵化与bmsc / HUCPVCs厘米或RA是由确定细胞阳性神经元的百分比标记MAP-2,显示一个或多个探明(图2)。这一标准建立了根据之前所描述的encina et al。47]。结果显示,所有CM孵化组相比有相似的分化SH-SY5Y细胞的百分比的积极控制细胞分化(RA-differentiated细胞,)(图2和数字3(一个)来3 (e))。这种效应更加明显的bmsc厘米24 h(图2和图3 (b))。因此,从获得的数据,它是可能的状态检查参与组成分泌腺的bmsc和HUCPVCs诱导SH-SY5Y神经细胞分化的能力。

为了进一步理解厘米的角色HUCPVCs和bmsc SH-SY5Y神经元分化,神经突的长度的定量分析(图进行4)。因为它可以观察到,24小时以及HUCPVCs bmsc厘米厘米24 h和96 h了非常相似的结果的RA-differentiated细胞组()(图4和数字5(一个)来5 (c)和5 (e)),这是一个强大的指标检查参与组成分泌腺的分化影响的bmsc和HUCPVCs。最后,减少意味着神经突长度bmsc厘米96 h组中观察到()(图4和数字5(一个)和5 (d))可能与神经营养因子的半衰期在CM的点集合(19,36,37]。

确认SH-SY5Y细胞向神经元分化表型,七天后孵化与CM bmsc, HUCVCs mRNA表达多个神经元的特定的标记被定量rt - pcr进行评估。根据文献,mRNA水平的多巴胺转运体和D2受体水平的囊泡蛋白(如synaptophysin),神经元的特定的细胞骨架蛋白(如MAP-2),和球状蛋白质(例如,β三世微管蛋白)被发现增加SH-SY5Y细胞在分化与RA (50,52]。它可以观察到,如图6,DRD2的mRNA水平显著增加SH-SY5Y细胞分化与bmsc厘米24小时相比RA-differentiated细胞()。同样,DRD2基因表达显著升高SH-SY5Y细胞分化与bmsc厘米96 h相比RA-differentiated细胞()。另一方面,所有的神经元标记研究,SH-SY5Y细胞基因表达没有明显的统计学差异被发现之间HUCPVCs CM 24 h和RA组()。有趣的是,SH-SY5Y细胞分化与HUCPVCs厘米96 h导致显著增加多巴胺- d2和DAT基因表达与RA-differentiated相比细胞(,)。像巴克只有DAergic神经元基因表达(53),这个结果表明,GFs在HUCPVCs厘米96 h可能诱导向DAergic SH-SY5Y细胞表型。事实上,据报道,SH-SY5Y细胞分化成胆碱能、肾上腺素、或DAergic表型取决于媒体条件(52]。此外,不同SH-SY5Y细胞表达模式观察HUCPVCs厘米24 h和HUCPVCs 96 h之间进一步的假设不同时间的CM收集SH-SY5Y细胞分化有着截然不同的影响。对于所有其他神经元标记研究,没有发现显著差异在不同测试CM条件和RA组()。这些结果进一步加强检查参与组成分泌腺的bmsc和HUCPVCs诱发神经元SH-SY5Y细胞的分化。rt - pcr结果还显示关于DRD2和DAT基因的mRNA水平分歧bmsc HUCPVCs,同时收集点(96 h)。事实上,SH-SY5Y细胞分化与HUCPVCs厘米96 h方面表现出显著的DAT和DRD2基因的表达比细胞分化与bmsc厘米96 h (,)。后结果表明不仅检查参与组成分泌腺的不同成分的不同组织派生msc诱导SH-SY5Y细胞分化成不同的神经细胞表型也检查参与组成分泌腺的影响由神经元分化的msc与时间相关的CM系列(19,36,37]。

4所示。结论

目前的研究表明,检查参与组成分泌腺的bmsc和HUCPVCs是能够支持SH-SY5Y细胞生存,同时促进其向神经元分化表型。此外,检查参与组成分泌腺也观察到,收集来自msc人口可能诱发SH-SY5Y细胞分化成不同的神经细胞表型,这是一个指示器检查参与组成分泌腺内的可能差异的两个细胞群。因此,未来的研究应该不仅提供完整描述的因素由msc分泌源自不同的微环境/来源也评估的影响不同的时间去检查参与组成分泌腺的收集可以容纳不同的中枢神经系统病理/伤害。此外细胞的影响使检查参与组成分泌腺msc还应该评估。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者要感谢基金会张de Gulbenkian基金由安东尼奥·j·萨尔加多,葡萄牙科学的基础科学和技术(FCT)博士奖学金归因于安娜o·皮雷(参考:SFRH / BD / 33900/2009),如果开发格兰特安东尼奥·j·萨尔加多。他们也要感谢教授j·e·戴维斯(加拿大多伦多大学)教授帕特里夏·马舍尔(葡萄牙米尼奥大学)请提供HUCPVCs和SH-SY5Y细胞,分别。最后,作者要感谢法比奥·罗德里格斯的贡献,努诺·席尔瓦,你们俩萨米,维拉·卡多佐这项工作。

补充材料