文摘

骨骼肌具有良好的再生能力,但肌肉损伤和发达程度的纤维化可能阻止完全再生。的在活的有机体内应用人类的脐带间充质干细胞(HMSCs)与条件媒体(CM) HMSCs被培养和扩大,与不同的车辆诱导肌肉再生,在大鼠肌切除术模型评估。两个商用车辆和球形水凝胶由我们的研究小组使用。治疗组获得有趣的结果在肌肉再生方面,无论是在组织学和功能评估。不那么明显的疤痕组织,证明了胶原蛋白I型量化,存在于肌肉接受HMSCs或厘米。的组织学评估由ISO 10993 - 6个进球,这是观察到HMSCs显然有长期的负面影响,因为治疗组与CM提出更好的分数。厘米可以被视为一种选择在活的有机体内这些细胞的移植,因为它可以受益于分泌分子的局部组织反应类似的结果而言,肌肉再生。寻找一个最优的车辆可能的关键点在骨骼肌组织工程的未来。

1。介绍

不完整的再生与残余创伤性肌肉损伤后功能缺陷在矫形手术和创伤学是一个常见的问题1]。骨骼肌与轻微的创伤,肌肉组织架构的重大损失呈现伤口网站无法支持正常的再生过程(2]。在这些临床情况下,有疤痕组织的形成由于成纤维细胞合成胶原蛋白I型,在临时纤维蛋白矩阵来源于当地的血凝块。再生期间,当地卫星细胞的cytokine-mediated感应以前撒谎休眠肌纤维膜和基板之间,形成了centronucleated肌纤维(肌管)并不足以完全恢复该地区受到的损失肌肉组织(3]。

先前的研究已经开发出了新的实验模型中定义删除部分的肌肉组织,创建一个肌切除术缺陷,或产生裂伤(肌切开术)内的肌肉2,4]。尽管如此,这些模型不能规范病变(不同的缺陷大小),因为他们是由人工用手术刀叶片解剖。所以,我们的研究小组开发了一种新的实验的肌肉拉伤胫骨前鼠肌肉通过活检穿孔创建标准化肌切除术(手术)病变。这是一个初步研究不同类型的骨骼肌病变(化工、机械、和手术)诱导为了确定最适合我们的目标(5]。几项研究已经发表的基于模型如肌切开术(撕裂)或肌切除术,可以模仿肌肉组织严重损伤的损失(2,4,6- - - - - -8]。相比化学、缺血和机械损伤,肌切除术模型的优点是允许移植间充质干细胞(msc)的车辆也可以被视为一种脚手架的这些细胞宿主环境,而不是注射细胞悬浮在病变的核心。有证据表明来自动物实验和临床试验表明,细胞疗法涉及不同类型的干细胞应用的有前景的结果考虑功能和形态学再生肌肉(2,9- - - - - -11]。其他有前途的蜂窝系统可以替代卫星细胞和嫁接再生肌肉是人类脐血干细胞分离或msc在脐带矩阵,所谓的沃顿商学院的果冻12]。

有技术或/和道德很难获得足够的和适当的干细胞从骨髓或胚胎(从辅助生殖技术获得或体细胞核移植治疗目的),这些细胞疗法的应用有限。从脐带沃顿的果冻的msc具有干细胞特性,能够区分神经性,成骨,chondrogenic,脂肪形成的,肌原性的细胞在体外(13]。他们可能会因此被证明是一个潜在的细胞系统的细胞疗法,包括基质等目标组织和肌肉,通过取代退化细胞,产生生长因子,或调节炎症局部反应(14,15]。msc已成为再生医学的最有趣的一个代理。科学和临床证据表明,msc可以迁移到特定网站的伤害或组织再生,在调节免疫和炎症反应,调动内在细胞水库通过一系列不同的旁分泌机制(16]。此外,这些细胞代表的原始间叶细胞祖细胞中含有可分离出生后,低温保存,解冻,扩大治疗用途(13]。

现在,检查参与组成分泌腺的综合表征msc变得尤为重要,这些细胞所分泌的因素似乎是主要的效应器的治疗作用[17]。CM的假设,这些细胞增长和扩大文化(所谓的条件media-CM),可能是一个适当的治疗产品富含生长因子与HMSCs本地应用程序,我们的研究似乎是一个合理的方法。

细胞传递需要一个矩阵中细胞悬浮(18]。Floseal Tisseellyo,水凝胶(19,20.)进行评估和比较的生物集成到骨骼肌组织标准化肌切除术后。这些车辆引发的炎症反应是考虑的主要话题。然而,这些生物材料支架的作用HMSCs也是一个重要因素,因为它们可能会影响和促进逐步在再生过程中释放的细胞和生长因子。

Floseal(百特公司、瑞士)是一种止血矩阵,由bovine-derived明胶的组合矩阵和一个来自人体的凝血酶组件。gelatin-thrombin矩阵可以立即使用前做好准备,作为一个高度粘性凝胶(21]。这两个组件的Floseal促进止血。除了他们的个人行为,明胶矩阵和凝血酶实现协同交互促进形成一个稳定的凝块的出血。Floseal一个重要的问题在于,与其他纤维蛋白封闭剂和Tisseellyo一样,它不工作没有血的,因为它提供了一个不同的止血机制。因为gelatin-thrombin矩阵是亲水的,它遵循湿组织与纤维蛋白胶相比。肿胀明胶颗粒限制血液流动,还提供一个机械稳定矩阵其周围可以形成纤维蛋白凝块。这些效应已被证明是很有价值的在几个外科技术像血管手术的22]。减少出血Floseal-treated妇女进行肌瘤切除术也鼓励和提供证据的能力gelatin-thrombin矩阵来减少失血时立即应用,直接出血肌肉组织(21,23]。纤维蛋白单独或结合其他材料已被用来作为生物支架msc (2]。纤维蛋白胶,稀释时,可以有效地支持生存和增殖的间充质干细胞(18]。Tisseellyo(百特公司、瑞士)是一种纤维蛋白胶表示作为辅助止血手术的病人当控制出血的传统外科技术(如缝合、结扎、腐蚀)在肝素化是无效的或不切实际的,也是有效的病人。间充质干细胞的使用/纤维蛋白混合支架系统整形修复手术似乎是一种很有前途的方法在某些临床情况(24]。

水凝胶三维(3 d)的亲水聚合物网络,是吸引人的生物应用程序由于其高含水量、高渗透性、生物相容性,能够被放置到关键缺陷以微创的方式。在目前的实验工作,硝酸铈交联水凝胶由海藻酸和玻璃酸钠是细胞封装测试。

假设HMSCs从脐带沃顿的果冻的有至关重要的作用在肌肉结构损伤后的修复是质疑。他们可能是重要的肌肉再生可以与宿主细胞人口在细胞外基质的重塑。使用肌切除术模型的本地应用程序HMSCs隔绝了沃顿的果冻和厘米,与前面提到的三个生物适合的车辆,为了评估肌肉再生增强在15天(d15)参与。这是由建立三个不同的组(车辆,车辆+msc、和车辆+厘米)为每一个提议的车辆,以选择最合适的生物材料。由于纤维蛋白胶提出了最好的分数d15审判的地方反应植入后,它被选为车辆用于35天(d35)试验25]。

2。材料和方法

2.1。HMSCs移植前准备

HMSC从沃顿商学院的果冻脐带矩阵从PromoCell GmbH购买(c - 12971,批号:8082606.7)。HMSCs是在湿润的气氛中培养和维护公司为5%₂在37°C。间充质干细胞生长介质PromoCell (c - 28010),是每48小时更换一次。80%的融合,细胞收获用0.25%胰蛋白酶EDTA (GIBCO)和传递到一个新瓶进一步扩张。HMSCs浓度为10⁴细胞/厘米²是培养表现出80%的融合4天后培养基。的表型HMSCs被PromoCell试验评估。进行严格的质量控制测试每个很多PromoCell msc隔绝沃顿UC的果冻。HMSCs检测细胞形态,依从率和生存能力。此外,每个细胞许多特点是通过流式细胞术分析综合面板标记,如血小板内皮细胞粘附molecule-1 (PECAM-1 CD31),归巢细胞粘附分子(HCAM CD44)、CD45、Endoglin (CD105)。HMSCs解冻和扩大在我们实验室展出mesenchymal-like形状平坦和多边形形态(图1)。的表型HMSCs扩展的在活的有机体内在我们实验室测试证实了流式细胞术为了证明HMSCs之后国际社会细胞治疗(ISCT)标准(26]。检测与执行以下抗体和各自的同形像(所有从BioLegend除非另有规定):PE反CD105 (eBioScience);APC反CD73;PE反CD90;PerCP / Cy5.5反CD45: FITC反CD34分子;PerCP / Cy5.5反CD14分子;太平洋蓝反CD19和pacific-blue反HLA-DR。染色体分析HMSCs从沃顿商学院的果冻在活的有机体内应用程序之间进行段落4和5。当达到80%汇合,培养基被改变和补充4μg / mL秋水仙胺溶液(原液,猫。美国Gibco数量15212 - 012,纽约)。4小时后,收集细胞和悬浮在0.075 8毫升的氯化钾溶液与牛胎儿血清补充。然后,悬挂在37°C孵化35分钟(min)。在1500转离心后,固定剂甲醇:冰醋酸(8毫升)添加在6:1和混合在一起,这些细胞被再次离心。经过两轮的固定,两个新轮进行固定剂甲醇:冰醋酸在3:1。最后离心后,细胞悬液扩散到很好清洗幻灯片。染色体的分析是由一个得分手Giemsa-stained 20日中期。每个细胞中染色体数目。常规染色体G-banding分析也进行了核型的决心。 The karyotype of undifferentiated HMSCs was determined in order to certify the absence of neoplastic characteristics in these cells, as well as the chromosomal stability to the cell culture procedures before the在活的有机体内应用程序。

2.2。的媒体(CM)准备在活的有机体内植入

为了获得厘米,镀HMSCs解冻,在4000个细胞密度/厘米²。他们保持之前描述的培养条件下,连续评估可行性,直到获得最低80 - 90%的融合。本研究中使用的培养基批检查维护多能——增长促进活动,依从率,测试间充质干细胞的典型形态。这个媒介支持扩大HMSCs没有诱导早期衰老和分化。培养基是取代每48小时和CM收集T75瓶血压得到较好的控制在活的有机体内应用程序只有在达到所需的细胞融合,以防培养基在接触HMSCs至少48小时。CM当时集中在旋转集中器的截止5 kDa(安捷伦科技)按照制造商的建议。

2.3。车辆/支架的准备HMSCs移植和细胞生存能力

Floseal由交联明胶的凝胶基质成分颗粒膨胀10 - 20%在接触血液或体液。这个矩阵,结合人类凝血酶和氯化钙溶液用于调整后一个组件,无菌和nonpyrogenic [21,23]。

简而言之,Floseal开始的准备用5毫升注射器针凝血酶提供的附加组件包;5毫升溶液转移到瓶含有凝血酶。瓶是轻轻飞舞,直到凝血酶溶解。小碗的凝血酶溶解然后吸气到注射器表示马克(4毫升)和凝胶基质颗粒注射器连接到注射器含有凝血酶解和明胶matrix-thrombin溶液混合物之间来回转移注射器总共10(图2 (e))。准备时间大约是1分钟,一旦完成,混合是可用的(图2小时2 (f))。

的纤维蛋白矩阵HMSCs准备使用Tisseellyo设备制造商的指示。总之,准备一个2毫升的解决方案通过增加72 - 110毫克的纤维蛋白原,十三10 IU因素,和3000 UIK牛抑肽酶混合人类凝血酶和40的500 IUμ氯化钙的M。

组包含细胞和Floseal / Tisseellyo车辆,msc resuspended大约30μL无条件文化media-Mesenchymal干细胞生长介质,PromoCell (c - 28010),结合之前准备的车辆(从Tisseellyo Floseal和纤维蛋白矩阵)填充60μL骨骼肌缺陷。

制备的球形水凝胶,制备了聚合物溶液通过添加比例为1:1 (V / V)海藻酸钠水溶液(m / V) 7%玻璃酸钠水溶液(m / V) 0.5%,在磁搅拌。后来,聚合物溶液是插入一个胰岛素注射器和液滴释放到过量的硝酸铈溶液135毫米为了获得一种交联聚合物的大约60范围μL体积(大约相同的缺陷)(数据2 (g)- - - - - -2 (j))。硝酸铈和玻璃酸钠的解决方案被微滤(0.22消毒μm膜)和海藻酸钠粉在高压蒸汽灭菌15分钟(120°C)以前的解决方案准备。组中msc在水凝胶相结合,细胞resuspended海藻酸钠,玻璃酸钠与硝酸铈在交联。

球形水凝胶不仅被用作车辆,其属性也被评估和优化为细胞植入找到合适的矩阵。这个支架是以前开发和特点从物理化学和生物的角度19,20.]。细胞内自由钙^{2 +}浓度测量在Fura-2-loaded细胞利用双波长荧光光谱测定法(如前所述27]。测量进行融合得到培养后未分化HMSCs Floseal的存在,从Tisseellyo纤维蛋白基质,球形水凝胶以关联HMSCs生存能力的三个二手车的存在在活的有机体内临床前试验。

2.4。外科手术和HMSCs移植

Sasco Sprague-Dawley雄性老鼠250 - 300 g。执行标准化手术损伤使用5毫米直径活检穿孔叶片,创建一个大约60μL卷的厚度缺陷midbelly地区胫骨前肌肉(图2(一个)- - - - - -2 (c))。缺陷就完全注满包含1×10的细胞悬液⁶HMSCs在30μL培养基和30μL(纤维蛋白胶(Tisseellyo)含有纤维蛋白原和凝血酶(MSCFibrin集团)(图2 (d))。在另一组(ConditionedFibrin组)30μL CM,包含营养因素从HMSCs集中媒体文化,结合30μ纤维蛋白原和凝血酶的L。控制组还测试了,5毫米直径肌切除术损伤(控制与病变组)和结合的30μL(纤维蛋白(纤维蛋白组)。三个组还测试了使用一个止血的矩阵(Floseal)代替之前使用的纤维蛋白胶(Floseal,MSCFloseal,ConditionedFloseal组)和三个其他组织使用水凝胶由透明质酸、海藻酸、铈作为交联(水凝胶,MSCHydrogel,ConditionedHydrogel组)。全身麻醉下手术被处决与甲苯噻嗪(1.25毫克/ 100克BW ip)和氯胺酮(9毫克/ 100克BW ip)。皮肤和皮下组织的正确关闭simple-interrupted缝合的4/0时灯丝(Synthofil)。15天之后,动物被牺牲和6胫骨前从每个描述的肌肉组()收集和固定在10%缓冲甲醛进行组织学分析。的控制,纤维蛋白,MSCFibrin团体也反复在不同的时间点(d35)评估完成后的肌肉再生。

所有的动物测试程序都符合欧盟指令2010/63 /欧洲议会和兽医批准葡萄牙当局按照欧洲共同体1986年11月的理事会指令(86/609 / EEC)。人道的端点之后按照经合组织指导文档识别,评估,和使用临床体征作为实验动物用于人道的端点安全评价(2000)。采取了足够的措施来减少疼痛和不适考虑人类端点动物痛苦和痛苦。动物被安置了两个星期之前进入实验。

2.5。组织学评估当地的影响

组织样本在10%缓冲福尔马林固定,常规处理,脱水,嵌入在石蜡。连续3μm-sections削减和苏木精和伊红染色(他)。

国际标准iso - 10993 - 6 (28]生物评价医疗设备是用于评估当地的影响不同的生物材料植入后用作车辆/支架在这项研究[28]。当地的影响进行评估的比较造成的组织响应测试植入引起的控制,可以视为无刺激性(< 2.9以上控制)、小(3.0 - -8.9以上控制)、中度(9.0 - -15.0以上控制)、严重(> 15.0以上控制)根据获得的分数(半定量分析)。在这项研究中,控制集团通过执行外科手术(肌切除术)没有任何生物或细胞移植。HMSCs和CM与纤维蛋白胶的影响在两个不同的时间点(d15和d35)相比,也为了观察的影响这些生物制品在不同阶段的肌肉再生。每组由6胫骨前肌肉在每一个,18个字段数在400 x放大。

2.6。胶原蛋白量化

创面胶原蛋白含量可以通过图像分析计算的马森Trichrome-stained组织学图像在一个预定义的图像放大29日]。胶原蛋白的方法量化在骨骼肌组织是由我们的研究小组使用ImageJ^©软件(NIH)为了比较的纤维化损伤的治疗和治疗组之间,在肌肉再生。

平均5马森Trichrome-stained组织学图像被从每个样品在20 x放大。确保执行的分析在损伤区,从肌肉获得图像深度可见胶原蛋白最多的内容(2]。这些图片是合并的AutoStitch V2.2软件)允许一个完整的可视化骨骼肌区域受到损伤的影响。通过使用阈值颜色工具ImageJ^©软件(NIH),彩色的地区选择蓝色,这样我们可以间接计算骨骼肌纤维比例的样本。这个颜色通道进行了分裂和阈值的分析每个图像系列收集使用相同的曝光,亮度,和白平衡设置。蓝色像素的比例高于总图像中像素的阈值是用来计算的百分比纤维化在每个样本(30.]。这些价值观使我们比较不同群体之间的疤痕组织的发展。

2.7。收缩力的测量

脚踝dorsiflexor肌肉的等长力量,包括胫骨前肌肉,从d35在动物的评估控制治疗组以及另一个4动物,测定肌切除术前后(控制没有损伤和控制d0、职责),使用专门设计的测功器,允许测量老鼠的踝关节肌肉所产生的扭矩。与动物深麻醉下聚氨酯(20% /卷卷,6毫升/公斤合著),坐骨和常见的腓骨的神经暴露水平的远端三分之一的大腿。神经被调动起来,并且从周围组织,释放和胫骨神经被切断只允许电刺激肌肉共同提供的腓骨的神经。袖口双极电极,由两个细导电线由一片挠性管,被包围的常见的腓骨的神经电刺激神经。

动物是在背卧位的加热垫,髋关节和膝关节弯曲90度,脚绑在脚踝关节轴的踏板与踏板。脚踝dorsiflexors所产生的转矩是衡量一个负载细胞(Futek LSB200,灵敏度2 mV / V,欧文,CA,美国)连接到前端的踏板。

强直收缩所产生的转矩的脚踝dorsiflexor肌肉测量每10°之间的脚踝位置120°和40°的脚踝的运动范围(0°脚与胫骨)。肌肉收缩是引起列车的超大的电脉冲时间0.5秒,(刺激频率150赫兹;目前4 mA)交付给常见的腓骨的神经。

力信号记录1千赫采样率,由12位模拟数字转换卡(Plux无线生物,阿鲁达dos清酒,葡萄牙)并存储在计算机硬盘供以后处理。脚踝dorsiflexor肌肉最大转矩得到最大扭矩值的每个收缩。在一些动物中,力进行测量之前和胫骨前肌受伤后不久。力测量的其他动物进行了35天(d35)。

2.8。免疫组织化学(包含IHC)分析

最重要的事件在重建肌肉卫星细胞的激活。他们的特点是转录因子的表达Pax7是成对蛋白质(9]。通过包含IHC,我们试图确定这些细胞在损伤区域内的肌肉纤维蛋白胶作为车辆(纤维蛋白,MSCFibrin,ConditionedFibrind15和d35)。作为控制在noninjured,同样的分析胫骨前肌肉(图执行3)。

部分deparaffinised和水化和抗原暴露技术进行使用压力锅10更易与L柠檬酸钠缓冲,pH值6 0 3分钟。幻灯片是在室温下冷却10分钟,冲洗两次三磷酸缓冲盐(TBS) 5分钟。内源性过氧化物酶被过氧化氢3%甲醇为10分钟。使用avidin-biotin-peroxidase复杂执行免疫组织化学(ABC)方法,采用单克隆抗血清Pax7(小鸡Pax7同上352 - 523年发展研究杂种细胞银行,爱荷华大学)稀释1:50。部分与TBS冲洗后每一步的过程。颜色是在室温下长达7分钟刚做好的解决方案的民建联和部分然后轻轻地用苏木精复染色,脱水和安装。消极的控制由用TBS取代主要抗体。

Pax7标签指数定义为Pax7阳性细胞核的百分比,这是由数至少1000核在选定的领域,在高功率放大(×400)。多个字段必须获得1000核病变。

2.9。统计分析

当相关的,数据平均值和标准偏差(SD)。统计分析是由双向方差分析(时间×集团)对胶原面积分数数据和单向方差分析对肌肉的强度数据,其次是图基的两两比较。力之前和之后的数据胫骨前肌切除术被paired-sampled相比t以及。统计学意义是接受。的可行性分析,所有数据被视为意味着±SEM,细胞的数量吗由数字化测量技术。对于每一个实验条件,分析了25 HMSCs ()。

3所示。结果

3.1。HMSCs特性和细胞生存能力

msc展出mesenchymal-like形状的平面和多边形的形态。在扩张,成为长纺锤状细胞和殖民统治整个培养表面(图1)。的表型HMSCs扩展的在活的有机体内在我们实验室测试证实了流式细胞术为了证明HMSCs之后国际社会细胞治疗(ISCT)标准(26]。作为MSC-type干细胞的预期,流式细胞仪分析表明,人口都超过96%的细胞CD44阳性细胞表面标记,CD73, CD90、CD105和阳性CD14不到2%,CD19, CD31、CD34、CD45、HLA-DR。

核型分析HMSCs细胞系来源于人类沃顿的果冻证明这种细胞系并没有肿瘤特点和细胞培养过程中是稳定的数量和结构体和性染色体。移植HMSCs提出正常形态和免疫细胞化学标记msc。

结果从这项技术称为测量未分化的HMSCs,对应才开始从细胞凋亡过程。的是42.9±4.5 (),44.2±3.5 (),50.1±3.9 ()HMSCs培养在Floseal面前,纤维蛋白从Tisseellyo矩阵,分别和球形水凝胶经过7天的文化。无差别HMSCs培养的三个测试车辆达到融合,展现出一个正常的星状平面形态的文化。根据这些结果,可以得出合理的结论,三种类型的车是可行的基质未分化HMSCs文化和生存和可用于临床试验。

3.2。组织学评估当地的影响

组织学分析和ISO 10993 - 6个进球证明了纤维蛋白胶(得分3.6分以上控制)是减少无功作为汽车相比Floseal组(8.68分以上控制),水凝胶(得分10.94分以上控制)(图3(a))。总的来说,在d15唯一集团视为无刺激性ConditionFibrin集团;纤维蛋白,MSCFibrin,Floseal被认为是轻微的刺激;MSCFloseal,ConditionedFloseal,所有的水凝胶组被认为是温和的刺激。虽然炎症细胞群被认为是更丰富水凝胶集团的ISO得分,止血矩阵(Floseal)产生一个旺盛的钙化(图3(c))。在治疗组与CM HMSCs,迟钝的炎症反应似乎发生高(平均2.31分HMSCs组相比,CM治疗组)。HMSCs减少炎症的影响不是值得注意;在d15 d35,炎症细胞的数量比更高控制组。还应该注意到,在d35获得的分数纤维蛋白组略优于组厘米在哪里添加到纤维蛋白胶(图4)。

3.3。胶原蛋白区域和胶原蛋白的一部分内容

双向方差分析显示组间显著差异(控制,纤维蛋白,MSCFibrin,ConditionedFibrin)()和d15和d35之间()在部分地区被胶原蛋白(纤维化),但没有组织每一次交互效应()。池d15和d35动物在一起,明显高于胶原面积分数被观察到MSCFibrin组相比,控制集团()。没有其他差异存在于胶原面积分数之间的组织在考虑这两个时间点。尽管没有发现交互和不同治疗之间的时间,我们分析了胶原蛋白的数据区域和胶原蛋白含量比例与单向方差分析在每个时间点。在d15,大胶原地区部分被发现的纤维蛋白组相比,控制集团()。在这个时间点,胶原面积分数是类似的其他组。在d35,胶原面积分数更高MSCFibrin组比控制集团(没有进一步的其余组(图之间的区别5)。

3.4。肌肉的力量

脚踝dorsiflexor扭矩的完整的动物特征模式的变化显示关节的运动范围,与意味着等距峰值扭矩发生在脚踝弯曲110度,然后用plantarflexion稳步下降(图6)。的肌切除术损伤胫骨前引起肌肉减少大约三分之一的等距峰值扭矩由脚踝dorsiflexor肌肉(,纳米、预处理和postmyectomy职责)。这等距的最大转矩下降严重胫骨前肌肉拉伤是明显的在每一个踝关节角度测试(方差分析:),尽管受伤前值的差异没有达到统计学意义更扩展脚踝40°角。在控制集团在d35 dorsiflexor等距峰值扭矩值恢复到类似于完整的动物(和海里,控制动物premyectomy和控制d35动物d35 postmyectomy;方差分析:不重要的)。同时,d35 dorsiflexor等距峰值扭矩在每个muscle-injure组相似,无关地治疗(方差分析:不重要的)。

3.5。免疫组织化学(包含IHC)分析

在d15 postmyectomy Pax7的数量⁺核的控制组明显高于治疗组。然而,治疗组之间的差异显然是轻微的(图7)。然而,这些包含IHC样品的定性评估让我们观察到的炎症和纤维化的程度在某种程度上与Pax7的存在有关⁺细胞核。事实上,肌肉治疗只与纤维蛋白似乎炎性细胞群和数量的增加与几个Pax7纤维化⁺细胞核。在肌肉纤维蛋白处理和HMSCs (MSCFibrin集团),更积极的炎症状态,稍微增加数量的纤维化没有跟着Pax7的数量减少⁺原子核相比条件组。它还必须指出,对收集到的肌肉d35 postmyectomy, Pax7的数量⁺积极的原子核在所有组(无关紧要的控制,纤维蛋白,MSCFibrin,ConditionedFibrin)。它也可能做观察,Pax7⁺细胞,noninjured胫骨前肌肉是相似的控制在d35肌肉,这也无关紧要(图8)。

4所示。讨论

骨骼肌损伤是常见的人类,尤其是运动员,和重要的是开发新的方法来提高肌肉再生。骨骼肌有良好的再生能力,但肌肉损伤的程度可能阻止完整再生,尤其是在功能恢复。严重的病变,像那些来自创伤与损失有关的健康的肌肉组织和纤维组织疤痕和不可逆转的发展长期的周围神经损伤后肌肉萎缩,这些情况的例子,再生是有限的。另一种方法恢复受损骨骼肌肉组织的再生医学的方法描述这是干细胞的移植,限制涉及的纤维化和萎缩的肌肉质量,甚至暗示细胞再生和局部血管再生,与生物材料相关或车辆的细胞疗法。的在活的有机体内HMSCs孤立的应用从脐带沃顿商学院的果冻和CM HMSCs培养和扩大,与不同的生物相容性有关车辆诱导肌肉再生在大鼠胫骨前肌切除术模型,本研究进行了测试。这是在我们研究的起点,在其他疾病模型的特征是炎症网站,HMSCs瞬变,利基炎症站点,在xenotransplated鼠存活大约2周在正常小鼠和大鼠,在炎症增加他们的永久站点在病变模型中,没有检测到导航到其他器官。例如,胎盘HMSCs biodistribution,稳定感染慢病毒表达荧光素酶基因,构建了immune-competent和职业点头/ SCID和Balb / c小鼠。当1×10⁶胎盘HMSCs管理,biodistribution模式表明,坚持只在注射部位的细胞,没有分配到其他器官。事实上,胎盘HMSCs保留持续高水平的荧光素酶的表达,在体外,长达3个星期31日]。所以,HMSCs可以调节局部炎症过程改进组织的再生过程。有趣的是,这些细胞,而这些医院是主要组织相容性复合体(MHC)二类负,能够规避和调节免疫系统(32- - - - - -34),使他们有吸引力的细胞来源MSC-based疗法包括骨骼肌疾病和伤痛。此外,这些细胞代表的原始间叶细胞祖细胞中含有可分离出生后,低温保存,解冻,扩大治疗用途(35]。间充质干细胞和新的生物工程方法可以创建一个供应肌原性的干细胞或植入物适用于急性或慢性肌肉紊乱。HMSCs可以影响肌纤维再生和疤痕组织的形成过程主要是由他们的旁分泌作用通过一系列生物分子合成这些细胞,比直接分化为功能性组织。这个最近的范例显示生物分子合成了干细胞可能同样重要,如果不是更如此,引起功能的分化细胞组织修复(26]。这个证据是兼容这里给出的结果,这表明CM获得的在体外文化和扩大这些细胞可能比另一种治疗选择在活的有机体内这些干细胞的移植,可以受益于分泌分子的局部组织反应没有困难和并发症allotransplanted或异种器官移植细胞的移植。从理论上讲,这些问题不应该是一个有关问题自msc呈现低免疫原性和高免疫抑制特性由于减少甚至没有人类白细胞抗原(HLA)二类表达式(36]。然而,在这项研究中所描述的结果反映了轻微HMSCs的长期负面影响,导致更好的结果在治疗组与CM的炎症状态得分(ISO)和附近的胶原蛋白样品评估的内容完整的再生(d35 postinjury)。事实上,在这个时间点和池d15 d35一起,胶原蛋白的分数控制组明显不同MSCFibrin组但不从ConditionedFibrin组。的异常ConditionedFibrin组(表达最好的结果在d15 ISO得分),所有其他的治疗组相比,被认为是劣质的控制组(肌切除术损伤)。应该注意到,只有在后者没有汽车植入,这对这一结果可能是关键。

结构的使用组织工程再生医学(TE)和有前途的创新疗法,可以解决一些临床情况下,骨骼肌的创伤性损伤。这些结构通常是结合细胞,支架和生物因素。尽管只有少数商业产品目前在市场上对于细胞/药,可能是因为每种类型的细胞都需要自己的特定的封装微环境与特异性物质属性和空间控制的生物活性功能,大量的研究在世界范围内进行组织工程和再生医学的各个方面探索高分子材料。骨骼肌细胞植入缺陷,主要有两种技术。细胞系统可能直接注入支架局部损伤部位。也可以由帖子:细胞支架通过注射或coculture(在大多数细胞系统,允许细胞形成单层),然后植入生物材料与细胞系统在受伤的肌肉。在受伤的多个站点的情况下,细胞能够到达受损组织的系统性管理将是一个有趣的替代。

在这项研究中,该协会的HMSCs生物相容性的汽车,它会慢慢地与宿主组织被选中,牢记这些生物材料的吸收率。这个策略允许逐步释放的细胞生长因子,而不是直接注射在核心或周围的病变,这肯定会使这些产品后立即交付的重大损失。组织学分析和ISO 10993 - 6得分表明,纤维蛋白胶(Tisseellyo)作为车辆Floseal相比更少的反应或水凝胶测试。纤维蛋白单独或结合其他材料已被用来作为生物支架干细胞(37]。从我们的数据,纤维蛋白胶可能是最合适的工具植入HMSCs或CM发达肌切除术损伤模型。必须声明,以ISO 10993 - 6总论,降解/ resorbable等生物材料的使用在这个实验中,测试期组织学评估应该估计退化相关的车辆。只有在一个完整的退化和支架的吸附,能获得一个稳定的状态。然而,这个标准还建议的评估组织反应在中间退化阶段,为了分析当地的不良反应残余植入及其降解产物(28]。在我们的研究中,d15和d35愈合过程的两个时间点当选,组织学评价。这两个时间允许我们获得的数据收集这些建议初步研究为了吸引人们的注意力,而使我们聚焦于一个不完整的和一个完整的大鼠骨骼肌再生阶段(5]。在第二个时间点(d35) Pax7的数量⁺核显然是不兼容表明所有这些相关的肌肉显示一个几乎完整的再生。

多种实验模型,妥协骨骼肌功能甚至是摧毁这个组织已经被描述在整个年。注射myotoxic代理、机械粉碎、缺血,去神经或肌肉营养不良通常在不同的动物模型诱导为了建立新方法治疗骨骼肌疾病。然而,严重的病变如创伤性损伤,相关联,例如,处理的重型机械,偶尔导致劳动事故或更频繁地观察到交通事故,通常是一个挑战整形,整形手术,可能我很难在上述模型模拟。组织工程和再生医学将贡献在这些患者更好的恢复。撕裂肌肉(6- - - - - -8]或补充的去除(肌切除术)的部分肌肉组织(2,4]目前被选为一个更精确的模型来破坏肌肉再生更多强调的方式。在前一个发达组织学定性评估,肌切除术模型被证明是最适合一个全面而标准的评价大鼠骨骼肌肉再生(25],特别是考虑到新的生物材料和细胞疗法所描述在这里。

组织工程的基本概念包括播种的细胞生物可降解支架浸渍或不与生长因子和/或细胞因子(38]。使用胚胎外的组织干细胞水库为组织工程提供了许多优势胚胎和成年干细胞来源。最重要的是,相对大量的胚胎外的组织和物理操纵的从容理论上增加干细胞的数量,可以分离(39- - - - - -42]。

msc具有几个重要的和不同的属性,如以下几点:(一)塑料附着;(b)有特定的表面蛋白表达,积极染色标记的间叶细胞谱系CD10、CD13、CD29、CD44, CD90、CD105和消极造血血统的标记;和(c)具有tri-lineage分化能力的孤立的msc。这些标准被国际社会定义为细胞治疗(ISCT),其次是HMSCs应用在临床前试验(43]。生长因子和细胞因子的生产是一个重要的这些细胞的能力。脐带的msc从沃顿商学院的果冻,是以前证明关于UCX细胞产品从ECBIO SA,生长在聚合物更好地模仿组织环境,检查参与组成分泌腺产生了一个丰富的营养因素,如胶质瘤、TGF -βKGF、g - csf VEGF-A FGF-2, il - 6,促进伤口愈合反应,作为证明在体外通过血管生成、促有丝分裂的化验和和的趋化作用在活的有机体内使用趋化性测定msc在哪里显示招聘周围骨髓msc已知直接参与组织再生(44]。这个重要的能力也研究了其他研究小组。杰克逊和合作者,在2012年,被称为,在这种情况下,炎症阶段延长,促炎介质,如myofibroblasts和纤维细胞,将促进非功能性组织的生成,导致瘢痕的形成(45]。msc分泌多种细胞因子和生长因子与肝细胞生长因子(HGF), il - 10,或者可能adrenomedullin,其他效果,抑制当地的免疫系统,增强血管生成(他们生产基本FGF VEGF-A),或抑制疤痕形成的antifibrotic属性(通过前面提到的因素)(45- - - - - -48]。衰减函数的b细胞和自然杀伤细胞,msc可能减少profibrotic反应可能发生巧合与长期炎症伤口愈合(45,49]。这些建议或许可以解释的结果治疗组的胶原蛋白I型量化d15 postmyectomy,,除了团体Floseal车辆,不那么明显的疤痕组织存在于肌肉接受HMSCs或厘米(图3(c))。事实上,Floseal单独显示一个劣质胶原分数(相比MSCFloseal和ConditionedFloseal组),但是这条线的证据显然是一个旺盛的钙化的结果由这个工具,更明显的肌肉,不接受msc与CM(数字3(b) -3(c))。这条线的证据也在ISO 10993 - 6得分,仅在这Floseal还导致了更好的得分的炎症状态(图3(a))。然而,每个人都应该考虑到观察坏死和钙化可能不是正确评估这些分析,这可能实际上歪曲我们的判断这个飞行器的适用性。出于这个原因,止血矩阵(Floseal)被认为是不适合被用作msc的车辆。

一旦msc进入炎症环境中,他们的免疫调节表型变得激活干扰素γ,肿瘤坏死因子α,il - 1β。也有证据表明,msc能够改善急性免疫反应损伤的前面提到的抑制b细胞和自然杀伤细胞(45,49]。令人惊讶的是在这项研究中,HMSCs减少炎症的影响并不显著d15和d35;炎症细胞的数量相比更高控制组。方面的组织学评估在d35 postmyectomy,肌切除术损伤的动物充满了纤维蛋白胶与蜂窝系统相关,它是有趣的观察,HMSCs显然有长期的负面影响慢性炎症(图4)。在d15,条件组织也提出了更好的或类似ISO分数MSC组但Pax7数量的增加⁺细胞MSCFibrin在d15(图组7 (e))可能表明这种影响没有直接联系的质量和学位再生因为我们的半定量评价得分(ISO)仅基于炎症受损肌肉的功能。

Grabowska et al。12先前表明,下在活的有机体内肌肉微环境条件,包括HMSCs只是偶尔到新重建肌管,但他们的存在对受伤的肌肉再生有益的影响。缺乏整合的MSC在宿主组织产生争议的使用和这种无力感兴趣的目标这些细胞组织具有效率高、移植MSC治疗的有效实施的重要障碍(50]。然而,它提出了msc调节宿主环境的间接机制。他们似乎提供了一些旁分泌营养效果复杂信号的传递(部分可能是由Wnt信号调节器)到目标组织而不是参与组织修复作为直接参与者,通过整合在宿主组织(51,52]。已经证实移植msc移植时不要留在受伤的网站也不把其他地区,表明他们的主要作用是有限的信号,启动内源性细胞受灾地区的招聘52]。例如,Wnt信号诱导肌原性的分化能力和促进Sprague-Dawley老鼠的msc的增殖和迁移也被证明(53]。有这个考虑在这项研究中,收集的CM HMSCs扩张文化独立测试,从CM可能包括分泌蛋白在前面提到的发挥核心作用在活的有机体内信号的过程。HMSCs的本地应用程序可能没有所需的治疗效率,因为细胞可以迁移到不同的身体区域和组织或不可能生存和产生适当的营养因素。克服这些缺陷的本地应用程序厘米可以使汽车的生物相容性。

5。结论

治疗组与不同的车辆和HMSCs获得预期结果的肌肉再生,组织学和功能的评估。功能,得出结论,在d35 dorsiflexor,等距峰值扭矩值恢复到类似于完整的肌肉不管治疗选择。我们有信心在考虑到使用手机产品(特别是厘米)不应丢弃是一个可行的临床选择治疗骨骼肌损伤。寻找一个最优的汽车以最少的影响的生物公司与msc从沃顿商学院的果冻或厘米丰富了这种细胞产生的生长因子和细胞因子系统可能的未来关键骨骼肌组织工程和细胞治疗的使用肌肉的缺陷。

信息披露

不存在竞争的经济利益。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者要感谢教授Beatriz波尔图和罗莎博士从Laboratorio de Sousa Citogenetica, ICBAS,大学波尔图,波尔图,葡萄牙、核型分析和博士的帮助若泽•曼努埃尔•科雷亚科斯塔动物设施的西班牙德博士Saude里卡多Jorge-Laboratorio de Parasitologia波尔图。这项研究受到了QREN I&DT集群发展的产品再生医学和细胞Therapies-Projects Biomat &细胞QREN 2008/1372,由欧洲共同体费德基金共同投资通过ON2-O新生Norte-North葡萄牙地区操作程序2007 - 2013,由QREN数量38853/2013——“Solucoes avancadas de regeneracao ossea com基地em hidrogeis de dextrin-DEXGELERATION”项目“混合纳米水凝胶:骨再生使用多功能注射Hydrogels-Rebone”-ENMED / 0002/2010,和程序COMPETE-Programa危险Operacional Competitividade,项目Pest-OE / AGR / UI0211/2011。即阿莫林(SFRH / BD / 76237/2011)承认FCT,葡萄牙基础科技,金融支持。分子病理学和免疫学研究所的大学的波尔图(IPATIMUP)是一个葡萄牙外交部的副实验室科学,技术,高等教育和FCT支持的部分。