文摘

基因修饰的骨髓衍生人类间充质干细胞(hMSCs)使用小分子核糖核酸(大鹏)可以用来改善他们的治疗潜力,使组织再生的创新策略。然而,大多数的研究使用培养hMSCs,尽管这些可能会失去干细胞特征在扩张。因此,我们的目的是开发一个基于表面进行病毒的米尔载体(PEI)绑定到磁性纳米颗粒(基于)在新鲜分离hMSCs有效的米尔交付。基于MNP的转染基因改造是可取的在活的有机体内由于提高选择性,安全交货,减少副作用。因此,在这项研究中不同的米尔/裴和miR / PEI / MNP复杂的配方进行了测试在体外对吸收效率和细胞毒性的影响对一个外部磁场。之后,选择优化的磁性复合物和商用相比磁向量(Magnetofectamine CombiMag)。我们发现所有检测转染试剂米尔摄取率高(收益率超过60%),没有明显的细胞毒性效应。我们的工作可能会传染的关键介绍治疗大鹏以及其他核酸在活的有机体内。此外,在有针对性的干细胞治疗领域的核酸交付之前移植可能allowfor初始细胞调制在体外。

1。介绍

骨髓中人类间充质干细胞(hMSCs)已被证明基于细胞潜力巨大的治疗策略。这些细胞能够分化成各种细胞类型和分泌大量的凋亡,血管生成和免疫调节的因素提供了用于组织修复的可能性1- - - - - -4]。此外,hMSCs具有特定的表达干细胞表面标记(如CD29、CD44、CD73和CD105)和缺乏造血的标记(如CD45, CD117) [1]。此外,结果表明:CD105表面标记(endoglin)是一种适合有效的净化hMSCs从骨髓2]。目前,一些临床试验,涉及hMSCs治疗移植物抗宿主病,软骨和半月板修复,中风,脊髓损伤,和克罗恩氏病,是在进步3]。此外,它最近表明,微rna (miR)为基础的基因修改hMSCs移植前可以显著改善他们的治疗潜力和存活率4- - - - - -6]。此外,大鹏干细胞调控中发挥重要作用通过影响细胞增殖、分化、存活、旁分泌的细胞凋亡和生产要素hMSCs [4,7,8]。到目前为止,几个商用合成大鹏展翅。然而,米尔交付方法适合临床应用将是至关重要的。最初,病毒载体被广泛用于遗传物质转移到目标细胞,因为它们提供转导效率高和长期的基因表达。然而,临床应用基于病毒的基因载体是有限的,因为他们可能会引起毒性、免疫原性、诱变,致癌作用[9,10]。因此,开发各种病毒的方法。病毒的向量检测不到发炎有好处迹象,以有效的非传染性的,和更少的有毒核酸(9]。到目前为止,许多病毒转染运营商基于阳离子脂质和阳离子聚合物在市场上(lipoplexes polyplexes, resp)。,Lipofectamine和表面(PEI)是最好的研究病毒转染试剂对高效核酸转移(11- - - - - -13]。然而,临床应用Lipofectamine和裴限制由于敏感性和安全问题。此外,病毒携带者可以结合磁性纳米颗粒以提高选择性交货和安全以及减少副作用(14]。2002年,谢勒和同事发明了一种新颖的技术称为“magnetofection。“这种技术结合了不同的研究基因传递载体(如逆转录病毒、Lipofectamine和裴)与超顺磁性氧化铁纳米颗粒通过salt-induced聚合。组显示外部应用磁场增强沉积转染复合物,从而提高转染效率在体外和在活的有机体内(15]。基于过去几年,磁铁的转染(例如,Magnetofectamine)已成为一个强大的工具,高效和快速交付的DNA (15,16)以及核(17- - - - - -19]。我们自己的集团已开发出一种顺病毒的核酸组成的向量压缩通过生物素化的裴和绑定到streptavidin-coated氧化铁磁性纳米粒子通过biotin-streptavidin(基于)交互。这些包含复合物MNP,携带治疗性DNA,可以由外部磁场定向感兴趣的网站在活的有机体内(20.]。最近,我们表明转染DNA / PEI / MNP复合物有更高的转染效率培养hMSCs DNA /裴复合物相比,即使没有磁场的应用。我们得出一个更快速和有效的释放磁性DNA复合物相比,裴polyplexes [21]。与DNA /裴复合物,MNP包含复合物没有进入细胞核公布的强劲biotin-streptavidin连接但由于DNA在细胞核周围的地区14]。我们最近这种方法转移到转染hMSCs米尔,后者将其目标mrna的接近原子核。在体外,我们可以证明miR / PEI / MNP复合物有更好的长期压制效应仅仅miR /裴polyplexes相比,这可能是有益的临床应用(22]。

虽然刚孤立hMSCs更相关的临床使用,这些细胞的数量太低,达到预期的效果(23,24]。因此,对于我们的研究,以及临床试验,hMSCs迄今为止被扩大在体外(21,22,25]。然而,在体外扩张的主要hMSCs是昂贵和耗时的过程。此外,这些细胞也有可能失去分化潜能(2和大大减少他们的归巢能力26]。因此,基因改造的新孤立的细胞可能是至关重要的克服这些障碍,使他们没有以前的临床应用在体外扩张尽管他们可用较低的数字。

在这项研究中,我们应用磁病毒载体高效米尔转染新孤立hMSCs和商用相比磁向量(Magnetofectamine, CombiMag粒子)对吸收效率和细胞毒性。我们证明我们的新型磁转染系统不是不如后者对米尔交付和细胞耐受性。

2。材料和方法

2.1。CD105的隔离⁺hMSCs

CD105⁺细胞刚从胸骨骨髓分离。骨髓送气取自患者在冠状动脉旁路移植心脏手术部门罗斯托克大学的如前所述[27]。所有捐助者给他们书面同意使用他们的骨髓为研究提出了根据《赫尔辛基宣言》。

起初,单核细胞(跨国公司)是由密度梯度离心法分离。后来,CD105⁺细胞部分磁隔离使用mac技术根据制造商的指示(Miltenyi研究GmbH, Bergisch格拉德巴赫,德国)。简单地说,1×10⁷跨国公司与20孵化μL (CD105微(Miltenyi研究GmbH) 30分钟在4°C。接下来,悬浮细胞用mac电脑缓冲区包含2毫米EDTA(美国Gibco,卡尔斯巴德,CA), 0.5%牛血清白蛋白(BSA Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),和PBS。随后,磁性标记细胞被加载到一个mac列女士(Miltenyi研究GmbH)和放置在一个磁场MiniMACS分离器(Miltenyi研究GmbH)。后来,积极CD105⁺细胞部分悬浮在间充质干细胞生长培养基(MSCGM、Lonza Walkersville,医学博士,美国)含100 U /毫升青霉素(PAA、Coelbe、德国)和100年μg / mL链霉素(PAA)。孤立CD105⁺细胞被立即用于进一步在体外实验或扩大MSCGM (Lonza) 37°C和5%的公司₂。

2.2。Immunophenotyping CD105的⁺hMSCs

细胞表面标记的新鲜分离和培养CD105⁺hMSCs与反荧光标记抗体CD29-APC, CD44-PerCP-Cy5.5, CD45-V500, CD73-PE, CD117-PE-Cy7 (BD生物科学、海德堡、德国)和CD105-AlexaFluor488 (AbD Serotec, Kidlington,英国)。各自的老鼠同形像抗体作为消极的控制。3×10⁴事件是获得使用BD流式细胞仪LSRII流式细胞分析仪(BD生物科学)和分析与BD FACSDiva软件6 (BD生物科学)。

2.3。CD105的功能分化试验⁺hMSCs

分化的能力执行hMSCs使用人类间充质干细胞功能识别工具(研发系统,明尼阿波利斯,美国)根据制造商的协议。20天后分化条件下,脂肪酸绑定含有脂肪形成的(FABP-4)和骨钙素和成骨分化是荧光标记,分别。核反沾4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI表达载体,卡尔斯巴德,CA,美国)。样品进行了分析使用ELYRA LSM 780作为上课讲义、小点心的显微镜(卡尔蔡司,耶拿,德国)和ZEN2011软件(卡尔蔡司,哥廷根,德国)。

2.4。制备Polyplex转染复合物为基础

基于制备polyplex转染复合物(miR /裴,miR / PEI / MNP、和miR / PEI / CombiMag复合物),Cy3 dye-Labeled Pre-miR -控制编号1(美国Ambion、奥斯汀、TX)监测吸收效率和细胞毒性和Pre-miR microrna的前体分子-控制编号1 (Ambion)测试复杂地层。支表面(MW = 25 kDa, Sigma-Aldrich)是生物素化的如前所述[22)和存储在4.41毫米整除胺浓度在4°C。

最初,miR /裴复合物与不同摩尔比的裴氮和米尔磷酸(N / P比值)准备如前所述[28]。简单地说,米尔和裴稀释在相同体积的5%葡萄糖溶液,混合,在室温下孵化30分钟。

为了形成miR / PEI / MNP复合物,链霉亲和素Magnesphere顺磁性粒子(美国WI Promega,麦迪逊)用和过滤使用450 nm Millix-HV PVDF注射器过滤器(微孔、Tullagreen、爱尔兰)驱动的。MNP滤液在4°C存储在整除。后来,1μg / mL或2μg / mL和基于加入miR /裴复合物和孵化在室温下30分钟。

miR / PEI / CombiMag复杂地层,CombiMag试剂(OZ生物科学,马赛,法国)用了20分钟。后来,0.025μ每1 L CombiMag pmol米尔(0.025μL CombiMag / pmol)与米尔/裴复合物进行混合,在室温下孵化20分钟。在使用前转染复合物都是刚做好的。

2.5。制备Lipoplex转染复合物为基础

基于lipoplex转染复合物的形成(miR / Magnetofectamine复合物),Cy3 dye-Labeled Pre-miR -控制编号1 (Ambion)被用于监视吸收效率和细胞毒性。

起初,miR / Lipofectamine 2000复合物被准备。因此,米尔和Lipofectamine 2000转染试剂(0.05μL Lipofectamine 2000 / pmol米尔英杰公司)分别稀释各25μL Opti-MEM我降低血清培养基(Gibco)在室温下5分钟。随后,米尔和Lipofectamine 2000解决方案在室温下混合并孵化20分钟。miR / Magnetofectamine复合物的形成,CombiMag试剂(OZ生物科学)是用了20分钟。后来,0.025μL CombiMag / pmol混合miR / Lipofectamine 2000复合物如上所述。复合物是孵化20分钟在室温下根据Magnetofectamine指令(OZ生物科学)。在使用前转染复合物都是刚做好的。

2.6。冷凝测定转染复合物

米尔的冷凝裴研究了凝胶电泳。miR /裴复合物准备如上所述,与加载混合染料(Fermentas GmbH,圣Leon-Rot,德国),并加载到2%琼脂糖凝胶含有溴化乙锭。电场的100 V是申请30分钟和图像使用TS成像系统(Biometra GmbH,哥廷根,德国)。

2.7。转染

转染实验1×10⁵新孤立hMSCs每被播种在48孔板。转染复合物准备如上所述,一滴一滴地添加到细胞。之后,细胞治疗和没有磁场的应用20分钟使用一个超级磁板(OZ生物科学)。随后,细胞被孵化24小时37°C和5%的公司₂。

2.8。对吸收效率和细胞毒性的评价

量化的吸收效率,hMSCs转染复合物包含Cy3 dye-Labeled Pre-miR -控制编号1 (Ambion)如上所述24小时。调查细胞毒性,细胞染色与近红外线/病死可固定的死细胞染色工具包(分子探针,尤金,或者美国)。此外,细胞被贴上Alexa萤石488鼠标反CD105(克隆SN6, AbD Serotec) PFA和固定为4%。3×10⁴事件是获得使用BD流式细胞仪LSRII流式细胞分析仪(BD生物科学)和分析与BD FACSDiva软件6 (BD生物科学)。测定吸收效率、生活CD105的数量⁺Cy3-stained (Cy3⁺)细胞生活CD105总细胞数的关系⁺细胞测量。评估复杂的细胞毒性,死CD105的百分比⁺细胞CD105总细胞数的关系⁺细胞被记录。

2.9。统计分析

对所有实验,通过学生的统计分析以及使用SigmaPlot 11.0软件(Systat软件GmbH, Erkrath,德国)。相对表达数据CD标记表达式显示为平均值±标准偏差(SD)。其他值都作为平均值±标准平均误差(SEM)。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果与讨论

3.1。结果

3.1.1。CD105的表征⁺hMSCs

CD105⁺立即hMSCs骨髓中分离的特点是multilineage分化和比表面标记表达式使用前在进一步的实验29日,30.]。调查hMSCs的分化能力,细胞培养在脂肪形成的和成骨分化培养基,分别由荧光显微镜检查。图1说明细胞能够分化成脂肪细胞(图1(一))和骨细胞(图1 (b))。流式细胞仪分析新鲜CD105孤立⁺细胞高表达CD44和CD105,温和的表达CD29、CD45和没有CD73和CD117(数据的表达式1 (c)和1 (d))。此外,我们比较新鲜的immunophenotype CD105孤立的细胞与扩大⁺细胞。培养CD105⁺hMSCs呈现高表达干细胞标记CD29、CD44, CD73, CD105但表达下调表达造血CD45标记和CD117(图1 (d))。

3.1.2。转染复合物的表征

为了检查凝结的米尔裴,凝胶电泳。因此,不同的米尔/与越来越多的裴裴复合物。结果展示了一个锋利的乐队不凝结的米尔,被用作控制(图2(一个))。N / P比值为0.1,0.25,和0.5,米尔与裴部分形成的复合物。由于更大的规模,miR /裴复合物留在槽,不凝结的米尔通过凝胶迁移。然而,米尔信号完全消失在N / P比值大于1。

3.1.3。转染优化miR /裴复合物

为了优化转染刚CD105孤立⁺细胞,polyplexes不同N / P比值(2.5 N / P, N / P, N / P 33)和米尔(5 pmol 10 pmol)使用流式细胞仪进行测试。复合物的N / P比值10加上5 pmol米尔(56%)和N / P比值2.5加上10 pmol米尔(69%)显示最高的吸收效率(图2 (d))。为了增加摄取率,高N / P比值(N / P 33)。然而,N / P比值33没有导致吸收效率的进一步提高。同样,转染复合物的潜在细胞毒性研究(图2 (e))。因此,untransfected细胞作为内部控制坏死细胞(29%),这是反映隔离过程的细胞毒性。转染复合物的N / P比值10加上5 pmol米尔导致适度增加细胞死亡率(17%)相比,控制。然而,polyplexes N / P比值为2.5加上10 pmol米尔控制相比没有显著差异(32%和29%)。然而,增加N / P比值(N / P 33)导致更高的细胞毒性与5 polyplexes pmol米尔(57%)以及10 pmol米尔(55%)。因此,对摄取率最高和最低的细胞毒性,polyplexes组成一个N / P比值10加上5 pmol米尔和复合物的N / P比值2.5加上10 pmol米尔被认为是最佳的成分,用于进一步的实验。

3.1.4。转染优化miR / PEI / MNP复合物

为了增加选择性载体和安全的临床应用,这两个优化miR /裴复合物结合不同MNP数量(1或2μg / mL和基于)。因此吸收速率(数字3(一个)和3 (c))和细胞毒性(数字3 (b)和3 (d))不同的复杂成分以及磁场的影响进行了流式细胞术。磁polyplexes组成一个N / P比值10加上5 pmol米尔有类似的摄取率(76%),而相应的米尔/裴复合物(81%)没有磁场(图的应用3(一个))。此外,这些复合物的细胞毒性进行了调查。磁polyplexes 1或2μg / mL和基于(27%比24%)没有细胞毒性效应相比,miR /裴复合物(30%,图3 (b))。同样,polyplexes组成一个N / P比值2.5加上10 pmol米尔和基于耦合进行了探讨研究。吸收的磁性有1或2的复合物μg / mL和基于(~ 65%),分别相比没有显著差异适当miR /裴复合物(77%)在缺乏磁场(图3 (c))。此外,没有观察到明显的细胞毒性的差异之间的转染细胞(从15%到18%不等)和控制(17%,图3 (d))。此外,磁场的影响进行了研究。然而,没有显著提高吸收效率和减少细胞毒性观察当外部磁场应用(图3)。为进一步的实验中,两个磁性复合物被使用:首先一个N / P比值10加上5 pmol米尔绑定到1μg / mL和基于第二一个N / P比值2.5加上10 pmol米尔绑定到1μ克/毫升和基于。

3.1.5。比较miR / PEI / MNP复合物建立转染试剂

优化磁polyplexes商用电磁矢量比较:Magnetofectamine和CombiMag粒子。因此吸收效率(数字4(一)和4 (c))和细胞毒性(数字4 (b)和4 (d))不同转染复合物使用流式细胞仪进行调查。miR / PEI / MNP复合物的N / P比值10加上5 pmol米尔绑定到1μg / mL和基于显示摄取率高(68%,图4(一))。此外,在吸收效率没有显著差异之间观察到米尔/ PEI / CombiMag(64%)和miR / Magnetofectamine(59%)复合物。治疗和控制细胞之间死亡率相当,介于11%和17%之间(图4 (b))。此外,吸收效率和细胞毒性miR / PEI / MNP复合体组成的一个N / P比值2.5加上10 pmol米尔绑定到1μg / mL和基于调查和相比,转染试剂。miR / PEI / MNP复合物吸收率达到79%,比miR / PEI / CombiMag(56%)和miR / Magnetofectamine(75%,图4 (c))。此外,细胞转染细胞的死亡率(从9%到14%不等)相比没有明显不同的未经处理的控制(9%,图4 (d))。

3.2。讨论

可以提高治疗的潜力hMSCs通过基因改造不同的大鹏(5,6]。我们组最近开发出一种磁性病毒转染载体组成的生物素化的裴绑定到streptavidin-coated基于高效米尔交付(~ 75%),并将结果应用到种植hMSCs [22]。一般来说,可以以multilineage hMSCs分化潜力和比表面标记物的表达(如CD29、CD44、CD73和CD105) (1]。我们先前的研究已经表明,纯化CD105⁺部分扩大hMSCs有有益的作用在心脏组织再生(27]。然而,耗时、昂贵的和潜在的有害的细胞扩张过程可能是可以避免的,因为它曾是被阿斯兰CD105 et al。他们测试⁺细胞刚从骨髓中分离在体外和在活的有机体内。重要的是,这些细胞确实能引起hMSCs扩张后轴承所有典型的属性(2]。同样在我们的研究中,新鲜CD105孤立⁺细胞表现出稍微改变immunophenotype相比hMSCs扩张后(数字1 (c)和1 (d))。然而,我们刚CD105孤立⁺细胞也坚持塑料表面和显示形态和表型的典型hMSCs扩张文化(图1 (d))。此外,我们这些hMSCs橡皮的能力来源于新鲜CD105孤立⁺向脂肪细胞分化细胞(图1(一))和骨细胞(图1 (b)适当的文化条件下)。这显然证实了他们的干细胞特性。因此,我们的研究结果与阿斯兰的报告等。2]。

优化米尔转染刚CD105孤立⁺hMSCs,我们最初测试miR /裴复合物与不同数量的米尔和裴。为了研究各种miR /裴复合物的理化性质,分析了凝结的米尔裴使用凝胶电泳(图2(一个))。结果表明,N / P比值从1到33岁,没有观察到的信号。因此,我们的结论是,一个N / P比值1足以凝结整个的米尔在通信与我们先前的调查结果22]。适当的冷凝米尔是必不可少的有效的交付进入细胞,因为它是保护米尔从早期的酶促降解11]。此外,它可以防止激活先天免疫系统的双链RNA (31日]。

为了建立高效转染复合物在新鲜分离CD105米尔交付⁺hMSCs miR /裴复合物与不同的N / P比值(2.5、10和33)和米尔(5和10 pmol)进行测试(数字2 (c)和2 (d))。先前的实验表明,N / P比值可以显著影响转染复合物的吸收效率(32];因此我们选择了三种不同的N / P比值为优化实验。Delyagina等人表明,N / P比值2.5显示吸收效率最高的质粒DNA在培养hMSCs [21]。我们还证明了米尔是有效地交付使用相同的向量和10 N / P比值和3322]。我们目前的结果表明,米尔与5 pmol /裴复合物提供了吸收效率最高的N / P比值为新鲜hMSCs 10 (56%)。在扩大hMSCs米尔转染相比,我们可以进一步加强米尔吸收新鲜孤立hMSCs通过增加米尔达10 pmol N / P比值为2.5 (69%)。由于低N / P比值,可以降低细胞毒性,并与控制(32%比29%)。使用低N / P比值降低的策略的数量可能有利的裴用于基因的修改。,对于新孤立hMSCs尤其重要,因为他们可能潜在的有毒试剂的反应非常敏感。因此,我们决定使用miR /裴复合物的N / P比值2.5加上10 pmol米尔为进一步的实验和比较复合体组成的一个N / P比值10加上5 pmol米尔是用于我们的以前的工作(22]。

此外,我们结合优化miR /裴复合物具有不同MNP数量,使磁定位转染细胞(图3)。基于以前的工作,miR / PEI / MNP复合物与1μg / mL或2μg / mL和基于调查,因为他们有显著提高吸收效率与控制(75%比50%)(22]。我们目前的调查显示,摄取率无显著差异与不同的成分和细胞毒性的磁性复合物。吸收效率的值与这些之前获得培养hMSCs [22),范围从56%到79%(数据3(一个)和3 (c))。此外,细胞死亡率与控制代表基本的细胞毒性水平由于隔离过程(数据3 (b)和3 (d))。此外,我们研究了磁场对米尔转染到新鲜孤立的细胞。我们观察到无显著差异在吸收效率和细胞毒性细胞转染存在与否的磁场(图3)。这些研究结果与我们之前的协议数据显示有效的质粒DNA转染hMSCs没有外部磁场的应用程序(21]。这种效应可能被这一事实解释了磁场对细胞吸收没有影响或胞内转染机制,正如前面提出的(33]。

此外,我们的性能相比miR / PEI / MNP向量和商用磁转染试剂在新鲜CD105孤立⁺细胞(图4)。因此我们选择磁性复合物组成一个N / P比值10加上5 pmol米尔绑定到1μg / mL和基于作为他们显示好的转染值在新鲜分离和培养hMSCs [22]。此外,我们选择了复合物的N / P比值2.5加上10 pmol米尔绑定到1μg / mL和基于低数量的裴和基于成分促进他们的应用程序。Magnetofectamine联合转染试剂由Lipofectamine 2000和CombiMag粒子和可用于交付不同的核酸在各种细胞类型在外部磁场的存在34]。Lipofectamine是最有效和最佳研究了阳离子脂质,通过静电相互作用可与核酸相互作用自发形成稳定lipoplexes [13,35]。CombiMag粒子也能作为转染试剂结合阳离子聚合物或阳离子脂质(34]。然而,CombiMag粒子Lipofectamine 2000提出的结合是最有效的方法。(34]。我们可以证明miR / PEI / MNP向量能够达到类似于Magnetofectamine接种率和miR / PEI / CombiMag复合物(数字4(一)和4 (c))。此外,细胞毒性的转染复合物与控制指示没有细胞毒性效应的不同病毒复合物在新鲜分离hMSCs(数字4 (b)和4 (d))。

以往的经验显示,我们组病毒和病毒磁性复合物携带标签或治疗可以有针对性的质粒DNA在活的有机体内(20.,36]。然而,因此,不需要进行转染成干细胞。此外,米尔的核酸迄今为止没有被用于感兴趣在活的有机体内目标。这个缺点让我们将我们的方法转移到一个高效的交付米尔到新鲜CD105孤立⁺hMSCs首次使用三种不同的磁性载体系统。所有系统调查了65%左右的标签米尔结合高细胞生存能力。因此,我们在这里介绍一种新颖的载波系统也提供了效率和细胞容忍商用磁转染试剂。

总的来说,各自的特定属性磁性载体为各种应用程序可能会允许直接病毒核酸交付治疗大鹏以及其他在活的有机体内。此外,引入这些核酸在体外细胞移植可以使干细胞调制前有针对性的干细胞疗法。

4所示。结论

在这个报告中,我们成功开发了磁病毒携带者高效米尔转染到新鲜CD105孤立⁺hMSCs。这些磁向量能够达到摄取率高(68%比79%)无明显细胞毒性效应。小说米尔载体的性能相当于商用的磁转染试剂。基于磁性纳米颗粒的米尔转染可能成为重要的优化干细胞的移植,虽然还需要进一步的临床实验。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

安娜·谢德和葆拉·穆勒同样这项工作。

确认

这项工作是支持养格兰特(UR11 041;养/ IV-BM-B35-0010/12);心脏干细胞疗法的引用和翻译中心(BMBF: FKZ 0312138);和土地MV (FKZ v630 - f - 075 2010/183;v630 - s - 075 2010/185)。罗伯特·大卫是脱硫(DA1296/2-1)的支持。