文摘

越来越多的证据支持这样的观点:骨骨髓来源间充质干细胞(msc)分化成cardiomyocyte-like细胞在一个适当的细胞环境中,但分化率低。鸡尾酒的方法设计:我们调查的角色5-azacytidine (5-aza) salvianolic酸B (SalB),心肌细胞溶解介质(CLM)诱导msc收购心肌细胞的表型特征。5-aza fourth-passage msc治疗,SalB, CLM, 5-aza + SalB 5-aza + CLM, SalB + CLM, 5-aza + SalB + CLM 2周。免疫荧光结果显示cTnT表达式5-aza + salB + CLM组比其他组。实时qPCR和免疫印迹分析表明,cTnT alpha-cardiac肌动蛋白,mef-2c Cx43, GSK-3beta表达增加,而β-连环蛋白表达减少。salB + 5-aza + CLM组效果最明显。SalB结合5-aza msc和CLM改善心肌细胞分化。在msc分化过程中,Wnt /β-连环蛋白信号通路被抑制。

1。介绍

1999年,牧野等人首次报道,骨髓msc可以分化成心肌细胞在体外(1]。使用5-azacytidine (5-aza)对心肌细胞分化是有效的,但它是临床毒性(2]。其他几种方法已经被用来促进干细胞的分化成心肌细胞,包括coculture干细胞(3),治疗心脏组织提取物(4),血管紧张素ⅱ(5),一氧化氮捐助者(6,7]。大多数这些方法效率不高,产生分化细胞的只有一小部分。

5-Aza,胞嘧啶核苷的化学模拟,通常称为脱甲基制药可以诱导msc分化成cardiomyocyte-like细胞(8]。这也是一种抗癌药物。Salvianolic酸B (SalB)是一个单体丹参基数;最近的数据表明,它有一个良性的神经和心血管系统的影响。SalB可以提高认知能力和antihyperalgesic功能治疗神经性疼痛;它已经被证明可以减少脑损伤和创伤性脑损伤后的炎症9- - - - - -11]。此外,它可以保护心肌细胞凋亡,限制了聚(ADP-ribose) polymerase-1通路,并保证心脏组织的线粒体和核的完整性在急性心肌梗死(12]。心肌细胞溶解介质(CLM)是另一个潜在的触发的旁分泌因子来源的msc分化成cardiomyocyte-like细胞(13]。我们以前的研究表明,SalB能促进MSC分化成cardiomyocyte-like细胞(14]。然而,信号通路通过SalB作品仍然是未知的。

Wnt信号是必要的心脏的各个方面发展的胚胎干细胞,包括心肌规范,心脏形态发生,和心脏瓣膜形成(15]。它有两个分支:β-连环蛋白介导的规范化途径和RhoA / PLC介导不在经典里的途径。不在经典里的信号通路在心脏形态发生中扮演着关键角色,除了心脏规范和祖扩张的潜在影响。规范化Wnt /β-连环蛋白通路已经被报道参与造血(16),乳腺(17),和大脑干细胞功能(18]。小鼠胚胎干细胞实验证明Wnt /β-连环蛋白在心脏规范[信号通路有两相的作用19:促进心脏早期基因表达然后抑制心脏分化在稍后的阶段。Wnt /β-连环蛋白的表达信号和Wnt记者的活动是暂时性的增强在区分前胚胎干细胞心脏标记基因的表达,如GATA4和NKx2.5。阻塞Wnt /β-连环蛋白信号通路在早期阶段的分化抑制早期心脏标记基因的表达和跳动的心肌细胞的出现20.]。即Wnt /β-连环蛋白信号通路在脊椎动物心脏发展守恒的作用,促进心脏前体细胞的形成和随后抑制心肌分化(21]。然而,来源于msc的骨骼有很大的不同。赵等人报道,糖原合酶kinase-3beta (GSK-3beta)胞质诱发心肌细胞分化的msc的差别,通过对这些β-连环蛋白(22]。GSK-3beta是另一个关键组件的Wnt /β-连环蛋白信号通路。β-连环蛋白的磷酸化是GSK-3beta然后由泛素蛋白酶体降解。赵等人证明5-aza诱导心肌细胞分化通过msc通过增加GSK-3beta表达式。

5-Aza和CLM是最经常使用的条件,但他们都有缺陷。获得更好的理解如何获得骨髓间充质心肌细胞的分化率较高,我们调查SalB结合5-aza和CLM的角色。这种鸡尾酒方法测试调查他们的角色在这个实验中,独立和组合,在msc cardiomyocyte-like细胞的分化,以及他们的机制。因此,β-连环蛋白、GSK-3beta和磷酸化/脱去磷酸的比率GSK-3beta检测以确定是否抑制Wnt /β-连环蛋白信号通路诱导msc分化为心肌细胞的关键。

2。材料和方法

2.1。声明的道德

本研究包含Sprague-Dawley老鼠的使用进行了严格按照规定和一般建议中国实验动物管理立法和动物实验伦理委员会批准天津中医药大学(许可证号码SCXK 2005 - 0001)。戊巴比妥钠麻醉下进行手术,所有的努力都是尽量减少痛苦。

2.2。材料

低糖杜尔贝科修改鹰的介质(L-DMEM), DMEM / F12和胎牛血清(的边后卫)从Gibco购买(表达载体,应用生物系统公司,卡尔斯巴德,CA,美国)。两性霉素、5-azacytidine salvianolic酸B (SalB)从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。D-Hank平衡盐的混合物,ABI高容量cDNA、反转录试剂盒,安捷伦的II SYBR绿色qPCR大师混合从应用生物系统公司购买。兔子anti-rat单克隆cTnT购买从Abcam(英国剑桥);兔子anti-rat单克隆GAPDH、β-连环蛋白和GSK-3beta买来点蚀电位中等收入国家(美国加州)和磷酸化GSK-3beta购买从春秋国旅(美国波士顿)。

2.3。方法

2.3.1。隔离和msc的文化

msc分离股骨和胫骨骨髓的雄性老鼠(180 - 200 g) (23]。细胞从骨髓腔冲洗,然后在1000×g离心10分钟。丸是有文化的完全培养基(L-DMEM, 10%的边后卫,100 U /毫升青霉素、链霉素)37°C的5%的股份有限公司₂的气氛。不依从细胞(造血细胞)被替换介质2天后删除。媒介是改变了每隔一天,并从第四(即msc。,改变介质)被用于所有的实验。

2.3.2。隔离CLM的新生大鼠心肌细胞和准备

新生大鼠心肌细胞分离根据2008年的戴尔'Ovo et al .,有一些改进24]。新生大鼠20岁(0 - 2天)在75%的酒精消毒3分钟后安乐死与有限公司₂。心脏组织是通过胸部解剖;心包/心外膜及心内膜被丢弃,心肌(耳廓和心室)处理。我们把心脏组织切成1毫米³块,转移到50毫升无菌管,和洗了他们三次D-Hank的解决方案以去除多余的血液。5毫升的0.0625%胰酶溶液添加到管,和混合物放置在恒温振荡培养箱在37°C 5分钟在190 rpm,和上层的丢弃。然后3毫升的0.0625%胰酶解和3毫升0.1%胶原酶二世的解决方案是添加到球。混合物放在孵化器在37°C 20分钟在190 rpm,那么上层清液收集到一个新的管,和消化终止的边后卫。此步骤重复了三次,直到几乎没有组织块。收集到的上层清液离心机8分钟1000×g,和完全培养基(DF的细胞培养₁₂1%,20%的边后卫,BrdU)在37°C在潮湿的5%股份有限公司₂的气氛。24小时后,超过90%的细胞表现出自发性收缩在inverted-phase对比显微镜下观察(DMI3000B、徕卡、德国)。媒介改变了每隔一天,直到达到80%的细胞融合。

状态良好的心肌细胞是不同步的边后卫在37°C下12小时5%的股份有限公司₂的气氛。然后细胞用胰酶消化和稀释L-DMEM 10点⁵细胞每毫升。这些细胞被冻结在−80°C的4个小时,然后在室温下解冻。此步骤重复了三次,确保细胞分裂。然后管离心机在2000 g×10分钟。上层清液的收集和过滤为0.45μm过滤器然后储存在−20°C,供以后使用。

2.3.3。msc及心肌细胞的识别

收获了很讲究msc治疗0.25%胰蛋白酶和培养1 h在4°C PE-conjugated老鼠老鼠CD45和CD34单克隆抗体,FITC-conjugated鼠单克隆抗体鼠CD29, CD90。控制管孵化和FITC - PE-conjugated抗体鼠IgG1。细胞被洗的磷酸缓冲溶液(PBS)三次。然后由流仪细胞被检测到。结果表明,msc表达CD29 CD90、但不是CD45和CD34。

cTnT,特定的心肌细胞标记,通过免疫荧光试验被发现。心肌细胞发育与PBS和固定洗了三次5分钟在4%多聚甲醛在室温下。细胞被孵化30分钟然后permeabilized 0.5% Triton x - 100在PBS和屏蔽10%正常兔血清60分钟。那么细胞孵化与山羊anti-rabbit cTnT抗体(1:100稀释与PBS)一夜之间在4°C。阻止细胞孵化与兔抗体FITC-IgG抗体2小时,洗了PBS三次后,每一个步骤。细胞被封锁与甘油和使用荧光显微镜检查。

2.3.4。归纳法

第四段后,msc被分成八组根据不同的治疗条件:(1)对照组,(2)5-aza组,(3)SalB集团(4)5-aza + SalB集团(5)CLM集团(6)5-aza + CLM集团(7)SalB + CLM组,(8)5-aza + SalB + CLM组。每组培养2周。每组(即同步。,the medium was changed without FBS) for 24 h, induced by pharmaceuticals mentioned above for 24 h, and then substituted by complete medium (L-DMEM, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and streptomycin). The medium was changed every other day. The 5-aza concentration was 10 μmol / L, SalB浓度是22μmol / L, CLM完成介质的比例是1:1。

2.3.5。免疫荧光分析检测的分化率

诱导msc被孵化与PBS和固定洗了三次5分钟在4%多聚甲醛,然后由孵化permeabilized 30分钟在PBS 0.5% Triton x - 100,和被孵化为60分钟5%正常兔血清。阻止细胞孵化为1小时37°C和山羊anti-rat cTnT多克隆抗体(稀释1:100)在一夜之间在4°C。二次抗体,抗体兔子FITC-IgG(稀释1:100),添加到细胞,然后在室温下孵化30分钟。细胞核染色的孵化与4,6-diamidine-2′-phenylindole (DAPI)在室温下10分钟。PBS的细胞被洗了三次每一步后,与甘油阻塞,荧光显微镜下检查。

2.3.6。定量实时PCR检测的mRNA水平

从培养的msc总RNA提取,这引起了2周,使用一个RNA工具包(Sigma-Aldrich E.N.Z.A. DNA / RNA /蛋白质隔离设备)根据制造商的指示。RNA浓度使用显微分光光度计测定装置。引物序列见表1。我们从2合成的互补μ克总RNA,根据制造商的指示。定量的反应是根据qPCR工具包进行的。参考GAPDH基因,及其阈值周期22。

2.3.7。免疫印迹检测蛋白的表达

蛋白质是获得贴壁细胞。量化的蛋白质进行了使用修改后的bicinchoninic酸(BCA)试验(Cwbio,中国)。蛋白质样品是由沸腾3分钟后的加载缓冲区(Cwbio,中国)。蛋白质被分开使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page) 8%或10%的凝胶和转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜electroblotting。在脱脂牛奶1 h被屏蔽后,一夜之间,细胞膜被在4°C的环境中与主抗体。第二天,膜清洗和孵化山羊anti-rabbit辣根peroxidase-conjugated二级抗体室温1 h。膜清洗,蛋白质乐队是可视化使用增强化学发光试剂盒(Cwbio,中国)下ChemiDoc成像系统(生物Rad实验室、伯克利、钙、美国)。

2.4。统计分析

每个实验进行了三次。统计分析使用单向方差分析(方差分析)。所有的数据表示为平均数±标准差。显著差异被认为是。

3所示。结果

3.1。净化msc和心肌细胞的方法

培养的msc被确定通过流式细胞分析仪(美国BD)。msc是积极CD90、CD29,但消极CD45和CD34(图1)。cardiomyocyte-specific标记cTnT被免疫荧光试验确定。培养心肌细胞的阳性cTnT(图2 (b))。

3.2。SalB结合5-Aza和CLM改善心肌细胞分化率从msc

msc诱导后2周在不同条件下,分化率检测到免疫荧光试验(图3)。没有cTnT表达式在对照组。cTnT每个诱导组截然不同的表情,5-aza + salB组远高于5-aza组和salB组。5-aza + salB + CLM组远高于5-aza + CLM组和salB + CLM组。

心肌细胞分化的进一步分析,进行了定量实时聚合酶链反应和免疫印迹检测cTnT的信使rna和蛋白质,alpha-cardiac肌动蛋白,β-连环蛋白和GSK-3beta。与对照组相比,β-连环蛋白mRNA的表达拒绝(图4(一)),而cTnT的表达,alpha-cardiac肌动蛋白,GSK-3beta信使rna诱导组增加(数据4 (b),4 (c),5(一个))。此外,其他的表达cardiomyocytes-related标记如mef-2c和cx43对照组(数据相比大大增加5 (b)和5 (c))。蛋白表达是类似于信使rna(数据4 (d),5 (d),6)。cTnT和alpha-cardiac肌动蛋白表达增加,GSK-3beta表达增加,和β-连环蛋白表达减少,特别是在5-aza + salB 5-aza + salB + CLM组。

3.3。msc分化成心肌细胞通过抑制Wnt /β-连环蛋白信号通路

的比率磷酸化/脱去磷酸GSK-3beta增加测试组(图7),这意味着phospho-GSK-3beta msc分化成心肌细胞中发挥了重要的作用。5-aza + salB组几乎是5-aza组和salB组的1.5倍。5-aza + salB + CLM集团几乎是1.4倍5-aza + CLM组和salB + CLM组。phospho-GSK-3beta直接降解β-连环蛋白,导致的损失函数在Wnt /β-连环蛋白信号。

4所示。讨论

在这项研究中使用的所有msc被选出的第四段,所述。msc可以进行自发的转换和失去潜在的分化成cardiomyocyte-like细胞后长期的文化在体外。张等人调查了passage-restricted msc向心肌细胞的分化潜力及其扩散能力的关系(25]。他们的发现表明msc向心肌细胞的分化潜力取决于增殖能力和分化发生在passage-restricted模式。逮捕了细胞生长的先决条件诱导cardiomyocyte-specific基因的表达。相比之下的快速增殖率第一,eighth-passage msc、fourth-passage msc进入growth-arrested阶段。类似的增长模式在msc证明了刘et al。26]。他们发现心肌细胞的形态转化和表达标记fourth-passage msc、而不是在其他相同的文化和诱导条件下连续的段落。也就是说,fourth-passage msc、而不是首次通过或eighth-passage msc、可以分化成cardiomyocyte-like细胞。msc cardiomyocyte-like细胞的分化能力有限的扩散能力,和细胞生长被捕并不意味着msc的分化潜力的损失。

在目前的研究中,我们表明,salB结合5-aza, CLM可以得到更高的msc cardiomyocyte-like细胞分化率。RNA的表达cardiomyocyte-related标记,如cTnT alpha-cardiac肌动蛋白,mef-2c,和Cx43 5-aza + salB集团远高于5-aza组和salB组;同样的发生在5-aza + salB + CLM集团5-aza + CLM集团和salB + CLM组。的蛋白表达cTnT 5-aza + salB组几乎是5-aza组和salB组的1.5倍。蛋白质表达的cTnT 5-aza + salB + CLM集团几乎是1.6倍的5-aza + CLM组和salB + CLM组。因此,我们可以得出结论,SalB结合5-aza和CLM可以改善心肌细胞分化率从msc。SalB有心血管功能在特定水平通过多个目标相关的生产(27],SalB还可以防止缺血再灌注损伤通过抑制DNA合成压力激发了的蛋白质和noncardiomyocyte (SAP)激酶活性28]。CLM提供合适的微环境对心肌细胞和细胞因子的培养基。然而,它并不是那么有效的单独应用时,这是符合报告需要msc及心肌细胞之间的直接细胞间接触msc分化成心肌细胞(3]。

我们的研究结果表明,抑制Wnt /β-连环蛋白信号通路是MSC分化成心肌细胞的机制的一部分。与对照组相比,在msc诱导了5-aza + SalB + CLM, cTnT表达式高出5.1倍,GSK-3beta表达式高出5.2倍,而β-连环蛋白表达高出0.4倍。的比率磷酸化/脱去磷酸GSK-3beta测试组明显高于对照组。5-aza + salB组显著高于5-aza组和salB集团和5-aza + salB + CLM组显著高于5-aza + CLM组和salB + CLM组。自磷酸化GSK-3beta直接导致降解β-连环蛋白,我们可以得出结论,高phosphor-GSK-3beta表达了Wnt /β-连环蛋白信号通路。

在绑定实际上wnt (Wnt1 3α和8)受体,如使卷曲和低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP5和LRP6) 5/6, Wnt /β-连环蛋白信号通路被激活。然后信号转导通过凌乱的蛋白质负调节糖原合酶kinase-3beta (GSK-3beta),导致细胞质中的β-连环蛋白的积累。β-连环蛋白然后运输到细胞核,它形成一个复杂的t细胞因子/淋巴细胞增强因子(TCF /中位数)家庭和激活基因的表达等原癌基因或细胞周期蛋白D1。在缺乏Wnt信号,细胞质β-连环蛋白形成一个复杂脚手架蛋白APC和轴蛋白在特定丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化GSK-3beta。这些phospho-Ser /刺残留物被一个泛素连接酶复杂,从而导致β-连环蛋白的降解。因此,GSK-3beta调节机制中发挥着关键作用Wnt /β-连环蛋白通路(29日]。GSK-3beta监管涉及的许多重大信号蛋白在细胞生长和分化,如Wnt、切口和刺猬。

许多研究证明,阻塞Wnt /β-连环蛋白通路在任何位置都可以促进msc分化成cardiomyocyte-like细胞。赵等人表明,心肌梗死后心脏功能障碍可以减毒通过注射过多表达GSK-3beta msc。在一个在体外研究中,我们表明,过度的GSK-3beta msc促进心肌细胞标记基因的表达和蛋白质;与此同时,它可以防止非心脏标记物的表达,如神经元标记(30.]。sFRP2,释放骨骨髓来源的单核细胞,是典型的抑制剂Wnt信号。它起着非常重要的作用在调节msc的旁分泌作用在心脏组织修复31日]。心肌内的注入过多表达的msc sFRP2导致加强移植和血管密度,减少梗塞大小,和增强小鼠心肌梗死后心脏功能。因此,sFRP2新的再生的生物起源的重要分子表型在msc、和Wnt信号是心脏病的治疗目标(32]。这是足以从人类胚胎干细胞生成心肌细胞块Wnt信号通过药物或其他方法。此外,抑制Wnt信号不产生其他的中胚层血统(33]。Egea等人发现,Wnt /β-连环蛋白信号通路的激活组织抑制剂的击倒metalloproteinase-1 (TIMP-1)促进成骨分化由人类msc (34]。

李等人证明了msc分化成心肌细胞是依赖于Notch信号。锯齿状1蛋白质可以激活信号和msc向心肌细胞的分化率增加,而其效果可以克制DAPI [35]。转导Wnt 11日激活经典之中Wnt信号到MSC、增强了MSC分化成心肌细胞通过上调GATA-4 [36]。GATA-4、心脏转录因子在细胞谱系分化发展中扮演着重要角色。GATA-4 msc分化显著增加利率过度myocardiocyte表型,这可能是相关的upregulation胰岛素样生长因子结合含有。这方面的证据证明有必要抑制Wnt /β-连环蛋白信号通路诱导msc分化成心肌细胞。

根据分子分析,治疗细胞获得cardiomyogenic的分子表型细胞;尽管qPCR和免疫印迹显示显著差异在mRNA表达和蛋白质合成,cardiomyocyte-like细胞没有击败。这些结果表明,可溶性因子单独并不足以诱导msc分化,心肌细胞之间的身体接触和msc是必要的。微环境包括细胞间相互作用的因素;细胞因子和细胞外基质蛋白需要诱导分化。需要更多的实验来实现在MSC分化的一大步。尽管努力提高msc分化成心肌细胞,只有不到30%的msc导致心肌细胞分化;其他有助于成骨、软骨形成,脂肪形成,或其他进程25]。单细胞单克隆技术可以初步净化程序msc具有高潜力的心肌细胞分化,但这些细胞的特定的表面标记仍然未知。

总之,5-aza salB, CLM三个个人感应代理msc cardiomyocyte-like细胞的分化。在这个过程中他们有添加剂的影响,当结合使用。这种感应的作用机制可能涉及规范Wnt信号通路的抑制。msc分化成心肌细胞有许多感应要求:制药诱导细胞因子,微环境,细胞间接触,离子浓度,等等。很明显,抑制规范化Wnt信号为msc分化成心肌细胞是必要的,但是否经典之中Wnt信号的激活或Notch信号结合药物治疗可以诱导msc分化成跳动的心肌细胞需要进一步探索。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

所有作者参与设计、解释的研究,分析数据和论文的审查。以下作者的构思和设计实验:Yingchang粉丝,Xijuan江,Maojuan郭。以下作者进行实验:清高,Maojuan郭,显通。以下作者分析了数据:清高,Maojuan郭。论文写了以下作者:清高。

确认

这个项目是由天津研究项目的应用基础和先进的技术(没有。09年jcybjc12200,http://www.tstc.gov.cn),专门研究基金会对中国高等教育的博士项目(没有。20101210110004,http://www.cutech.edu.cn),天津市高中科学技术基金项目(没有计划。20110205,http://www.tjmec.gov.cn),中国国家自然科学基金(81173413和81173413号,http://www.nsfc.gov.cn)。投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表或论文的准备。