鸡诱导多能干细胞的维持和神经元分化

摘要

多能干细胞具有成为成人体内的任何细胞，包括神经元和胶质胶质。禽干细胞可用于研究问题，如声乐学习，这很难用传统的小鼠模型检查。诱导的多能干细胞（IPSC）是将分化细胞被重新编程为多能干细胞状态，通常使用诱导基因或其他分子。我们最近使用哺乳动物基因成功地成功地产生了禽IPSC的细胞，克服了非酰胺类别中IPSC的产生和使用的限制（Rosselló等，2013）。然而，禽IPSC没有建立最佳的细胞培养条件，以建立长期细胞系，从而研究神经元分化在体外．本文提出了一种有效的维持鸡ipsc样细胞并将其分化为动作电位产生神经元的方法。

1.介绍

多能干细胞是一种未分化的细胞，在成人体内可以分化成任何类型的细胞。它们有两个主要特征。首先，与分化的体细胞不同，干细胞具有自我更新和增殖的能力。第二，它们有能力分化成性质截然不同的体细胞。目前有两种主要的方法可以用来获得或创造干细胞在体外．第一种方法是从早期胚胎中分离出胚胎干细胞。第二种方法是从成纤维细胞等体细胞中诱导多能干细胞(iPSCs)，首次证明可能与四种转录因子的组合:Oct4, Sox2, Klf4和c-myc [1］.

虽然ESC和IPSC都可以分化为体细胞，但两种类型的干细胞之间存在差异，仍然引起IPSCs是否能够完全重新承载多能ES细胞的特征。这些包括IPSCS遗传改变从含有重编程转录因子的病毒载体的整合到宿主基因中[2[表观遗传修饰，如DNA甲基化和组蛋白激活[3.］.即使经过重编程，诱导多能干细胞仍然保留其来源组织的记忆(尽管可能仅限于早期传代)，这可能会限制它们分化为其他类型的细胞[4.那5.］.有时分化限制随着诱导多能干细胞传代数量的增加而减少[6.］.因此，由于ESCs和iPSCs之间可能存在差异，因此验证任何系产生的iPSCs的差异和发育特性非常重要。

鸟类是研究发展的重要生物，包括神经发展[7.］.使用鸡作为模型生物的优点是监测其胚胎发育的能力在ovo.．然而，利用鸟类的研究的限制是，可用于研究细胞功能的细胞系数很少。因此，我们的目标之一是创造可用于研究神经元功能的禽干细胞。对于这一目标，我们最近在使用IPSC诱导转录因子的哺乳动物同源物中成功诱导动物王国的部分IPSC样细胞，鸟类，鱼类和果蝇[8.］.我们可以展示体内在鸟类和鱼类中，细胞的融合和分化，但不能获得稳定的细胞系，存活了许多代。在这里，我们开发了一种新的培养基条件，使我们能够维持这些相同的鸟类细胞超过20次传代，我们能够将它们分化成神经元在体外．

2.材料和方法

起始成纤维细胞和初始IPSC样细胞与Rosselló等人的细胞相同。[8.］.然而，与那项研究不同，在这项研究中，在转导的第一周后，我们将细胞的生长与不同的媒体条件进行了比较。在以前的研究中，在相关的情况下，将提到当前研究中作为制备未发表的研究结果。

2.1。胚胎成纤维细胞提取

如Rosselló等人所述。[8.[获得胚胎成纤维细胞，将新鲜的鸡蛋在37℃下孵育2-4天，在胚胎第12天收集小鼠胚胎。提取胚胎，腹部和头部用镊子分离。将胚胎的其余部分与0.25％胰蛋白酶在37℃下与EDTA（Gibco）的0.25％胰蛋白酶分离，直至获得单细胞悬浮液。然后用KO DMEM（Gibco 10829）加15％FBS（Hyclone）中和胰蛋白酶。将细胞在1500rpm下旋转5-7分钟，吸出上清液。然后将细胞在每个板的15cm细胞培养板中以每块胚胎涂覆，具有KO DMEM加15％FB，分别在5％CO中以39℃（鸡）或37℃（小鼠）温育₂氧气21％的气氛。孵育两天后，将细胞在1：4稀释时传代一次，并如下所述翻译两天后转染或转染。

２.２.诱导多能干细胞转导与培养

如Rosselló等人所述。[8.，鸡或小鼠胚胎成纤维细胞在2i+修饰的培养基中(见下文)，与含有小鼠Oct4, Sox2, Klf4和c-myc基因的STEMCCA病毒载体，根据ViraDuctin慢病毒转导试剂盒(LTV-201) [9.］.我们通常将12-24个独立的成纤维细胞复制到12孔细胞培养板(康宁，3.8 cm)中²)．在CESC介质中转导后一周，然后通过试验和误差在每个条件下的4个独立重复中进行许多不同的媒体条件组合传代，其中五个我们在此报告的比较目的（表1见下文）。由于12-24孔板中的每一个相同的4个孔中的同时进行不同的介质条件，这对实验板，培养箱或其他变量相同进行。

２.３.增长的媒体环境

水牛鼠肝条状培养基+．90％KO DMEM（SIGMA）+ 10％FBS（Hyclone）预处理用水牛大鼠肝细胞进行3天以产生BRL条件介质。然后每100毫升BRL条件培养基，我们加入了以下标准细胞培养成分（总共150mL）：KO DMEM（15mL），FBS（7.5mL），100mM丙酮酸钠（1.5mL），100x无数氨基酸（1.5ml; sigma），100x青霉素 - 链霉素（1.5ml，sigma），100x核苷（1.5ml，millipore），100x glutamax（250 μ.l，life技术）和beta-marptoethanol（190 μ.l，sigma）生成“BRL条件加”媒体，最终浓度如表所列1．该培养基已用于种植鸡原毒细胞（PGCS; [10.)，只是我们省略了鸡血清。

CESC（鸡胚干细胞）媒体．这一媒介基于《Samarut》和《Pain》[11.]这是旨在支持鸡胚的增殖。它用于种植我们初始IPSC的禽细胞，持续到Rosselló等人报告的第5段。[8.］.它由胎牛血清和谷氨酰胺浓度不同的标准培养基组成，并添加LIF (Millipore LIF2010)和以下重组细胞因子(表)1）：RHIL6（PEPROTECH 200-06），RHSIL6RA（PEPROTECH 200-06R），RMSCF（PEPROTECH 250-03），RHIGF1（PEPROTECH 100-11）和rhFGF2（PEPROTECH 100-18B）。来自人（H）和小鼠（M）的LIF和重组细胞因子的目的是抑制分化。

2I +（三个抑制剂）+人生如果媒体我+ (2)．2i+媒介基于[12.-14.含有3种抑制哺乳动物细胞分化的化学物质。标准的3i和LIF培养基包括LIF激活STAT3, CHIR99021抑制GSK3, PD0325901抑制MEK, PD184352抑制FGF受体酪氨酸激酶。我们发现，用抑制tgf - β的A83-01取代PD184352会导致看起来更健康的增殖菌落[13.］.在我们的实验中，我们使用标准媒体条件（除了增加FBS以增加15％之外，因为我们观察到细胞倾向于在15％FBS中更快地增殖），然后加入LIF加上三种抑制剂：PD0325901（HOSEGENT），CHIR99021（及时），和a83-01（tocris biosci）[12.］.

cESC和2i+ Media．这种培养基是cESC和2i+的结合(表1)．我们使用标准介质条件，包括15％的FBS水平，然后加入LIF，2I +（PD0325901，CHIR99021和A83-01），以及以与相同浓度的重组蛋白（RHIL6，RHSIL6RA，RMSCF，RHIGF1和RHFGF2）。以上。

修改的2I +禽电培养基．我们尝试了不同浓度的LIF和2i+分子，得到了一种改良的禽类细胞增殖2i培养基。这个媒体的生成方式与我们的2i+媒体相同1)，但随着LIF的降低(从1000 U/ML到50 U/ML)， PD0325901增加(从0.5 U/ML到50 U/ML)μ.m到1 μ.m），CHIR99021没有变化（3 μ.m），并增加A83-01（从0.5 μ.m到1 μ.该培养基用于培养增殖能力更强的类ipsc鸟类细胞，其持续时间超过了[8.]并且仍然截至本文的时间。

2.4。生成和维护控制鼠标IPSC

我们在房屋小鼠IPSCS冷冻库存细胞用于对照实验。它们根据Rosselló等人描述的协议生成。[8.］.细胞解冻后，用cESC或改良的2i+培养基与鸡ipsc样细胞平行培养。

2.5。细胞培养的成纤维细胞饲养剂的有丝分裂抑制作用

将小鼠成纤维细胞膨胀，胰蛋白酶化，辐照，并储存在液氮中的等分试样中。根据使用前一至五天，根据需要将辐照细胞解冻并镀。从鸡中提取的成纤维细胞在〜70％汇合下镀过夜，在所需的细胞培养板上用于生长鸡IPSC样细胞。然后用丝霉素-C（Sigma M-0503）以10的浓度灭活细胞 μ.g/mL培养基在39°C下保存2.5小时。之后，用1xPBS (Gibco)洗涤细胞3次，并在鸡ipsc样生长所需的培养基中孵育过夜。将鸡的ipsc样细胞胰酶化(Gibco, 25200-056)，然后旋转下来，用新鲜培养基将其镀到有丝分裂灭活的小鼠或鸡成纤维细胞上。

2.6。从成纤维细胞机械提取IPSC样菌落

用0.25%胰酶和EDTA (Gibco)在室温下孵育30秒，同时轻轻地来回摇动平板。然后用改良的2i+培养基中和胰蛋白酶，并将平板置于解剖显微镜下。500μ.L吸管，将干细胞菌落从成纤维细胞中分离出来，虹吸至吸管尖。然后将提取的菌落放入细胞培养板上的孔中，在12孔板或96孔板上，每22.1 mm孔约3-5个菌落，(康宁)用新鲜的改良2i+培养基。提取的菌落在39°C, 5% CO条件下培养为其他鸡的ipsc样细胞₂21%是氧气。

2.7。碱性磷酸酶染色

培养皿或玻璃载玻片上的细胞在室温下用4％多聚甲醛固定在水中10分钟。T.hey were then washed 2-3 times with Tris maleate buffer (30 mM Tris pH 9.0) and stained for alkaline phosphatase activity for 30 minutes at room temperature with freshly prepared solution containing Naphtol-AS-MX-phosphate (Sigma N5000) and Fast Red TR Salt (Sigma F2768) in Tris maleate buffer with MgCl₂（10％）。然后用PBS洗涤它们以停止颜色反应并覆盖含有DAPI（Vector Labs，H-1500）的Vectashield Hardset安装介质。

2.8。神经元分化

我们尝试使用两种不同的协议从鸡的ipsc样细胞生成神经元:(1)Stem Cell Technologies ES-Cult Kit，使用的培养皿胚胎体方法与所描述的完全相同(Stem Cell Technologies, Cat#28706;生产终止);(2)带修正的微分法[15.］.使用2媒体补充剂，N2（Gibco 17502-048）和B27（Gibco 17502-048）的修改通常与LiF（白血病抑制因子）组合使用以维持Esc和祖细胞的多能性。LIF是培养条件的主要成分，有助于细胞保留其未分化状态。没有生命的N2和B27用于保持神经元培养物并刺激干细胞和祖细胞以区分为神经元。对于Lee等人使用的方法。[15.]，有三个步骤。（1）我们首先在6cm的培养皿中形成了胚状体(EBs)，其中包含了用0.25%胰蛋白酶加EDTA (Gibco)胰酶处理过的ipsc样细胞。胰蛋白酶被淬火，细胞以1500转/分的速度旋转。然后这些细胞被重悬进去胚状体形成媒体(见下文)和镀在超低贴壁6孔细胞培养板(干细胞技术，Cat#27145)大约10^6.每孔接种4天。细胞在2天内聚集形成EBs，培养4天以上时，EBs开始出现偶有节律的心脏样跳动。每孔细胞浓度的增加增加了EBs的大小和数量。（2）在EB形成4天后，将它们小心地转移到15ml管中，并通过重力沉降到管的底部。小心地吸出培养基，以免干扰EBS。然后重新播入EBS过渡媒体(见下文)，并被镀到聚l -鸟氨酸和层粘连蛋白涂层玻璃覆盖物上(BD BioCoat, 1232C71)，在24孔细胞培养板上复制。经过2 ~ 3天的培养，EBs完全附着在封面上。（3）然后我们继续培养细胞N2B27神经元分化培养基(见下文)7-10天获得功能神经元。根据需要将2/3的培养基替换为新鲜的N2B27培养基。

胚状体形成媒体．这是不含细胞增殖抑制剂的标准培养基1)．标准成分比浓度为KO DMEM(81%)、FBS(15%)、丙酮酸钠(1 mM)、非必需氨基酸(1 mM)、谷氨酰胺(1 mM)、-巯基乙醇(0.005 mM)和青霉素/链霉素(1 mM)。

过渡媒体．此培养基是标准培养基1:1的混合物1，从KO DMEM到青霉素/链霉素）和基于LEE等人的N2B27神经分化介质。[15.，但不含维甲酸。N2B27培养基由N2和B27培养基1:1混合制成，使用前分开存放。N2培养基由DMEM/F12 (99%， Gibco)、N2 (1%， Gibco 100x)和BSA (0.01%， Fisher)组成;B27由神经基底中膜(96%，Gibco)、B27 (2%， Gibco, 50x)、谷氨酰胺(1 mM)、青霉素/链霉素(1 mM)和-巯基乙醇(0.005 mM)组成。所有成分的最终浓度1:1混合过渡媒体N2B27和标准媒体KO DMEM(40.5%)的边后卫(7%)、丙酮酸钠(1毫米),不必要的氨基酸(1毫米),Glutamax(1毫米),beta-mercaptoethanol(0.005毫米),青霉素和链霉素(1毫米),DMEM / F12(24.5%)、氮气(0.25%,Gibco 100 x) neurobasal媒体(24%),B27 (0.5%， Gibco 50x)。

N2B27神经元分化介质．该培养基与上述N2B27相同，具有最终浓度的DMEM / F12（49％），N 2（0.5％），BSA（0.005％），神经缺卵培养基（48％），B27（1％，Gibco 50x），谷氨酸（0.5mm），青霉素/链霉素（1mM），β-巯基乙醇（0.005mm）。

2.9。免疫细胞化学

玻璃盖上的分化神经元用4%多聚甲醛水固定15分钟，用1x PBS冲洗。然后用0.3% triton X-100和1x PBS在室温下渗透细胞30分钟，用适当的血清或1% BSA在室温下封闭细胞1小时。用一抗(NeuN, Millipore MAB377;MAB1637 TU-20,微孔;或Nestin, Millipore, MAB353)在PBS中1:100稀释1小时，然后二抗1:1000稀释1小时:NeuN与AlexaFluor488荧光二抗(分子探针)偶联;TU-20和Nestin与抗小鼠IgG二抗(Sigma, A3562)偶联，然后与耐牢蓝RR盐(Sigma FBS25)反应。然后将细胞生长的覆盖层安装在含有DAPI的Vectashield安装介质的玻片上。我们量化NeuN标记细胞的数量，方法是在一个100倍的视图中，从三个独立的重复中计数所有的细胞，将该数量除以总DAPI标记细胞，然后取平均值。

2.10。电生理学

将带有活神经元的盖玻片转移到包含标准细胞外溶液的记录室中（以mm：140 NaCl，3kCl，2 CaCl。₂，1.25 mgcl.₂，1.25 nah.₂宝_4.，20 d-葡萄糖和10个hepes）。使用直立显微镜（Olympus BX51Wi与Lumplfln40xW目标）的DIC光学来建立全蜂窝录音。记录移液器的电阻范围为3至6MΩ，串联电阻<20mΩ。用Axoclamp 700b放大器和Digididata 1440（分子装置）测量和获取数据。内部电极溶液，IN mm，135k葡萄糖酸盐，2 mgcl₂，2 mgATP，0.5 nagtp，0.5 EGTA，10个HEPES和10个磷酸官（pH 7.35）。通过电流注射驱动细胞以测试作用电位的存在。

2.11。定量实时PCR

用标准试剂盒(Promega SV总RNA分离系统，Z3105)将细胞纺丝并提取RNA。在我们改良的2i+培养基条件下培养鸡的ipsc样细胞，对照组成纤维细胞在相同的培养基中生长，分化的鸡神经元在分化培养基中生长。RNA使用NanoDrop 2000c (Thermo Scientific, Waltham, MA)进行定量，并在−80°C中存储。产生互补DNA (cDNA) (10μ.L 2x RT缓冲液1 μ.L 20x上标II酶;应用生物系统）使用MJ Tetrad系统运行逆转录循环（循环：37℃，60分钟，95°C 5分钟，4°C保持）。然后使用CDNA作为模板，以使用Biorad CX96实时机使用具有定制Taqman引物探针（由应用的生物系统产生）或定制引物的基因表达测定，或者用1 μ.L SYBR绿色(BioRad)，在20μ.l含有1的反应 μ.l模板（〜2 μ.G/μ.l），10 μ.L 2x基因表达大师混合(BioRad, Hercules, CA)。为了区分神经元和干细胞基因的相对表达，我们利用非重叠序列对小鼠和鸡进行了不同的引物筛选。探针包括鸡特异性Nanog (Gene ID NM_001146142.1, 5 ' -CAGCAGACCTCTCCTTGACC-3 '， rev引物3 ' -TTCCTTGTCCCACTCTCACC-5 ')、Oct4 (Gene ID NM_001110178, 5 ' -GGGAAGATGTTCAGCCAGAC-3 '， rev引物3 ' -GTCTGGTTCTGCAACCGGCG-5 ')和Sox2 (Gene ID NM_205188.1, 5 ' -TTTCCTAGGGAGGGGTATGAA-3 ')、Sox2 (Gene ID NM_205188.1, 5 ' -TTTCCTAGGGAGGGGTATGAA-3 ')。rev引物3 ' -GCAGAGAAAAGGGAAAAAGGA-5 ')测定鸡ipsc样细胞的干性;克莱斯勒(双肾上腺皮质激素基因ID NM_204335 5 -CGCTGAAAACCGCTTCAGAT-3,引物3 -ACTGCTCGAGGTCCCATTTG-5)牧师,巢蛋白(基因ID NM_205033.1 5 -GCAGAGCCAGAGCGCACCAA-3,牧师引物3“-CAGGCTCAGCCCCACTGTGC-5”),和beta-tubulin三世(基因ID NM_001031598 5 -GGCCTCCTCTCACAAGTACG-3,牧师引物3 -AAATGAAGTTGTCGGGGCGG-5)神经特异性;GMFB (Glia mature Factor B, Gene ID XM_418091.4, 5 ' - cgggcaggatggattttctct -3 '， rev primer 3 ' -GTACTCATTGGCCTCGTGCT-5 ')的胶质细胞特异性。所有引物均经过测试，效率均在90%以上，符合MIQE指南[16.］.每孔含有10倍RT缓冲液(200 mM Tris-HCl/pH 8.4;500mm氯化钾)，25mm氯化镁₂，1 μ.L cDNA产物，10 mm DNTP和ITAQ DNA聚合酶。RT-PCR的循环条件如下：48℃，10分钟，95℃10分钟，其次为40℃，持续40℃，持续15秒（变性）和60℃，1分钟（退火）。为每个引物组，探针和端粒酶测定运行无模板控制分析。每种样品运行18S rRNA内源性对照（Taqman Man Primer：Cat＃真核18s RRNA HS9999901_S1;应用生物系统）。所有反应均在Quintuplets中进行。结果将结果归一化至内源18S rRNA表达（ABI）和使用DDCT方法对对照组的基因表达水平进行归一化[17.］.对每个物种内基因表达的变异进行了方差分析。统计意义在．

2.12。MTT测定

用标准试剂盒进行MTT测定（Promega SV细胞滴度96非酰基活性细胞增殖测定，G4000）。在改性的2I +培养基中生长鸡成纤维细胞和鸡IPSC样细胞。在每篇通道之后，将细胞孵育24小时，并将试剂糖染料溶液加入到每个孔中，并在37℃下每试剂盒培养4小时。然后，每种方案加入溶解缓冲液并孵育过夜，并在570nm处读取吸光度。

结果

３．１．鸡ipsc样细胞的维持

我们研究的第一部分的目的是找到允许我们在第五段中发展禽类IPSC的细胞的条件，我们在CESC媒体中遇到困难[8.］.我们尝试了不同的培养基条件，包括从Bertrand Pain获得的鸡胚胎干细胞，从Marie-Cecile van de Lavoir获得的鸡原始生殖细胞，以及我们自己获得的鸡iPSC。在这里，我们报告了五种培养基条件，以之前在cESC培养基中生长的类ipsc细胞为基准，进行比较。在我们的常规方案中，将鸡胚成纤维细胞转染含有四种诱导小鼠转录因子的STEMCCA盒，并以未转染的鸡胚成纤维细胞作为对照，在标准培养基条件下复制12-24孔。1周后，细胞传代一次，然后转移并在四种抑制分化的培养基条件中的一种中进行最初的维持:brl条件下的Plus、cESC、2i+、cESC和2i+(表)1：见部分2用于详细的媒体组成）。以前的研究结果显示了，我们自己的结果已验证（未示出）BRL条件[18.]及cESC传媒[11.]足以分别维持鸡原毒细胞（PGC）和鸡胚，并且2I +培养基足以维持小鼠干细胞在体外[12.］.

在我们的实验中，在所有培养基条件下，鸡细胞在第1 -2代开始形成小的ipsc样的增殖细胞集落(图)1），而成纤维细胞没有。然而，在第2和第5段之间存在条件之间存在差异（表中的量化2)．在brl条件下的培养基中，菌落很小，颜色很暗，看起来很差，所有的菌落都在第2代(几周内)迅速衰老。衰老的特征是看到少量到没有剩余的菌落或增殖细胞。在cESC和2i+培养基中，细胞持续到第4代，但只有~ 50-70%的重复，到第5代时全部细胞衰老(表1)2)．细胞在cESC + 2i+中并没有更好的生长，因为只有大约50%的细胞能存活到第6个传代然后停止生长(表)2)．然后，通过系统地降低和增加抑制剂，我们通过LIF产生了许多其他修改2i +介质（2i + mod）（0.5 μ.M递增）在媒体中。我们在鸡IPSC样细胞上测试了培养基的不同配方，我们可以清楚地识别哪种媒体通过第3或第4段辅助细胞的增长。我们发现降低了LIF和增加了两种抑制剂（PD0325901和A83-01）导致鸡菌落与第1段（图）相比，第二段经常出现更健康，更大的鸡菌落（图1(e))，生长超过20段(至表中第8段)2）以与我们的鼠标IPSC控件类似的速度（表2)．我们的小鼠ips细胞在cESC和改良的2i+培养基中增殖良好2)，说明用cESC培养基与鸡的差异可以反映物种差异。

与其他媒体条件不同，我们发现通过三个不同的阶段重复开发的修饰2I +介质中鸡IPSC样殖民地的形态。当首先转导细胞时，菌落表现出明显的圆形形状，具有深色的着色中心（图2(a))，即代表鸡胚胎干细胞的形态[8.］.经过大约4-5次通道后，当其他媒体条件的菌落开始参见Senesce时，改性的2I +培养基中的菌落失去了它们的色素沉着，成纤维细胞开始出现在殖民地的周围周围（图2(c))。随后的菌落在没有成纤维细胞的情况下以稳定的速度开始生长(需要每2-3周稀释1:2)，然后在几天后出现成纤维细胞。当我们用500机械去除周围的成纤维细胞时μ.l移液管（)，此时细胞停止增殖。当我们将它们置于经丝裂霉素c处理或辐照的小鼠或鸡饲料成纤维细胞(每一个)，干细胞样细胞的增殖甚至更显著地下降。因此，我们能够维持生长的唯一方法是让细胞在改良的2i+培养基中在生长阶段生成外周成纤维细胞。然而，在第8-9代后，大多数菌落(>65%±12%)开始失去成纤维细胞的发育和圆形形态(图2（e）），虽然甚至在我们的常规小鼠IPSC和ESC中，培养孔中仍有少量分化的成纤维细胞样细胞。最后，在大约第12段之后，细胞菌落开始以类似的速率（每〜7天稀释1：4稀释）以类似的小鼠IPSCs和增殖的形态，并且如小鼠的文献中所报道的[3.］.到目前为止，我们已经能够维持鸡IPSC样细胞的这种通道率超过一年，而不是每2-3周的1：2稀释以进行前一阶段。整个三个阶段的所有菌落仍然染色碱性磷酸酶（图2（b），2（d），和2(f))和表达内源性鸡干细胞诱导基因同源物(也见Rosselló等人[8.]）;周围的成纤维细胞没有染色碱性磷酸酶。因此，我们的修改2i +禽流群+媒体始终如一地实现了我们创造持续增长和禽类般性IPSC细胞的条件的目标。

整个三个阶段的菌落也表达了干细胞诱导基因的内源性鸡同源物（图3.;另见Rosselló等人。[8.])，并在最后阶段具有正常的核型(见Rosselló等[8.]）。在这里，我们检查了高增殖的菌落。使用QRT-PCR与3个鸡特异性探针已知与多能性相关联，我们发现相对于非诱导的成纤维细胞，高增殖的鸡IPSC样细胞仍表达高水平的内源性纳米，OCT4和SOX2（图3.）;内源性KLF-4低，如普通鸡ESC的早期阶段（图3.;[8.]）。因为用OCT4，SOX2，C-MYC和KLF-4的小鼠同源物转导鸡IPSC样细胞，所以鸡同源物的显着增加，包括Nanog，Nontronsuce的基因，表明内源性多能机械仍然存在整个最后阶段都活跃。类似地，MTT测定表明鸡IPSC样细胞保留了显着高的增殖（代谢）能力（图4.)．

3.2。鸡IPSC样细胞的神经元分化

我们采取了经过修饰的2I +培养基中的第五，第8，第12和第20次通道的细胞，并试图将它们分化为神经元。我们首先尝试了由干细胞技术开发的议定书，ES-CULT技术（干细胞技术，猫＃29706;终止），但虽然它们能够产生鼠标的神经元样，但分化的小鼠细胞的密度是稀疏和禽胚胎体（第一步）难以连接到板材。然后我们尝试并修改了Lee等人的方法。[15.，不添加维甲酸，并使用我们的禽类标准培养基组成。我们发现，在这种改良的神经分化培养基中，鸡的ipsc样细胞经历了五个不同的分化阶段。

在第一阶段，当鸡肉IPSC样细胞（图5.（a））被置于胚胎体形成介质和超级粘附板上，它们从板的底部脱离，变为色素，并形成三维球，即，EB（图5.(b))。当这些EBS被置于玻璃盖玻片上的神经元过渡介质中，用多L-鸟苷和层粘连蛋白持续数天，它们附着在盖玻片上并开始变平并展开（图5.(c))。然后将它们置于N2B27培养基中，在接下来的7天内，细胞迁移离开EB并开始形成神经突(图)5.（d））。在N2B27培养基中12至14天后，这些差异细胞显示出明显的神经元形态（图5.（e））。在原始EBS中剩余的细胞本身呈神经缺卵状形态，具有玫瑰花状结构（图5.（d）;[19.]）。

我们发现已经在第7天表达了鉴别细胞（图6.（i）），神经元核抗原[20.］.这甚至是一些尚未具有明显神经元过程的细胞的情况，表明细胞是神经元前体。标记的细胞倾向于远离神经缺卵细胞（图6.（F））。Neun染色（绿色）和DAPI核染色（蓝色）的分致化表明抗原主要在细胞的核中正确表达并在细胞质中的较小程度上表达（图6.（手6.（一世）;[20.]）。在此阶段，标记的Neun细胞的密度为56％（±11.6％），用于从第5或第8段分化的细胞，56.3％（±5.46％），用于与第12和第20段分化的细胞。相比之下，仅具有在类似密度的起始鸡IPSC样细胞的孔具有在整个井中的0到2个标记的细胞之间。

在神经元分化的14天后，为Nestin，中间丝蛋白染色的细胞，即优先在神经元SOMA的细胞质中表达（图7.(c))21，并对β -微管蛋白III (TU-20)进行染色，该蛋白可标记神经元微管，常表达于神经元轴突和树突(图)7.（d））。TU-20标签允许我们可视化神经元过程，可以看出，可以看出细胞通过这些过程在盖玻片上的长距离上通过这些过程彼此形成的连接或至少接触（图7.（d））。这么长的过程仅在较旧的文化中从大约14天内看到。起始的鸡IPSC样细胞没有显示出分化的过程，并没有为Neun，Nestin或Tu-20染色（图6.（c）和数字7.（a）和7.(b))。这些结果表明分化的细胞表现出神经元形态和抗原在起始细胞中不存在。

通过鸡IPSC样细胞中的神经元标记物，巢蛋白和β-微管III的神经元标记物的神经元的QRT-PCR进一步支持分化细胞的神经元相同。（图3.)的相对表达明显高于iPSC和成纤维细胞或iPSC样对照。我们还发现，与成纤维细胞和cipsc样细胞相比，分化细胞中胶质标志物胶质成熟因子beta (GMFB)的表达显著增加。这表明，除了神经元外，一些鸡的ipsc样细胞可能在我们的神经元分化培养基中分化成胶质细胞。

接下来测试分化的细胞是否表现出神经元的膜兴奋性特征。我们在视觉控制下从培养的细胞中记录了全蜂窝录制，选择具有多极神经元形态的细胞（图8（a）)．在我们修补夹紧的4个细胞中，3表现出强大的动作电位。与神经元表型一致，分化细胞在-68和-65mV之间具有高稳态静止膜电位。然后我们以当前钳位模式注入去极化电流，以评估动作潜在射击的存在（图8 (b))．这一过程持续地产生一系列超调动作电位，其诱发阈值约为- 40至- 33 mV，其高度为78至86 mV。峰值迅速(宽度在半最大值，1.5毫秒)，也显示明显的后超极化(图8 (b)和8 (c))．超极化电流注入产生膜电位的分级变化，表明输入电阻为433megaohms。我们从显示出类似的烧制属性中记录的每个多极细胞。因此，分化的IPSC样细胞显示出若干电生理学特征，其指示神经元细胞类型。

4。讨论

我们的研究表明了产生和维持鸡IPSC样细胞的有效方法，并将它们分化为神经元。研究结果表明，在少量段落中获得细胞的困难不一定是因为细胞是否是IPSC，而是由于特异性的媒体条件。然而，我们的结果还表明媒体条件可以帮助从潜在部分到更高增殖的重编程状态的过渡细胞。我们的鸡肉IPSC样细胞维持在改性的2I +禽培养基中，通过三种不同的形态阶段被传代，增长缓慢，与分化成纤维细胞的增长更快，以少量成纤维细胞快速生长。我们假设周围的成纤维细胞与IPSC样细胞分化，并在早期阶段中帮助维持增殖干细胞，如一些人所证明的[22鼠标esey线[23］.这很可能是为什么维持人类干细胞的协议受益于细胞与成纤维细胞共培养的原因[22］.在这种情况下，据认为，通过不对称分裂，干细胞创建它们自己的利基，用于区分饲料细胞，其允许进一步增殖干细胞。在小鼠和鸡饲料细胞上缺乏我们的鸡细胞的生长表明，自我衍生的鸡成纤维细胞可能产生特异性的鸡干细胞的因素。总体而言，不同的阶段表明，在合适的条件下，IPSC开发可能是逐步的过程。我们不知道鼠标和鸡之间的物种差异反映了哺乳动物和鸟类之间的差异，但一些初步结果表明这可能是至少部分的情况;正在进行的实验，维持我们从斑马雀（Songbird）产生的IPSC样细胞（Songbird）表明我们改进的2I +中的雀细胞比其他介质（未发布的观察）更增殖。

我们在本文中遇到的一个主要发现是，当我们在培养基条件下减少近20倍的LIF时，细胞增殖能力增加。LIF被认为是一种反分化因子，它是干细胞维持其多能性所需要的，去除LIF会启动干细胞分化[24那25］.我们发现，当我们减少培养基中的LIF量时，一些鸡肉IPSC样细胞将分化并形成更多干细胞将进一步增殖的乳蛋白。我们认为这是鸡IPSC样细胞中看到的转化的原因，以完全永生化。类似地，我们通过替换抑制FGF受体酪氨酸激酶的PD183452，抑制TGF-Beta的A83-01，并发现这对于培养鸡肉和小鼠IPSC样细胞的倾向替代，因此抑制FGF受体酪氨酸激酶的PD183452远离标准的3I培养基。13.］.通过用更有效的MEK抑制剂PD0325901替换PD184352，Ying等人。发现CHIR99021和PD184352的“2I”组合在维持多能小鼠ES细胞方面具有高效。丁和同事介绍了A83-01，TGF-kari，Alk4和Alk7的选择性抑制剂，产生大鼠和人IPSC，其自更新状态更接近小鼠ES细胞[26］.与小鼠ES和iPS细胞不同，在2i培养基中生长的大鼠和人iPS细胞仍然可以分化，添加A83-01成功地阻止了分化。这意味着与小鼠外胚层干细胞不同，更像大鼠和人的诱导多能干细胞，鸡的诱导多能多能干细胞需要激活，而不是抑制tgf - β /激活素途径。

从鸡IPSC样细胞中，我们能够在3阶段中反复产生产生神经元的动作潜在的神经元，这在最后阶段花了14天，以变得成熟和功能活跃。另一项研究与我们并行进行了[27能够将鹌鹑IPSC样细胞分化为具有神经元结构的细胞中，但如果这些细胞具有功能性并未测试。14天与晚期妊娠日老鼠或小鼠的原发性胚胎神经元等同于原发性胚胎神经元（在10到14天之间）在体外使小鼠干细胞成为能够发出动作电位的神经元[15.］.因此，这最后一个阶段相当于出生后的神经元成熟;前几个阶段是妊娠期神经元的前体发育。

5。结论

该研究有助于进行逐步的一系列实验，表明可以产生非含糊的IPSC样细胞并控制它们的分化在体外．禽IPSC样细胞进入神经元的分化为从移植到另一种物种移植到另一种物种中研究命运和神经元的功能的可能性。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

作者感谢伯特兰痛苦和Marie-Cecile van de Lavoir鸡胚胎干细胞样本,讨论,和协议的一些媒体条件下,和增加克莱因公爵病毒载体的核心high-titer慢病毒制剂,理查德·穆尼使用他的实验室空间和设备的电生理学记录,Malavika Murugan请求协助录音，Michael Bader请求使用他的实验室空间，Natalia Alenina请求提供细胞增殖实验的协议和讨论。他们也感谢一位匿名评论者对改良的2i培养基对鸡细胞和小鼠细胞的影响的解释。本研究是对戴瑞本科生荣誉研究论文的部分完成。该项目得到了美国国立卫生研究院院长先锋奖和HHMI对Erich D. Jarvis的资助，P30NS061789 (UH)，波多黎各大学医学院的种子基金(400100420002)，杜克大学本科生研究支持办公室和DAAD RISE对Dai Rui的资助。

参考

1. K.Takahashi和S. Yamanaka，“通过定义因子诱导小鼠胚胎和成人成纤维细胞培养的多能干细胞”，“细胞第126卷第1期4，第663-676页，2006。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
2. F. Soldner, D. Hockemeyer, C. Beard等，“不含病毒重编程因子的帕金森病患者来源的诱导多能干细胞”，细胞第136期5, pp. 964-977, 2009。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
3. N. Maherali, R. Sridharan, W. Xie等，“直接重编程成纤维细胞显示全球表观遗传重塑和广泛的组织贡献，”细胞干细胞，卷。1，不。1，pp。55-70,2007。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
4. J. M. Polo, S. Liu, M. E. Figueroa等人，“细胞来源类型影响小鼠诱导多能干细胞的分子和功能特性，”自然生物技术第28卷第2期8，页848-855,2010。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
5. K. Kim, A. Doi, B. Wen等人，“诱导多能干细胞中的表观遗传记忆”，自然，卷。467，没有。7313，pp。285-290,2010。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
6. R. Lister，M.Pelizzola，Y.S.Kida等，“人类诱导多能干细胞中的异常表观胶质重编程的热点”，自然，卷。471，没有。7336，pp。68-73,2011。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
7. C. H. Waddington，“原始条纹的诱导及其在小鸡中的衍生物”，实验生物学杂志，卷。10，pp。38-46,1933。查看在：谷歌学术搜索
8. R. A.Rosselló，C.-C。陈，R.戴，J. T.霍华德，U. Hochgeschwender，和E. D.贾维斯，“哺乳动物基因诱导在非哺乳动物脊椎动物和无脊椎动物物种部分重编程的多能干细胞，”el，卷。2013年，没有。2，2013年物品ID e00036,2013。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
9. C. a . Sommer, M. Stadtfeld, G. J. Murphy, K. Hochedlinger, D. N. Kotton，和G. Mostoslavsky，“使用单个慢病毒干细胞盒诱导多能干细胞生成”，干细胞，卷。27，不。3，pp。543-549，2009。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
10. M.-C。van de Lavoir和C. Mather-Love合著的《鸟类胚胎干细胞》酶学方法，第418卷，第38-64页，2006。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
11. J. Samarut和B. Pain，“鸡胚胎干细胞的活性无视黄酸培养基”，美国专利，编辑，2000。查看在：谷歌学术搜索
12. H. Kiyonari，M. Kaneko，S.-I。ABE和S.Aizawa，“FGF受体，ERK和GSK3的三个抑制剂，具有高效率和稳定性的C57BL / 6N小鼠菌株的种系主胚胎干细胞”创世纪，卷。48，没有。5，pp。317-327，2010。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
13. 问：L. Ying，J. Wray，J. Nichols等，“胚胎干细胞的地面状态自我更新”自然第453期7194，页519-523,2008。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
14. X.元，H. Wan，X. Zhao，S. Zhu，Qu，S. Zhou和S. Ding，“Zhou和S. Ding”简介：合并化学处理使Oct4诱导来自小鼠胚胎成纤维细胞的重编程，“干细胞，卷。29，不。3，pp。549-553，2011。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
15. S.-h.Lee，N. Lumelsky，L. Studer，J.M. Auerbach和R. D. Mckay，“高效地产生中脑和来自小鼠胚胎干细胞的后脑神经元”，“自然生物技术第18卷第2期6，页675-679,2000。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
16. S. A. Bustin, V. Benes, J. A. Garson等人，“MIQE指南:实时荧光定量PCR实验发表的最低信息，”临床化学，卷。55，不。4，pp。611-622，2009。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
17. K. J. Livak和T. D. Schmittgen，“使用实时定量PCR分析相对基因表达数据和${\text{2}}^{-\delta .\delta .C_{\mathrm{T.}}}$方法。”方法，卷。25，不。4，pp。402-408,2001。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
18. M.-C。Van de Lavoir和P. A. Leighton，长期培养禽流族原始生殖细胞（PGCS），U.基因，编辑，origen治疗，埃米德维尔，加利福尼亚州，美国，2006年。
19. C. S. Goodman和N.C.Spitter，“鉴定神经鼻窦的胚胎发育：从神经细胞的分化为神经元，”自然，卷。280，没有。5719，pp。208-214，1979。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
20. R.J.Mullen，C.R. Rack和A. M. Smith，“脊椎动物中神经元特异性核蛋白质”，发展，卷。116，没有。1，pp。201-211，1992。查看在：谷歌学术搜索
21. Tohyama, v。m。y。李，L. B. Rorke, M. Marvin, R. D. G. McKay, J. Q. Trojanowski，“胚胎人类神经上皮和人类神经上皮肿瘤细胞中的Nestin表达，”实验室调查，卷。66，没有。3，pp。303-313,1992。查看在：谷歌学术搜索
22. M. Amit，C.Shariki，V.Margulets和J.ItnthiTovitz-Eldor，“人类胚胎干细胞的喂食层和无血清培养物”复制生物学，卷。70，否。3，pp。837-845,2004。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
23. J.W. LIM和A. BODNAR，“来自小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的调节培养基的蛋白质组分析，其支持人胚胎干细胞生长”，“蛋白质组学，第2卷，第2期9，页1187-1203,2002。查看在：谷歌学术搜索
24. N.Alenina，S. Bashammakh和M. Bader，“血清奈良神神经元的规范和分化”干细胞评论，第2卷，第2期1，pp。5-10,2006。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
25. D. J. Hilton和N.M.Gough，“白血病抑制因素：生物学视角”细胞生物化学杂志，卷。46，没有。1，pp。21-26,1991。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
26. Li w, Wei w, S. Zhu et al，“通过结合基因重编程和化学抑制剂产生大鼠和人诱导多能干细胞”，细胞干细胞，第4卷，第4期。1，第16-19页，2009。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
27. Y. Lu，F. D. West，B. J.Jordan等，“禽类诱导的多能干细胞使用人类重编程因素来源”，“干细胞和发展，卷。21，不。3，pp。394-403,2012。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索

版权

版权所有©2014 Rui Dai等。这是分布下的开放式访问文章创意公共归因许可证，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，但必须正确引用原作。