功效的局部间充质干细胞疗法治疗干眼综合征的实验模型

文摘

目的。目前的研究是着手解决局部应用治疗效果的间充质干细胞(msc)引起干眼综合症(DES)苯扎氯铵(BAC)的老鼠。方法。老鼠分成两组刚刚建立DES。滴眼液含有溴脱氧尿苷标记msc ()或磷酸盐缓冲溶液()局部每天一次申请一个星期。Schirmer测试,解体时间分数,眼表面的评估测试,角膜炎症指数评分测试应用于所有老鼠在基线和治疗后。所有的老鼠都牺牲了一个星期后组织学及电子显微镜分析。结果。意思是水撕裂体积和泪膜稳定性显著增加大鼠msc治疗()。溴脱氧尿苷标记msc渗透到睑板腺,在msc治疗大鼠观察结膜上皮细胞。数量的增加分泌颗粒和杯状细胞的数量在msc治疗大鼠观察。结论。局部应用msc的可能是一个安全有效的方法治疗DES和可能被用于进一步的临床研究。

1。介绍

干眼综合征(DES)是世界上最常见的眼部疾病之一(1]。尽管DES是一种多因素复杂疾病,炎症疾病在发病机制中起着重要的作用。炎症,无论何种原因,已经观察到在所有阶段的DES (2]。今天,DES的治疗策略包括应用人工泪液治疗隐形眼镜,抗炎药物(包括皮质类固醇和环孢菌素A),和punctal阻塞。最近的研究集中在治疗使用抗炎治疗,表明DES的添加剂应用抗炎药物增强上皮增殖和分化可能是有益的治疗这些患者(3]。间充质干细胞(msc)分化成多种细胞类型,和最近的研究正在探索的多功能性质可以利用这些细胞治疗多种免疫介导性疾病(4]。msc,保护细胞免受损伤,可以直接促进组织修复(5- - - - - -8]。而直接促进组织修复,msc还可以调节免疫系统和减弱过度炎症引起的组织损伤4]。

尽管治疗选择的范围,许多患者仍遭受DES和表现出与眼部表面变化。新的治疗方案应该目标的核心机制,推动DES是DES的永久治愈。干细胞是已知再生效果,归航受伤的网站特点,和分化功能不同的细胞,可能永久地对待DES。因此,在当前的研究中,我们研究了局部应用msc对实验性炎症的影响DES模型大鼠。

2。材料和方法

实验在当前的研究中都是经当地伦理动物研究委员会批准DıskapıYıldırım Beyazıt研究和培训医院(批准ID: 2012/17)和所有程序依法进行下午声明使用动物在医学研究中心在眼科和视觉研究。十六岁的雄性Wistar鼠(220 - 250 g)被用于这项研究。老鼠在标准环境(60±10%相对湿度,温度25±1°C,和交替12 h明暗周期)在整个研究。

2.1。实验过程和分组

只有右眼的老鼠都在研究。基于之前的研究,每个老鼠的右眼是局部治疗,一天两次0.2%苯扎氯铵(BAC) 7天(9,10]。建立DES后,滴眼液含有溴脱氧尿苷标记间充质干细胞()或磷酸缓冲溶液(PBS) ()局部每天一次申请一个星期。在研究结束时,所有的老鼠都牺牲了,每只动物的右眼是无核的组织学分析每组和两个与透射电子显微镜进行了分析。所有试验程序进行麻醉大鼠与氯胺酮的混合物(50毫克/公斤)和甲苯噻嗪(10毫克/公斤)。

2.2。隔离、扩张和眼药水的msc和制备的标签

骨髓取自股骨和胫骨的动物和单核细胞分离的密度梯度法(11]。单核细胞被确定使用流式细胞仪(流式细胞仪石中剑TM (Becton, Dickinson和公司,温哥华,加拿大))在收集细胞的间期。造血干细胞和间充质决定因素(BD Pharmingen圣地亚哥分校)被用于识别。一旦确定,细胞被孵化MCS中、与亚文化传播后成纤维细胞克隆形成单位(CFU-F)成为可见。一些msc停牌和再次确认使用流式细胞仪使用骨骨髓来源间充质干细胞表面因素(CD11b / c (−), CD45 (−), CD90(+),和CD44 (+))。一旦通过,1.5毫升的MSC培养基培养细胞杜尔贝科修改鹰的中低葡萄糖(DMEM-LG)暂停后1.5毫升胰蛋白酶ETDA-C解决方案和整除无菌2毫升cryotubes和储存在−80°C。悬架是由快速解冻解冻方法在局部应用前两个小时。

将骨骨髓来源msc在体外,10μl(溴脱氧尿苷(BrdU)解决方案(1毫米BrdU 1 x杜尔贝科PBS的BD Pharmingen)是精心为每毫升组织培养基添加。细胞培养密度是2×10⁶细胞/毫升和治疗细胞培养2小时。MSCs-treated老鼠,一个25岁μl下降(1×10⁵msc悬浮在PBS)每日的结膜囊鼠申请一个星期()。BrdU检测是由使用BrdU检测设备(BD Pharmingen)来显示BrdU的存在⁺细胞。单个细胞悬浮液沾0.4%台盼蓝细胞生存能力的量化与伯爵夫人自动细胞计数(表达载体)。细胞的生存能力在PBS是85%。

2.3。眼泪体积测量,眼部表面评价(分手时间(但是)、荧光素染色和玫瑰红染色),和角膜炎症指数得分

所有诊断测试之前和之后进行一个星期的BAC应用程序来确认DES和经过一个星期的治疗与msc或PBS。实验过程后,所有老鼠都牺牲和眼部组织是仔细解剖和组织学分析收获,BrdU免疫荧光染色⁺细胞和电子显微分析。眼泪体积测量:眼泪体积测量使用修改后的Schirmer我测试。短暂,拉下眼睑,后一条绘画纸41滤纸是放置在睑结膜交界处附近的中间和外部的第三眼睑。在每个时间点,撕裂的每个老鼠的右眼测量三次眼睛之后开了15秒。的平均长度每条滤纸润湿部分被认为是最终的测量。BUTscoring:在下降1μl荧光素钠在结膜囊,但测量随着时间流逝之间最后一个眨眼,首先随机干斑的外观出现在角膜。重复了三次测量的平均值测量被认为是最后一个但分数。荧光素染色评分:角膜上皮损伤评估应用后90秒1μl下降1%荧光素结膜囊。角膜是分为4个象限,每个象限是独立评估使用以下评分系统:0 =没有染色,1 =略点状的染色(< 30点),2 =点状的染色(> 30点),但是不分散,3 =严重分散染色,但没有积极的斑块,4 =积极的荧光素斑。分数的四象限被添加到最后得分(最高得分是16分)(12]。玫瑰红染色:玫瑰红的分数是衡量使用范Bijsterveld系统灌输1后15秒μl 1%的玫瑰红到结膜囊(13]。结膜区和角膜的强度是得分,分别为:1 + =几分开点,2 + =许多分离的斑点,3 + =汇合的斑点(最高9分)。角膜炎症指数得分:角膜炎症指数评分评估是基于这三个参数:纤毛充血,中央角膜水肿,周边角膜水肿(年级14]。纤毛充血分级在以下范围:0 =没有纤毛充血,1 = < 1毫米,2 = 1 - 2毫米,和3 = > 2毫米。中央和周边角膜水肿评分如下:0 =没有中央角膜水肿,1 =有可见的虹膜信息,2 =现在没有可见的虹膜信息,3 =现在没有可见的学生。每只动物收到炎症指数通过添加这三个参数的分数和除以9倍。盲目的评分进行分数由一个医生。

2.3.1。组织学和透射电子显微镜分析

组织在4%多聚甲醛固定,石蜡。部分被切成5μ部分使用切片机。组织被苏木精和伊红染色()),并使用光学显微镜检查。新鲜角膜和结膜样品固定在2.5%戊二醛在磷酸盐缓冲溶液pH值为7.4 4 h和后缀1 1%锇酸溶液中h 0.1磷酸盐缓冲溶液。经过进一步postfixation、脱水、包埋、切片和染色过程,部分被检查在JEOL jem - 1400电子显微镜和CCD相机拍照(Gatan Inc .,而CA,美国)。

2.4。统计分析

使用SPSS统计分析了Windows 15.0。数据分布被Kolmogorov-Smirnov或Shapiro-Wilk测试评估。值小于0.05被视为具有统计学意义。Mann-Whitney、Kruskal沃利斯方差分析和魏克森讯号等级测试被用于眼部表面的多个比较评估测试团体之间。

3所示。结果

一周后,局部应用0.2% BAC应用DES已经建立两组和已经被眼部表面证实测试。眼表面测试明显减少/从两组基线增加()。

的意思是水撕裂卷,但分数MSCs-treated组显著增加(和、职责),明显高于接受pbs组经过一个星期的治疗和、职责)。角膜上皮荧光素和玫瑰红MSCs-treated组的生活质量得分显著降低(和、职责)经过一个星期的治疗。玫瑰红msc治疗一周后成绩明显低于接受pbs组分数()和角膜荧光素分数低于接受pbs组分数,不显著()(数据1和2)。

虽然意味着炎症指标分数MSCs-treated老鼠减少,不显著(),组间有显著差异就意味着炎症指数分数经过一个星期的治疗)。

有最小的角膜和结膜炎症MSCs-treated老鼠。然而,白细胞浸润扩散(多形核白细胞浸润)为主,观察角膜和结膜的老鼠接受pbs。此外,睑板腺也发炎,充血的血管结构在接受pbs老鼠(图3)。

结膜杯状细胞数量减少观察到接受pbs的老鼠和杯状细胞分泌颗粒数量减少这些老鼠。然而,有结膜杯状细胞数量的增加MSCs-treated老鼠和这些细胞细胞质中含有更多的分泌颗粒。与此同时,有许多微绒毛减少角膜上皮的顶端部分接受pbs的老鼠,和在这些老鼠的眼角膜细胞开始互相分离的迹象,这些细胞的线粒体也增大。细胞损伤和凋亡细胞被观察到的迹象在接受pbs大鼠角膜上皮。微绒毛在顶端部分保存的角膜上皮MSCs-treated老鼠和没有突出的标志这些老鼠的细胞损伤角膜(数字4和5)。

传统的免疫组织化学染色方法被用来量化BrdU渗透⁺细胞(15,16]。简单,三个地区三个部分在所有老鼠都检查×20放大和BrdU计算的数量⁺细胞与其他细胞。在治疗组平均结果是6.7%。局部应用msc大多渗透到睑板腺和结膜上皮细胞。迁移BrdU标记msc是如图6。

4所示。讨论

当前的研究表明,局部的msc可以有效治疗炎症的DES类型。我们所知,这是第一个研究评估的影响局部应用msc在老鼠和DES还显示局部应用msc移植为结膜上皮细胞。炎症是发挥重要作用在任何类型的DES和延续DES的症状2]。在这项研究中,我们使用了BAC诱导DES模型,因为它提供了一个良好的动物模型一般为炎性DES中观察到诊所(9,17,18)和抗炎作用研究局部应用msc在这种类型的DES。msc已被证明有抗炎作用,已成功地用于治疗各种疾病,因为他们的广泛的分化潜能,抗炎和免疫调节作用[19,20.]。最近,一些研究已经进行抗炎msc对角膜损伤的影响。马等人扩大剥夺人类羊膜和msc移植到老鼠角膜化学烧伤。移植后4周,他们表明,msc成功重建受损的大鼠角膜和减少炎症因子矩阵metalloproteinase-2,白介素2、CD45 [21]。这项研究表明,局部移植msc在羊膜能改善炎症和修复角膜损伤的抗炎作用[21]。在另一项研究中,抗炎作用化学烧伤角膜结膜下注射msc的研究,结果表明:结膜下注射msc降低CD 68 +巨噬细胞细胞浸润和表达下调巨噬细胞炎性蛋白1 (MIP-1 mRNA表达水平α)、肿瘤坏死因子-α(TNF -α)和血管内皮生长因子(VEGF)水平,他们推测,巨噬细胞浸润减少是由于MIP-1的表达水平下降α(19,22]。在我们的研究中,一周后局部应用MSC,减少白细胞浸润在角膜和结膜的老鼠和没有观察到显著炎症迹象与组织学和超微结构的分析。微绒毛结构的顶端部分保存的角膜上皮MSCs-treated老鼠和没有突出这些老鼠的细胞在角膜损伤的迹象。这些发现表明,局部应用msc可以减少炎症的抗炎作用BAC诱导DES模型大鼠。

最近,研究表明,msc可以扮演重要的角色在角膜上皮再生和transdifferentiate角膜上皮细胞或基质细胞在不同类型的角膜损伤模型。郭等人显示msc的迁移和分化为角膜上皮和基质细胞移植后的表面化学烧伤角膜的兔子。msc移植角膜conjunctivalization降低,再生和治疗影响化学烧伤兔角膜在这项研究可能分化转移到上皮细胞和抗炎和免疫调节作用23]。在不同的研究中,系统显示移植msc移植到一个受伤的角膜和促进伤口愈合可能分化转移和免疫调节效应的化学烧伤角膜兔模型。他们展示了msc迁移到损伤部位,分化成myofibroblasts24]。在最近的研究中,我们观察到渗透和自导BrdU标记msc睑板腺和结膜上皮。这是第一个研究文献显示迁移BrdU标记msc为结膜上皮和睑板腺一周后局部应用msc。结合我们的研究中,这项工作表明DES与msc治疗已经成为一种很有前途的方法(3]。在这项研究中,局部应用msc有效治疗DES老鼠通过减少炎症和增加上皮细胞复苏,证实了组织学和超微结构的分析。有杯状细胞数量的增加和减少的数量的结膜睑板腺损伤MSCs-treated老鼠。有有限的报道研究使用局部msc治疗其他眼部疾病。Gallazzi等人研究了局部的影响BM-derived干细胞(从雄性老鼠)雌性小鼠的化学烧伤角膜损伤。他们分析了眼角膜解剖和显示男性染色体DNA的存在的干细胞治疗组。他们的数据表明,局部应用造血干细胞迁移到网站角膜上皮的损伤和集成(25]。Agorogiannis等人报道的创伤后持续无菌角膜上皮缺损,耐火材料标准治疗。他们发现,局部应用自体脂肪派生msc帮助角膜溃疡的愈合过程26]。重要的是要注意,这个研究是一个案例报告和结果评估临床结果和迁移的局部管理AdMSCs不是组织病理学确诊。这是本研究的限制因素;在我们的研究中,我们的功能和组织病理学证实了防护,再生,消炎msc和迁移的影响和自导BAC的msc的损伤诱导DES模型大鼠。有研究表明抑制静脉注射msc对炎症的影响,在实验和临床疗效干燥综合征(27,28]。局部应用msc能渗入结膜上皮和睑板腺,可以减少炎症的抗炎作用。这可能是由旁分泌作用,分化,骨髓间充质杯状细胞分化转移的局部转移或腺体细胞,免疫调节效应的msc、转移或刺激受损的结膜杯状细胞的修复机制。在我们的研究中,局部应用BrdU标记msc渗透主要是观察到的基底部分结膜上皮和睑板腺。这可以解释为骨髓间充质损伤部位归航的特点。我们的研究是第一个显示结膜上皮和睑板腺迁移BrdU标记msc和归航的局部应用BrdU标记msc的伤害。这项研究可能为进一步的转化研究开辟新的见解。

我们研究的一个主要的限制是,BAC诱导DES模型并不完全代表DES常见于诊所,因为DES是复杂疾病,有多个复杂的病理生理途径。BAC诱导DES模型有其独特的特点和局限性。这个模型可以合适的研究尤其是炎症类型的DES (10]。我们选择这种类型的DES模型具有纯炎症特征以展示msc的免疫调节和抗炎作用。许多动物模型描述了DES,但在这些模型建立了DES后,动物会在两周内恢复。李等人已经证明了局部应用0.1% BAC的2 - 4周可以成功产生令人满意的和适用的兔模型的DES。林等人表明,BAC 0.1%一个适当的小鼠模型研究BAC诱导的炎性DES。稳定DES模型被确认在兔子,但是我们不知道是否0.2% BAC诱导DES是一个稳定的大鼠模型。这一点应该进一步澄清。本研究的另一个限制是小样本大小和短时间的研究。长期的研究更多的动物将是有用的和相关的扩展msc和BAC的影响在长期的对照组。

总之,DES可以有效治疗局部应用msc。局部应用msc可导致水撕裂体积的增加和改善眼部表面在DES老鼠进行评估测试。局部应用msc是一种安全、简单适用的方法,可以很容易地用于临床研究。进一步的研究与更大的样本量和不同类型的DES模型是需要澄清的确切机制如何局部应用msc治疗效果的节目DES。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

承认

这项研究由“医学研究中心”。

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