增强Adipogenicity骨髓间充质干细胞在再生障碍性贫血

文摘

高脂肪的骨髓(BM)和有缺陷的造血作用是再生障碍性贫血(AA)的病理特点。我们有脂肪形成的调查和BM间充质干细胞的成骨的潜力(BM-MSC) 10 AA患者(08年男性和02女性)平均年龄37年的(范围:06年至79年)和相同数量的年龄和性别匹配控制。是观察BM-MSC AA患者的形态、表型和成骨分化潜能与对照组相似但脂肪细胞分化从AA BM-MSC有更高的密度和更大的脂滴的大小和他们表达的脂联素水平显著升高,FABP4基因和蛋白质比控制BM-MSC (两个)。因此,我们的数据表明,AA BM-MSC adipogenicity增强,这可能疾病的发病机理的重要含义。

1。介绍

再生障碍性贫血(AA)是一种骨髓(BM)失败综合症表现为脂肪BM和周边全血细胞减少症。缺陷在造血干细胞(HSC)在大英博物馆基质与AA的发病机制,但这种疾病的确切原因仍模糊(1]。我们以前所示AA BM细胞凋亡的增加(2[],引发水平3,表达干扰素-λ和肿瘤坏死因子-α在BM t细胞的增加水平BM等离子体(4]。这些研究指向免疫机制和骨髓微环境的作用在疾病的发病机理。间充质干细胞(MSC)的主要干细胞是大英博物馆微环境,产生不同的基质细胞类型包括脂肪细胞,成骨细胞,内皮细胞,间质成纤维细胞在骨髓造血体内平衡和保持信息联系,生产各种造血细胞因子和生长因子(5,6]。AA BM-MSC已被证明有异常基因表达谱(7)和免疫异常属性(8,9]表明AA BM-MSC功能障碍。也是最近报道,脂肪细胞出现在大英博物馆抑制HSC的成熟和分化的脂肪形成的失衡和成骨分化MSC可能大大影响造血作用[10- - - - - -12]。因此,为了进一步探索BM-MSC在疾病中的作用,我们已经评估他们的脂肪形成的和AA患者的成骨分化潜能。

2。材料和方法

2.1。主题和文化BM-MSC和表型鉴定

十个AA患者(12,08年男性和02女性的平均年龄37岁(范围:6到79年),和相同数量的年龄和性别匹配控制在研究招募了。知情同意后,5毫升的BM吸气髂后上嵴的每个主题和BM-MSC孤立,培养和表型特征按照标准协议建立在实验室(13]。第三段的细胞用于实验。

2.2。脂肪形成的分化

BM-MSC在第三段处理脂肪形成的介质组成的DMEM培养基(表达载体)包含10%的边后卫(Hyclone), 500毫米IBMX, 1毫米地塞米松,10毫克/毫升胰岛素和100毫米消炎痛(脂肪形成装备,Chemicon)。18天后,细胞被固定和沾油红O染色细胞中的脂肪滴形象化。

2.3。成骨分化

BM-MSC在第三段处理成骨的介质组成的DMEM培养基(Gibco-Invitrogen)包含10%的边后卫(Hyclone), 1毫米地塞米松,10毫克/毫升甘油醛3 -磷酸,和0.1毫米抗坏血酸(骨生成装备,Chemicon)。21天之后,细胞与4%多聚甲醛固定和染色茜素红染色可视化矿化。

2.4。逆转录聚合酶链反应(rt - pcr)

脂联素的表达,脂肪酸结合蛋白4 (FABP4)和骨桥蛋白是通过rt - pcr。BM-MSC AA患者和控制总RNA提取使用RNeasy微型RNA隔离设备(表达载体)。一个μ克总RNA反转录成cDNA使用随机五个一(表达载体)。基因引物(MWG生物技术,http://www.mwg-biotech.com/)使用如下。脂联素(前锋):5′-AAGGAGATCCAGGTCTTATTGG-3′(反向)5′ACCTTCAGCCCCGGGTAC-3′(加入数字:NM_004797.2);FABP4(前锋):5′-CCTTTAAAAATACTGAGATTTCCTTCA-3′和(反向)5′- GGACACCCCCATCTAAGGTT-3′(加入数字:NM_001442.2);骨桥蛋白(前锋):5′- GGATCCCCAGATGCTGTGGCCACATG-3′和(反向)5′- CTCGAGTTAATTGACCTCAGAAGATGC-3′(加入数字:NM_001040058.1);和β肌动蛋白(前锋):5′-GCTCGTCGTCGACAACGGCTC-3′和(反向)5′- CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC-3′(加入数字:BC016045)。扩增子解决在2%琼脂糖凝胶(Sigma-Aldrich)和照片是获得使用凝胶文档系统(α成像仪,http://www.alphainnotech.com/)。

2.5。西方墨点法

BM-MSC感应处理介质或未经处理的细胞中均质裂解缓冲(10毫米Tris-Cl (pH值7.5),50 mM氯化钠,和1% triton - x - 100包含phenylmethylsulfonyl氟化物(1毫米)和蛋白酶抑制剂鸡尾酒)和离心机在12000 xg 15分钟在4°C和蛋白质含量的上层的估计。100年μ每个样本的g蛋白受到6% sds - page和electrotransferred硝化纤维膜上。细胞膜脂联素与抗体孵化(Abcam), FABP4(研发系统;http://www.rndsystems.com/),骨桥蛋白(Abcam,http://www.abcam.com/),β肌动蛋白(研发系统)其次是孵化HRP-conjugated相应二级抗体。信号检测使用一个增强化学发光检测系统(Amersham生物科学,http://www.gelifesciences.com/)。

2.6。统计分析

结果计算平均数±标准差。控制和再生障碍性贫血患者的区别被学生的评估t以及。

3所示。结果

3.1。形态和表型

AA患者表现出的BM-MSC成形态特征相似的控制。流仪分析表明BM-MSC CD73 AA患者和控制有类似的表达式(%与%),CD90 (%与%)和CD105 (%与%)()和缺乏的CD34的表达,CD45和CD14(图1)。

3.2。脂肪形成的分化和表达的脂肪形成的成绩单和蛋白质

油红O染色的脂肪细胞分化从AA BM-MSC有更高的密度和更大的脂滴的大小,与控制(图2(iA)和(iB))。rt - pcr和免疫印迹分析显示脂联素的表达显著升高,FABP4成绩单和蛋白质,脂肪细胞中分别来自AA BM-MSC比控制()(图2(2)和(3))。

3.3。成骨分化和骨桥蛋白基因和蛋白的表达

AA患者在治疗上的BM-MSC成骨的媒介表现出成骨分化类似于控制如茜素红染色(图所示3(iA)和(iB))。rt - pcr和免疫印迹分析显示,骨桥蛋白的表达无显著差异的基因和蛋白质,分别从BM-MSC AA患者骨细胞分化和控制()(图3(2)和(3))。

4所示。讨论

我们的研究显示,来自AA患者BM-MSC形态、表型和成骨的潜在的控制类似但他们表现出增强的脂肪形成的潜在揭示了更大的规模和更高浓度的脂质滴,高脂肪形成的基因的表达和蛋白质脂肪细胞分化从AA患者相比控制。

在文献中唯一可用的一项研究表明,AA BM-MSC有一个正常的表型和很容易分化成脂肪细胞基因的表达增加adipocytokine信号通路包括TRADD PRKAB2,地蜡,SLC2A1, SOCS3 [7]。这项研究也表明,AA BM-MSC很难分化成成骨细胞但是j·李等人并没有研究成骨基因或蛋白质的表达在细胞分化。我们还观察到一个正常的表型的BM-MSC AA患者和展示了他们增强adipogenicity油红染色的细胞分化以及量化的脂肪形成的基因和蛋白质。然而,我们观察到的骨桥蛋白基因表达和蛋白质类似于控制。另一项研究报道,AA BM-MSC GATA-2较低表达,抑制adipocytic分化,更高的过氧物酶体表达proliferator-activated受体γ促进adipocytic分化(14]。这研究也支持我们的观察增强脂肪形成的AA BM-MSC的潜力。

骨髓脂肪细胞一直被视为空间填充细胞,但最近的一些研究表明,BM脂肪细胞是造血的负调控,与成骨细胞的互惠关系,促进造血作用[11,14]。此外,它也被报道,BM脂肪细胞产生neuropilin-1,脂联素、肿瘤坏死因子-α和每个文件的抑制效应在造血作用[15]。我们已经表明,脂肪细胞分化从AA BM-MSC表现出较高的脂联素的表达和FABP4基因和蛋白质。虽然FABP4的作用在调节造血作用不知道据报道,脂联素可能抑制造血作用。像脂肪细胞是antihematopoietic的有力来源细胞因子TNF -α(15),目前的研究也支持我们之前的观察水平的提高这AA患者的骨髓血浆细胞因子(4]。从而增强脂肪形成的AA BM-MSC可能导致的潜在缺陷在AA造血作用。

总之,我们的研究表明,BM-MSC AA患者拥有一个增强脂肪形成的潜在可能在疾病的发病机制有重要的作用。进一步的研究目标分子机制参与造血抑制脂肪细胞和其他生物学性质的异常BM-MSC AA患者会增加疾病的发病机制和治疗提供一个新的视角。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

库马尔Tripathy和Saurabh普拉塔普辛格贡献了同样的工作。本文作者的贡献如下:Saurabh普拉塔普辛格进行了研究和分析数据,库马尔Tripathy设计研究和写论文,和Soniya Nityanand研究设计,提供试剂、工具和回顾了纸。

承认

这个工作是由一个单位以外的授予批准的生物技术,印度政府,桑娅博士Nityanand (BT / PR6519 /地中海/ 14/826/2005)。

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