文摘

囊胚注入和桑椹胚聚合一般用来评估基于嵌合干细胞多能性干细胞的贡献。评估从干细胞生成嵌合体的协议,为小鼠胚胎被注射或cocultured小鼠胚胎干细胞和诱导多能干细胞,分别。虽然明显高于嵌合体率导致囊胚注入,注入引起生殖系贡献最高的8芯与胚胎干细胞的胚胎。完全刺颜色嵌合体生成注入和coculture为胚胎的胚胎干细胞。此外,微卫星DNA检测表明,完全刺颜色嵌合体完全胚胎干细胞衍生的老鼠。与胚胎干细胞不同,鼠标嵌合体只产生注入胚胎诱导多能干细胞和为这些显示生殖系的传播。结果表明,注入为胚胎干细胞多能性是最有效的方法来评估和生成诱导多功能干细胞嵌合体,胚胎干细胞与生殖系嵌合体传输,充分老鼠胚胎干细胞衍生的老鼠。

1。介绍

嵌合小鼠是研究胚胎发育的重要工具,他们可以提供洞察特定基因的功能,他们可以跟踪细胞谱系的起源,和他们可以评估潜在的细胞。第一个嵌合体小鼠是1961年出版的1通过两个为胚胎的聚合)。在以后的岁月中,分离内细胞群细胞的嵌合小鼠由显微镜下注射(icm)胚泡的空腔2]。从那时起,技术和协议已经修改和改进3- - - - - -6]这样嵌合小鼠产生成功使用胚胎聚合或注射ICM细胞(2细胞,胚胎性癌(ECCs) (7ESCs),胚胎干细胞()(8),胚胎生殖细胞(EGCs) [9),体细胞核transfer-derived胚胎干细胞(ntESCs) [10),诱导多能干细胞(万能)11,12(精原细胞)[],精原干细胞13,14),胚胎外的内胚层细胞(XEN) (15),和外胚层干细胞(EpiSCs) [16,17]。嵌合体是细胞的混合物的供体细胞和受体胚胎。因为它是极难确定供体细胞嵌合的贡献特别是组织,嵌合体通常通过外套颜色识别。

传统注入ESCs的胚泡是最受欢迎的方法产生嵌合体和部分来源于ESCs生成。好三明治聚合也是一个高度稳定的和可再生的生殖系传播嵌合体的生成方法,但需要两个胚胎的影响过程6,18]。尽管显微镜下注射也会产生良好的传播生殖系嵌合体,专用设备是必要的。由于这些原因,coculture方法开发产生嵌合体小鼠(3,4,19]虽然效率远低于显微镜下注射和三明治聚合技术。然而,一种改进的方法产生嵌合体与高度的嵌合和生殖系传输利用coculture埃普多夫管裸露的小鼠胚胎,胚胎干细胞的报道(20.]。这种聚集在埃普多夫管可导致胚胎粘附,形成2 -或3-embryo集群ESCs混合。

最近,为阶段胚胎用于生成完全ESC-derived老鼠在激光- (21)和piezo-assisted精密控制系统(22]。作者认为这个方法是有效的为天生的ES细胞,如C57BL / 6和129年和混合的ESCs生成完全ESC-derived老鼠;因此,F0-generation老鼠立即启用表现型(22]。ESCs可以坚持卵裂球,迁移到ICM在显微镜下注射或聚合。然而,ESC在嵌合体胚胎迁移的机理尚不清楚(23- - - - - -25)以及他们如何可以完全取代胚胎的ICM和发展成一个ESC-derived鼠标要求调查。因此,在目前的研究中,我们评估ESC发展潜力和协议为嵌合体代生产完全ESC-derived老鼠。虽然公认的ESCs作为多能干细胞,我们还测试了万能的嵌合贡献嵌合体生成由显微镜下注射和coculture well-of-the-well(哇)系统。

2。材料和方法

2.1。材料
2.1.1。动物

公里白化病老鼠从至关重要的河流(中国,北京)购买被安置在20 - 24°C 12 h的光和12 h的黑暗。所有的实验都是根据监管指南进行实验动物经国务院批准的中国。

2.1.2。试剂

所有使用的化学品都购自Sigma-Aldrich(美国),除非另有说明。马绒毛膜促性腺激素(eCG)和人类绒毛膜促性腺激素(hCG)从宁波三盛制药有限公司购买中国有限公司。

2.2。方法
2.2.1。ESCs和万能的文化

小鼠ESC线路隔离从3.5天囊胚的发展来源于129 / Sv雌性交配Oct4-ΔPE-GFP转基因雄性所描述(6,26]。转基因绿色荧光蛋白(GFP)报告基因表达的是Oct4启动子的控制下,远端增强剂,而近端增强地区被删除。这GFP转基因囊胚ICM的显示表达式,包括体内,和的ESCs27]。ESCs保持在淘汰赛杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM Gibco)含15%胎牛血清(的边后卫,Gibco), GlutaMAX 2毫米,0.1毫米2-mercaptoethanol (Gibco), 1% penicillin-streptomycin (Gibco), 1% MEM不必要的氨基酸(Gibco),和1000 U /毫升白血病抑制因子(生活,ProSpec)丝裂霉素C-treated小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)馈线细胞。

鼠标则来自Rex1-GFP鼠标mef (129 xmf1) (28由PiggyBac转座子携带]重新编程Oct4,Sox2,Klf4,cMyc重组载体(29日]。则保持在淘汰赛DMEM (Gibco)包含15%的边后卫(Gibco), GlutaMAX 2毫米,0.1毫米2-mercaptoethanol (Gibco), 1% penicillin-streptomycin (Gibco), 1% MEM不必要的氨基酸(Gibco),和1000 U /毫升的生活(ProSpec)丝裂霉素C-treated停止给料机细胞。

鼠标的ESCs和万能被冻结的边后卫+ 10%二甲亚砜(DMSO)。为细胞注入和聚合,解冻细胞培养没有馈线0.1% gelatin-treated 12-well细胞培养板(康宁)和4天内使用。在实验之前,细胞使胰蛋白酶化0.025% trypsin-EDTA (Gibco)和resuspended ESC-maintaining媒介。

2.2.2。小鼠胚胎的集合

公里白化雌性小鼠超数排卵6 - 8周岁5 IU心电图和腹腔注射5于17:00 IU hCG, 48 h。hCG注射的时候,女性被公里的雄性交配。阴道检查插头是第二天早上的时候被定义为0.5天邮报coitum (dpc)。女性阴道栓被颈椎脱位在2.5和3.5 dpc的集合,分别为胚胎和胚泡。输卵管或子宫切除后,转移到核自组织映射聚类(20毫米HEPES-buffered氯化钾氯化钠95毫米,2.5毫米,0.35毫米KH2阿宝4,0.2毫米MgSO4h·72啊,0.2毫米葡萄糖,NaHCO 10毫米Na-lactate, 4毫米3,Na丙酮酸0.2毫米,1.71毫米CaCl·2 h2谷氨酰胺啊,1.0毫米,0.01毫米Na2EDTA·2 h2啊,和1%青霉素和链霉素)30.)补充3.0毫克/毫升牛血清白蛋白(BSA)在35毫米培养皿(康宁)。然后他们被刷新,细孔针连接到1毫升注射器(6]。为胚胎被检索和培养4菜(Nunc)表示修改NaHCO 25毫米3BSA和补充1.0毫克/毫升,MEM不必要的氨基酸(Gibco), 0.5%, 0.5%,必需氨基酸(Gibco)在37°C在湿润的气氛中含5%股份有限公司2在随后用于实验。胚泡立即使用了ESC注入。

2.2.3。代的老鼠注射嵌合体胚胎的ESCs和万能的

大约10 - 15细胞被吸进注入吸管,轻轻注入囊胚腔腔使用piezo-assisted显微操纵器附加到一个倒置显微镜(22,31日]。注入的胚胎培养,使reexpansion囊胚腔的腔,然后转移到pseudopregnant KM小鼠的子宫dpc (2.56]。

以类似的方式注入胚泡,为胚胎注射细胞仔细放置到透明带卵周空间。一夜之间注入胚胎培养;胚泡的发达都被转移到子宫pseudopregnant KM小鼠在2.5 dpc (6]。嵌合体经外套颜色模式的幼崽出生。

2.2.4。代鼠嵌合体的Coculture为胚胎的ESCs和万能

在透明带被从胚胎为短暂的接触Tyrode的解决方案。裸露的胚胎是核自组织映射聚类,然后用HEPES-buffered洗转入4核自组织映射聚类的菜哇系统(32]。大约100个细胞的选择和转移到每个系统coculture胚胎在一夜之间。由此产生的胚泡被转移到pseudopregnant KM小鼠的子宫dpc (2.56]。再次,嵌合体是被外套幼仔出生时的颜色。

2.2.5。胚胎移植

胚胎移植接受者被配对准备一夜之间成熟公里和vasectomized公里雄性雌性老鼠。阴道栓检查第二天早上和插入小鼠作为pseudopregnant胚胎移植接受者。他们被三溴乙醇腹腔注射麻醉(0.3毫克/克体重),10 - 15胚泡被转移到每子宫角。

2.2.6款。微卫星DNA分析的完全ESC-Derived老鼠

嵌合幼崽最初确认的外套颜色和微卫星DNA分析的完整agouti-coated老鼠选择(33]。从鼠标的微卫星标记引物序列得到基因组信息学网站(杰克逊实验室,http://www.informatics.jax.org)[34,35)(表1)。基因组DNA提取的尾巴活检恢复从嵌合小鼠和接受者和捐助的ESCs使用DNeasy血液和组织工具包(试剂盒)。放大了微卫星dna聚合酶链反应(PCR)使用一个输入微卫星PCR试剂盒(试剂盒)。在25个PCR反应进行μL卷包含1μg DNA, 10μ12.5 mol / L引物,μL双力量掌握混合。放大了96 -微量滴定板和PCR条件在94°C 30 - 60秒初始化:批准周期的变性在94°C 30 - 60秒,退火55°C 30 - 60秒,1分钟和扩展在72°C,紧随其后的是最后一个在72°C扩展步骤5 - 10分钟(表1)。PCR产品稀释(1:1)加载缓冲区、12%聚丙烯酰胺凝胶电泳150 V为4小时(36]。由此产生的凝胶被银染色、扫描和拍照37]。短暂,凝胶固定和染色5分钟在溶液中含有5%的酒精,HNO 1%3,0.1% AgNO3然后洗水。DNA债券为8分钟在开发人员开发包含1.3%氢氧化钠,纳科的0.65%3,0.4%的甲醛。发展就停在添加5%的乙醇与1%的HNO 1分钟3。水凝胶是存储在摄影。

表1
对微卫星标记引物序列具体。
2.2.7。传输筛选鼠标嵌合体

一些嵌合体和完全ESC-derived老鼠选择和KM小鼠交配。ESCs的生殖系的传播能力,则是由外套颜色产生的F1幼崽。

2.3。统计分析

数据表示为百分数进行了分析使用卡方测试(http://statpages.org/ctab2x2.html)。一个 两组之间的值小于0.05被认为是在同一列,指示意义。

3所示。结果

3.1。代的鼠标使用的ESCs嵌合体

当的ESCs通道-用于嵌合体生产(图1),29.1%(25/86),18.1%(23/127)和38.4%(28/73)的小狗来自,分别为胚胎coculture(图2),为胚胎注射(数字3(一个)和3 (b)),和囊胚注入显示外套颜色嵌合(表2)。嵌合率从囊胚注入显著高于8芯胚胎注射,但没有显著差异为胚胎注入和8芯胚胎coculture组。三个25(12.0%)和一个23(4.3%)全彩嵌合体是由8芯注射胚胎和8芯coculture,分别(图3 (c))。没有全彩嵌合体是由囊胚注入。

表2
代的ESCs嵌合体小鼠。
(一)
(一)
(b)
(b)
图1
ESC和iPSC文化没有馈线细胞。ES细胞培养在解冻后第三天:亮视场(a)和GFP荧光(b)。
(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图2
代的老鼠胚胎coculture为嵌合体的ESCs。桑椹胚由ESC coculture((一)明亮的领域;(b) GFP荧光);ESCs的箭头表明,聚合到接收者的胚胎。胚泡发达的ESC coculture哇系统(c)明亮的领域;(d) GFP荧光)。ESCs的箭头显示的ICM聚合到接受者的胚胎。
(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图3
代的老鼠注射嵌合体的ESCs的8芯的胚胎。胚泡由ES细胞注入((a)明亮的领域;(b) GFP荧光)。ESCs的白色箭头表明,聚合成囊胚ICM。嵌合小鼠所产生的注入的ESCs为胚胎(c),黑色箭头显示了完整的agouti-colored嵌合体小鼠。
3.2。代的鼠标使用万能嵌合体

嵌合幼崽(13.8%,8/58)生产只有万能的注入通道为胚胎(图10 - 124),尽管nonchimeric幼崽在8芯coculture产生和囊胚注射组(表3)。大多数iPSC嵌合体是肥沃的女性KM小鼠交配时,虽然没有产生生殖系传输嵌合体。

表3
代的嵌合小鼠使用万能。
(一)
(一)
(b)
(b)
图4
代的老鼠则iPS的嵌合体。细胞培养在解冻后第三天(a)。嵌合小鼠所产生的注入和(b)的细胞则为胚胎。黑色箭头显示了嵌合小鼠与彩色的外套。
3.3。微卫星DNA分析的完全ESC-Derived老鼠

整整三agouti-colored嵌合体是微卫星dna扫描来确定他们是否完全ESC-derived老鼠。这表明,所有3老鼠完全来源于ESCs,但不是从KM小鼠胚胎(图5)。


图5
微卫星DNA分析的完全ESC-derived老鼠。微卫星dna从培养ESCs三嵌合小鼠(C1, C2, C3)和公里鼠标接受者被放大。微卫星位点D2Mit296、D3Mit51 D11Mit20、D13Mit88 D16Mit139, D19Mit10所示。
3.4。生殖系鼠嵌合体来源于ESCs的传播

最高的观察生殖系的ESCs的贡献为胚胎注射组(69.2%,9/13)。而coculture为45.5%(5/11)和8.3%(1/12)为囊胚注射组,分别为(表4)。没有观察到显著差异的百分比中肥沃的嵌合体胚胎coculture为(78.6%,11/14),为胚胎注射(86.7%,13/15),和囊胚注入(92.3%,12/13)组(表3)。然而,没有由万能干细胞产生生殖系嵌合体。生殖系嵌合体的传播被小狗的颜色评估。结果表明,外套颜色的百分比来自ESCs并非生殖系的传播预测(图6)。

表4
从的ESCs Germline-transmitting嵌合体制作。
(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图6
生殖系鼠嵌合体来源于ESCs的传播。部分完全(a)、(b)和(c)传播生殖系嵌合体小鼠的颜色显示他们的幼崽。

4所示。讨论

多能性的多能性基因的表达,免疫细胞化学标记,胚状体形成在体外,和畸胎瘤的形成在活的有机体内通常用来测试的多能性干细胞(38,39]。更重要的是,然而,他们的多能性是最好的评估基于细胞的嵌合体根据他们的贡献。囊胚注入和桑椹胚聚合的方法是选择生成干细胞嵌合体(3,6,40]。我们的结果是类似于其他发表的报告;传播更多的生殖系嵌合体的ESCs的同一批次的生产为胚胎注射比囊胚注射在我们的实验中,尽管后者(产生更多的幼崽41,42]。注入是身体要求更高的8细胞胚胎囊胚注入由于体积小的卵周空间增加的机会伤害胚胎的卵裂球在注射过程中。此外,在压实过程的开始鼠标为胚胎可能被注入的ESC。因此,ICM和滋养外胚层不能分化成正常细胞类型在正确的时间,从而导致失去幼崽。这表明压实的老鼠胚胎为其进一步发展是很重要的(43ESCs], coculture为胚胎和更理想的生成传递的ESCs的嵌合体。我们得出这样的结论:聚合修改coculture哇是更方便和有效的方法来生成ESC嵌合体,甚至完全ESC-derived小鼠胚泡的价格相比,为胚胎注射(22,44]。

ESC嵌合体生成8芯注射胚胎,胚胎囊胚注入,为coculture在这项研究中。然而,iPSC嵌合体可以生成只有8芯胚胎注射,虽然产生的iPSC嵌合体是生殖系传播。有趣的是,植入结节时观察胚胎来自8芯与细胞则被转移到受体小鼠胚胎cocultured但是这些植入的部分表明,胎儿已经取代了肿瘤的细胞(数据未显示)。因此,我们则认为,因其致肿瘤性、开车ICM细胞进入肿瘤而非胚胎的形成。iPSC嵌合体可以生成注射的胚胎,因为更少的细胞则为注入卵周空间,与胚胎coculture为8的情况。这里,几则由ICM诱导细胞随后发展成正常胚胎。这些结果表明,万能的贡献在嵌合体并不对应于他们的完整的多能性潜力(45]。

我们的研究补充了以前的报告,形成嵌合体胚胎的细胞定位密切相关的主要细胞和干细胞的细胞定位决定了命运46]。ICM细胞利基强于ESC的利基,但iPSC利基是占主导地位的ICM。因此,少则类似于ESCs可以诱导形成ICM状的细胞,为嵌合体,但大量的万能干细胞可以诱导ICM细胞转变成iPSC-like细胞,最终导致肿瘤的形成。

我们发现完全ESC-derived老鼠可以由coculturing和注射胚胎而不是为囊胚coculture是一种简单而有效的方法产生嵌合体和完全ESC-derived老鼠(21,22,47]。这个改进coculture技术比瓶coculture[更方便20.]。这个发现也表明,使用的协议几乎没有影响一代完全ESC-derived老鼠,但胚胎阶段发挥着重要作用。与其他报告一致,ESCs可以坚持为胚胎的表面,而不是2 - 4细胞胚胎(25]。虽然完全ESC-derived小鼠的发育机制仍不清楚,我们假定ESC集群倾向于形成ICM细胞由于其紧密连接(48- - - - - -52)和不对称的形成来源于细胞大小和形状的变化(53ESCs)之间和卵裂球51,54因为更充分ESC-derived coculture生成的老鼠的胚胎和ESCs为ESC集群聚合形成的胚胎。需要进一步调查,以确定胚胎干细胞完全取代icm和发展之后变成一个ESC-derived鼠标。

总之,我们非侵入性为胚胎coculture是一个简单的和合适的协议生成ESC嵌合体,充分ECS-derived老鼠可以用来描述ESC的全能性。然而,为胚胎注射生成iPSC嵌合体是唯一合适的方法描述嵌合万能的发展潜力。干细胞为嵌合体动物的能力可能不代表的全能性干细胞。干细胞的传播和完全stem-cell-derived动物也应该被考虑。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作得到了内蒙古自然科学基金的拨款主要特殊项目(2010 zd05),内蒙古的科技创新基金(20121406和20121406)和国家关键技术研发项目(2012 bad12b01)的中国。

补充材料

ESCs的特性的方法和结果,总结了万能的补充材料。ESCs短暂、鼠标和万能的特点是采用免疫染色,Nanog Sox2 Oct4、rt - pcr Sox2, Oct4, Nanog Klf4,畸胎瘤的形成。采用免疫染色的方法,rt - pcr和畸胎瘤形成中所描述的补充材料。结果表明,ESCs和孤立的细胞则在我们的实验室是典型的干细胞。

  1. 补充材料