文摘
干细胞从脂肪组织分离显示巨大的治疗潜力在兽医,但一些点,如使用新鲜或培养细胞和给药途径需要更好的知识。本研究旨在评估自体血管基质的影响分数(SVF,对asc)或同种异体培养脂肪干细胞(,)注入穴位与髋关节发育不良和狗弱反应药物治疗。对asc犬具有增殖和分化潜力对asc类似于从其他物种。经过第一周的治疗,临床评估与基线相比,结果在所有方面都改善了患者自体SVF对asc和三个狗处理的同种异体。在15 - 30天,所有的狗显示改善的活动范围,残废在小跑,和痛苦的操纵关节,除了一个ASC-treated病人。积极的结果更清楚地看到SVF-treated组。这些结果表明,自体SVF对asc或同种异体可以安全地用于穴位注射治疗髋关节发育不良在狗和代表一个重要的治疗选择这种类型的病理变化。进一步的研究是必要的评估可能的优势SVF细胞在治疗关节疾病。
1。介绍
髋关节发育不良(HD),特点是不稳定和脱位或半脱位的髋部,是一种遗传整形病理影响狗的品种与不同的数据大相径庭,导致疼痛和跛。可以保守治疗,限制的基础上锻炼和止痛剂或chondroprotective代理管理,或手术如纠正截骨术、耻骨肌肌切除术,股骨颈的延长。这些治疗需求太长或极其入侵起到有益的作用。最近,细胞疗法与间充质干细胞(msc)提出了这个条件作为替代。
msc是原始的中胚层细胞存在于所有组织和体外和体内能够区分不同的细胞类型1]。他们的治疗潜力主要是解释为生产生物活性分子提供一个再生微环境在受伤的组织2]。msc孤立的人口从脂肪组织(对asc)已经受到了特殊的关注,由于其易于收集,丰富,和再生潜力3]。最小的标准来定义这些细胞,既新鲜基质血管分数(SVF)栽培对asc,最近提出的脂肪疗法国际联合会和国际社会细胞治疗(4]。
脂肪干细胞在兽医,主要用于骨骼,肌腱,韧带损伤和关节疾病。犬骨髓msc孤立,脐带血,脂肪组织,和沃顿商学院的果冻特征(5- - - - - -9在犬模型[]或检测治疗潜力10]。然而,尽管增加使用干细胞在兽医诊所11充分),很少有研究调查细胞疗法的疗效[4,12,13]。此外,一些点应该更好的探索,比如使用新鲜的细胞对asc SVF或培养,使用的细胞数量和给药途径。
在这项研究中,我们建议使用干细胞治疗的穴位。针灸很旧的实践在人类医学和兽医过程也是一个很好的描述(14,15已经表示[],尽管一些有争议的观点16]。针灸已经用于治疗猫和狗十年左右,主要为肌肉骨骼问题[14),腰痛17),膝骨关节炎(18)、紧张性头痛和偏头痛(19,20.]。有趣的是,针灸可以动员干细胞隔间等34个−CD133 +细胞(21]。
我们的研究旨在评估自体的功效SVF对asc或同种异体培养注入穴位与HD狗。
2。材料和方法
2.1。动物
研究协议是由动物使用大学的伦理委员会批准Luterana巴西(2010号- 1 - p)。脂肪组织收集从三个健康男性不明的狗品种,加权平均13.5公斤,维护动物屋的兽医大学医院Luterana巴西。犬类病人在这个研究包括三个男六女狗不同的品种,HD和弱应对药物治疗。在加入之前,业主同意通过知情同意参加临床研究和观察他们的狗在研究期间。动物接受常规临床和血液学的评估,以确保整体健康,和以往任何病变的临床和x线检查评估。一名兽医评估疼痛的狗操纵,变更的活动范围和功能残疾。
2.2。隔离的血管基质分数
脂肪组织(5 - 10 g)收集的腹股沟区四个病人,使用标准的外科手术和轻微的麻醉。脂肪组织是用磷酸缓冲盐(PBS)和消化1毫克/毫升胶原酶i型酶失活后与同等容积的杜尔贝科的修改鹰的介质(DMEM)补充10%胎牛血清(FCS, Cultilab,圣保罗,巴西),这些细胞被洗和汉克的平衡盐溶液和离心机在400 g×10分钟。可行的细胞SVF被数台盼蓝染色后,和5×106细胞被resuspended 2毫升PBS。
除非另有说明,所有试剂都从西格玛化工有限公司(密苏里州圣路易斯和plasticware TPP (Trasadingen、瑞士)。
2.3。隔离、文化、以及对asc的表征
脂肪组织(5 - 10 g)收集的腹股沟区三个健康的狗被用于隔离SVF和ASC文化,如前所述[22]。简而言之,与胶原酶消化后获得的细胞颗粒类型我resuspended DMEM补充2.5 g / L玫瑰和10% FCS,培养在5%与介质变化在37°C,每2 - 3天。细胞间通道的3和6被用于描述文化,分析3个独立的文化,接受治疗的患者。
细胞增殖是评估对asc镀在104细胞/厘米2,使在85%左右通过融合在同一密度,在每个通道和计数恢复细胞。实验一式三份完成。分析了ASC文化的可塑性孵化长达4周与培养基补充脂肪形成的特定因素,成骨的,和chondrogenic血统,描述1,22]。脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞显示了特定的染色解决方案(油红O,茜素红S,和阿尔新蓝,职责)。所有程序都负控制文化(文化差异)。显微照片拍摄数码相机(AxioCam MRc,卡尔蔡司、从德国),使用AxioVision 3.1软件(卡尔蔡司)。
2.4。治疗和评估
自体血管基质细胞分数(从2到5×1062毫升PBS)被用于细胞治疗四条狗。剩下的动物被处理同种异体,培养脂肪干细胞(从2到8×1052毫升PBS)源自相同的细胞健康的捐赠者的狗。细胞悬浮液的制备,台盼蓝染色后可行的细胞数。这些细胞被注入在三个穴位(29膀胱54,胆囊,胆囊30)附近的联合影响。
动物在不同时期随访兽医,物理和骨科检查评估疼痛的操纵,运动范围的变更,功能残疾。结果得分,更糟糕的是,任何修改或改进。
3所示。结果
血管基质的细胞产生收集的分数平均三个正常的狗和四个病人可行的脂肪组织细胞/ g。对病人在这项研究中,具体来说,SVF可行的细胞的产量为4.2×105,4.1×105,3.9×105和5.1×105分别对患者从6到9表所示1。细胞生存能力高于95%所有隔离程序。ASC文化从SVF成功建立的三个正常的捐助者。文化显示典型的形态和增殖率mesenchymal-type干细胞可以分化成脂肪细胞,成骨细胞和软骨细胞(图1)。
(一)
(b)
(c)
狗的特征包括在这项研究中,以及处理收到的类型,介绍了表1。通过穴位注射是很容易执行,患者没有任何不适的迹象。总结了临床结果表2。在第一个评价,由兽医治疗后一周,明显改善的活动范围和残废小跑和操纵主要显著减少疼痛在观察在七个病人。在狗数字1和5,少被认为得到显著改善。根据业主评估,结果也明显好转。15 - 30天临床评估显示增加功能改善患者自体SVF(狗从6到9)和三对asc的病人接受同种异体(狗从2到4)。复苏的活动范围和残废也观察到病人数量在30天1天15和维护。然而,病人5号显示困难站在15天,30天伴随疾病的并发症。
4所示。讨论
SVF可行的细胞产生的样本结果类似于之前报道(23]。犬对asc节目形态和增殖和分化潜能对asc类似于从其他物种24]。对asc的增殖率没有修改文化时期至少9个段落,这样细胞用于段落从3到6在这方面是相似的。对asc Immunophenotyping,参数识别(4),并不包括在目前的研究中。自抗体干细胞狗和其他物种并不普及,这个参数不是发表的许多研究中描述用干细胞从这个物种12,25,26]。
对asc同种异体和自体SVF显示类似的潜在治疗髋关节发育不良的狗,当在穴位注射。只有一个的狗(病人5号),明确改进没有被观察到。伴随的并发症的病理观察到这种动物细胞疗法还没有相关协议(13]。干细胞治疗的积极作用在患者自体SVF更为明显,但一个更大的样本数量是必要的建立这一发现的重要性。SVF细胞的剂量计划根据前一个类似的研究(12),由于干细胞间质血管分数范围从1%到10% (4),ASC剂量也相应降低。
许多研究已经评估的治疗潜力的SVF狗,即使使用的术语来描述细胞一直不是很清楚。黑色的和他的同事们(12,27),例如,显示自体SVF(他们称为“脂肪间充质干细胞”)是有效的治疗慢性骨关节炎(OA)的狗。培养对asc也被证明有一个重要的治疗活动的狗。一个注入自体的临床效果,培养对asc是评估4日狗humeroradial关节的残废与OA (24]。OA的手肘关节改善治疗后,这表明一个重要的潜在治疗残废。同样,马利克和他的同事们(28孤立和特点对asc犬,然后成功地用于治疗HD和截瘫的患者。狗恢复得很好,一个月治疗后能自由移动。
很少有研究相比培养细胞的治疗潜力和新鲜孤立SVF或其等价的骨髓中,单核分数。在类似于我们的一项研究中,新鲜或培养细胞的治疗潜力在骨科损伤骨髓单核分数相比,狗是(25]。临床超声和x射线显示有益的结果从两种类型的准备,和作者得出的结论是,使用新鲜细胞有利,因为技术是更容易,成本更低,手术可以在同一天进行,细胞不需要扩大和保护他们最初的潜力。我们只同意最后考虑。同种异体的使用,培养细胞不需要额外的手术收集患者脂肪组织,和使用现成的产品更快,可以更便宜。此外,年龄的捐赠已被证明有负面影响犬msc的频率和功能(23,26),已知的人类细胞(29日]。然而,它是可能的自体,新鲜细胞更有效修复受伤的组织,小的差别所显示的两组动物在目前的研究中。
注射部位出现的是一个重要的变量来确定细胞疗法的结果。自体关节内的管理对asc在八个瘸腿的狗有严重OA测量力的平台,显示显著增加垂直力和垂直脉冲峰值后6个月。我们的结果表明,针灸点代表一个潜在的管理路线干细胞。一项长期研究涉及73只狗与髋关节OA显示黄金珠的功效植入插入通过针头在穴位缓解疼痛的治疗和改善流动(30.]。本研究支持使用针灸治疗HD和办公自动化。同样,在包括与后肢缺血大鼠的一项研究中,在穴位注射骨髓间充质干细胞相似的用于本研究改善血流和血管内皮生长因子的含量增加,转移增长factor-B1和一氧化氮,改善血管生成和arteriogenesis31日]。
未来的工作是必要的调查机制负责的穴位注射治疗效果这些mesenchymal-type干细胞。msc已知能够迁移到受伤的网站(32),他们的治疗潜力更一般通过旁分泌机制来解释,治疗性生物活性因子的分泌(2),这就可以解释本研究中观察到的结果。仅镇痛治疗效果,这也可以解释的一些结果,不会保持几个星期。
我们的研究表明,脂肪中提取干细胞,准备作为自体SVF新鲜对asc或同种异体细胞培养,可以安全地用于穴位注射治疗髋关节发育不良在狗和代表一个重要的治疗选择这种类型的病理变化。进一步的研究与大量的动物是必要的,以评估疗效和可能利用自体的新鲜细胞治疗关节疾病在狗。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
卡米拉马克思和Maiele Dornelles对峙了同样的工作。
确认
本研究在一定程度上支持拨款Fundacao德帕罗尽管带动做南里奥格兰德(FAPERGS)。路易莎玛丽亚戈麦斯de马赛布拉加和娘娘腔的拜尔Nardi所有者的CellMed药物Regenerativa Ltda。提供细胞制剂用于这项研究。