Wnt1加速一个体外人类脐带血CD34的扩张⁺CD38⁻细胞

文摘

脐带血造血干细胞移植(CB-HSCs)不足与面临的局限性逐渐增加,肝星状细胞的数量在每个CB单位。因此,有效的扩展方法,可以维持干细胞特性是必要的。在这项研究中,脐CB-CD34⁺细胞培养的细胞因子在两个不同的鸡尾酒:4因素(4 f = Flt3-L,自洽场、il - 6和传真照片)和5个因素(5 f = Wnt1 + 4 f)血清和无血清的媒体。数据显示,加速扩大CD34的最佳状态⁺CD38⁻细胞无血清培养条件补充5 f (5 f KSR)。这种情况产生了24.3±2.1折叠CD34的增加⁺CD38⁻细胞。扩大细胞CD34展出⁺CD38⁻CD133⁺CD71^低CD33的^低CD3⁻CD19⁻标记,表示nanog oct3/4,原癌基因,和sox2分化的基因,和维护潜在进入淋巴,红细胞和骨髓血统。CD34的成就⁺CD38⁻细胞扩张可能克服不足数量的细胞导致提高干细胞移植。总之,我们的研究结果强调Wnt1和新的文化条件的角色在刺激造血干/祖细胞的扩张可能会提供一个新的治疗途径脐带血移植、再生医学、干细胞银行应用程序,和其他未来的临床应用。

1。介绍

CD34造血干细胞(hsc⁺CD38⁻)从脐带血中获得(UCB)已被广泛的研究在干细胞研究先进的细胞疗法(1]。脐带血(CB)包含肝星状细胞表达低免疫原性呈现CB是承诺的来源的干细胞移植(2]。此外,CB骨髓移植显示优势和动员外周血移植方面的收集过程,丰富的造血干细胞/祖内容(3),和更低的急性移植物抗宿主病的发病率(4]。然而,肝星状细胞的数量是有限的在一个单一的CB单位和可能提高移植失败的风险,尤其是在成人移植(5]。因此,肝星状细胞数量的增加不改变表型和失去重新繁衍能力需要成功的临床移植。这些障碍,因此,研究人员构成的挑战需要克服。

大多数出版物旨在扩大CD34⁺而不是CD34细胞⁺CD38⁻细胞扩张。然而,CD34⁺CD38⁻细胞确实保护人口更原始的肝星状细胞,含有更多的效率重建所有血细胞类型在活的有机体内。CD34的⁺CD38⁻也含有细胞分化成多种细胞类型的可塑性在体外如脂肪细胞(6),大脑细胞(神经元和星形胶质细胞)7),心肌细胞(8),肝细胞(9],成肌细胞[10],myoendothelial [11],osteochondrocytes [12),和胰腺细胞(13]。CD34的⁺数量由骨髓和脐带血是异构的,包含两个CD34⁺CD38⁻和CD34⁺CD38⁺分数。有大约单核细胞的出现在脐带血CD34⁺CD38⁻细胞。在孤立CD34⁺人口,大约1 - 10%被发现的原始CD34⁺CD38⁻细胞静止和包含长期culture-initiating (LTC-ICs),能够生成细胞克隆形成单位(CFU-C) [14]。此外,SCID-repopulating细胞CD34 (src)被发现只有⁺CD38⁻分数而CD34⁺CD38⁺分数不能道NOD / SCID小鼠(15]。三岛和同事成功CB-CD34扩张⁺CD38⁻细胞与约7倍增加培养细胞osteoblast-differentiated MSC与自洽场支线细胞补充,传真照片,Flt3-L, IL-3, il - 6 (16]。然而,这个过程是复杂的处理,不便进行大规模的文化,和肝星状细胞可能附着在馈线细胞。

Wnt信号蛋白胚胎早期发育中扮演关键性的角色,在成人组织内稳态。ESCs Wnt信号也调节胚胎干细胞()的分化和支持ESCs的维护自我更新的(17]。几项研究已经显示的角色Wnt家庭具备干细胞在肝星状细胞的规定和自我更新能力。Wnt1 /β连环蛋白信号已经被报道在鼠标的ESCs调解BMP-4-induced自我更新(18]。老鼠缺乏12/15-lipoxygenase——(12/15-LOX)介导的不饱和脂肪酸代谢代表低数量的长期肝星状细胞减少规范Wnt信号(19]。最近,Wnt /β-catenin-activated间充质干细胞(msc),提供一个激活,可以促进肝星状细胞的自我更新与辐照小鼠骨髓(约4.5倍20.]。据报道,Wnt3a蛋白质结合信号刺激不仅肝星状细胞的自我更新,还在造血细胞命运的决定(21]。Nikolova及其同事表示,Wnt1和Wnt3a条件培养液(CM)能够提高增殖和保护CB-CD133的不成熟状态⁺,而WNT4 WNT5a, WNT11-CM已经被证明能够促进nonhematopoietic分化(22]。然而,Wnt1在肝星状细胞扩张的作用尚未研究。在这项工作中,我们首次证明Wnt1补充在cytokines-based血清培养7天可以显著提高CB-CD34扩散⁺CD38⁻和CB-CD133⁺CD38⁻细胞。众所周知,人口都包含自我更新能力。此外,扩大细胞表现出低分化细胞,维持造血干细胞和祖细胞(公司)分化成所有血细胞类型属性在体外。

2。材料和方法

2.1。净化人类CB-Derived CD34⁺细胞

人类的联合样本从脐带获得正常怀孕的交付通知后同意。研究进行了符合伦理委员会的审批涉及人体受试者的研究大学Suranaree技术,基于世界医学协会赫尔辛基宣言。CB样本在4小时内处理。单核细胞(跨国公司)被孤立Ficoll-Hypaque密度梯度离心法(1.077 g / L,通用电气医疗集团生物科技B,瑞典)。然后,CB-CD34⁺从跨国公司细胞纯化Dynabeads m - 450和DETACHaBEAD CD34制造商的指令(Dynal,挪威)。

2.2。细胞培养和扩大

孤立的CD34⁺细胞培养在Iscove修改杜尔贝科的介质(IMDM;美国CA Gibco)补充10%胎牛血清(的边后卫)或敲除血清替代(KSR;表达载体、钙、美国)和人类重组细胞因子的组合鸡尾酒(美国新泽西Peprotech,落基山)。文化分为4组:(1)4因素cIMDM (4 f cIMDM): IMDM + 10%的边后卫+ flt3配体(Flt3-L 100 ng / mL)、干细胞因子(SCF, 100 ng / mL)、白细胞介素- 6 (il - 6, 100 ng / mL),和促血小板生成素(TPO 10 ng / mL);(2)5 f cIMDM (5 f cIMDM): IMDM + 10%的边后卫+ Wnt1 (20 ng / mL) + Flt3-L (100 ng / mL),自洽场(100 ng / mL), il - 6 (100 ng / mL),和房产申诉专员署(10 ng / mL);(3)4因素无血清培养基(4 f KSR): IMDM + 10% KSR + Flt3-L (100 ng / mL),自洽场(100 ng / mL), il - 6 (100 ng / mL),和房产申诉专员署(10 ng / mL);(4)采用无血清5 f (5 f KSR): IMDM + 10% KSR + Wnt1 (20 ng / mL) + Flt3-L (100 ng / mL),自洽场(100 ng / mL), il - 6 (100 ng / mL),和传真照片(10 ng / mL)。所有的实验都是培养在37°C O在5%₂,5%的公司₂7天。扩大细胞被血细胞计数器枚举每一天。经过5天的扩张,细胞受到液体培养分化和细胞克隆形成试验如下。此外,每天5和7的扩张,细胞的表达CD3、CD19, CD33, CD34, CD38、CD71, CD133细胞表面分子通过流式细胞术分析。

2.3。扩散分析

CD34⁺在96孔板细胞培养4 f cIMDM 4弗兰克-威廉姆斯cIMDM, 4 f KSR, 4弗兰克-威廉姆斯KSR媒介(1×10⁴细胞/)。文化后3、5、7天,细胞增殖是衡量5-bromo-2′脱氧尿苷(BrdU)公司24小时与商业BrdU细胞增殖工具包(Calbiochem、德国)根据制造商的协议。简单地说,20μL BrdU解决方案(1:2000)添加到每个。在96 -菜是孵化后24 h,这道菜在1000转离心10分钟。然后,删除内容。200年μL的固定剂/变性解决方案添加到每个孵化了30分钟。接下来,100年μL (100 x anti-BrdU抗体(1:100)是混合和孵化1 h。细胞被洗了,混合着100人μL(过氧化物酶山羊anti-mouse免疫球蛋白辣根过氧化物酶共轭。板孵化后30分钟,细胞被洗,添加到100年μL衬底的解决方案。的比例合并BrdU当时决定通过测量吸光度双波长450 - 540纳米(xMark微型板块吸光度分光光度计,Biorad,美国)。

2.4。流仪结果

CD34表型分析的扩展⁺细胞进行每天5和7的文化包括细胞表面标记物的表达CD3、CD19, CD33, CD34, CD38、CD71 (BD pharmingen,圣何塞、钙、美国),和CD133 (mac, Miltenyi研究,德国)。扩大CD34⁺细胞从每个实验收集和resuspended PBS。与单克隆抗体标记的细胞悬液后,这些细胞被孵化30分钟在冰上。PBS的混合物被清洗以去除多余的抗体和紧随其后的是用4%多聚甲醛固定细胞。细胞表面标记调查受到通过流式细胞术分析使用CellQuest Pro软件(FACSCalibur,正欲,圣何塞、钙、美国)。每个分组人口的数量在一个表示时间点是规范化的意思是有核细胞总数和阳性细胞的平均比例在每个程序。扩张的褶皱增加计算除以总细胞数在每个人口族群的数量开始的文化。

2.5。液体培养试验

扩大后的CD34⁺所有3细胞受到液体培养化验血液细胞谱系分化:骨髓、淋巴,红色的血统。细胞培养在IMDM补充10%的边后卫和重组人细胞因子的组合(美国新泽西Peprotech,落基山)如下:(一)红细胞的血统;20 ng / mL促红细胞生成素,100 ng / mL自洽场,(b)巨核细胞的谱系;100 ng / mL传真照片和100 ng / mL自洽场,(c)粒细胞和巨噬细胞谱系;20 ng / mL gm - csf和30 ng / mL IL-3, (d)肥大细胞和粒细胞血统;100 ng / mL自洽场和30 ng / mL IL-3, (e)淋巴血统;100 ng / mL自洽场,100 ng / mL Flt3-L和50 ng / mL IL-7。OP9细胞被用作馈线为淋巴细胞分化。细胞培养在湿润5%啊₂,5%的公司₂气氛在37°C 14-30天。Cytospins每种文化都准备和受到Wright-Giemsa染色。图像分析是由显微镜可视化(奥林巴斯BX51、奥林巴斯、日本)和数字CCD摄像机记录了(奥林巴斯DP72、奥林巴斯、日本)。

2.6。克隆形成细胞(CFC)测定

扩大CD34的能力⁺-enriched-population生成造血克隆细胞祖细胞进行了分析。短暂,扩张过程的细胞后5天,然后培养MethoCult H4434对氟测定按照制造商程序(公元前干细胞技术,温哥华,加拿大)。所有细胞培养在35毫米文化菜14天在37°C O为5%₂,5%的公司₂和95%的湿度。氯氟烃被打进了14天根据他们的形态(25倒置显微镜下)(CKX41、奥林巴斯、日本)和由数字CCD摄像机捕获的照片(奥林巴斯DP72、奥林巴斯、日本)。新鲜的孤立CD34⁺包括细胞控制。

2.7。通过实时RT-PC基因表达分析

总RNA (700 ng)和cDNA每个样本准备使用RNA minikit (Geneaid、台湾)和上标第一链合成系统(美国英杰公司)按照制造商的指示,分别。权力SYBR PCR混合包含1 x SYBR绿色PCR大师混合,200海里oct3/4,nanog,和GAPDH300纳米原癌基因和sox2引物和1.5μL的互补。中使用的引物,序列实时rt - pcr分析表中列出1。反应在95°C进行了10分钟,40 - 50周期15 s在95°C,和1分钟60°C其次是分离步骤(ABI 7900 ht快速实时PCR系统,应用生物系统公司)。每个模板的试验进行了一式三份和消极的控制。基因表达的相对量化软件v.1.2.2使用应用生物系统公司序列进行检测。

2.8。统计分析

数据提出了平均值±标准差。统计计算与SPSS软件(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。结果分析了单向方差分析测试图基HSD测试紧随其后。的值被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。Wnt1增强造血干/祖细胞增殖(公司)

人类CB-CD34⁺细胞被分为4组:4 f cIMDM 5 f cIMDM, 4 f KSR, 5 f KSR。所有文化都孵化37°C, 5% O₂,5%的公司₂为7天,95%的湿度。评估各种文化条件是否会加速细胞增殖和保护造血干细胞表型在整个文化时期,我们分析了细胞的增殖和成倍增加后扩张。在这里,我们的结果显示,总有核细胞的增殖率在5 f KSR媒介显示率最高的第五天和第七天文化(图1(一))。扩散率明显高于5 f KSR ()与4 f KSR ()和4 f cIMDM (在第五天)()。此外,扩大了细胞的扩张在5 f cIMDM文化()显著高于4 f cIMDM介质(在第五天)(),但不是微不足道的文化(图的第七天1(一))。然后,我们研究了细胞表面标记扩展公司的细胞通过与CD34染色细胞,CD38、CD133。CD34的⁺CD38⁻细胞代表原始HSC人口非常重要的治疗目的。有一个略微增加CD34⁺CD38⁻人口增长细胞培养4 f cIMDM和5 f cIMDM第五天和折叠与控制细胞的第0天相比,分别(图1 (b)和表2)。这些细胞不断扩大更多的随着时间的推移和折叠在第七天的扩张过程,分别。

有趣的是,细胞维持在4 KSR和5 f KSR CD34的7天透露了重要的乘法⁺CD38⁻人口和分别折叠(与4 f cIMDM和5 f cIMDM;图1 (b)和表2)。代表的流式细胞术分析扩大细胞收集了5天,第七天图所示2,每一个族群的immunophenotypic (CD34⁺CD38⁻,CD133⁺CD38⁻,CD34⁺CD38⁻扩大细胞特征的细胞)在第五天,第七天是总结表3。这些数据表明,膨胀的细胞在无血清培养基含有细胞因子的4或5 f CD34可以作为伟大的文化条件⁺CD38⁻细胞扩张。此外,在Wnt1的存在,这对CD34细胞因子表现出最强大的加速度的影响⁺CD38⁻细胞增殖。此外,细胞培养4 KSR和5 f KSR条件包含更少的CD34⁻CD38⁺细胞(细胞分化;和折叠、职责)比细胞培养4 f cIMDM和5 f cIMDM (和折叠、职责)为7天(;图1 (d)和表2)。这些数据表明,4 KSR和5 f KSR条件可以保护肝星状细胞表型的细胞比血清介质。

令人惊讶的是,文化条件4 KSR和5 f KSR还透露CD133的显著增强⁺CD38⁻分组人口增殖,和分别在7天的文化(与4 f cIMDM;图1 (b)和表1)。这些细胞也含有血细胞重新繁衍能力在活的有机体内(26,27]。总之,我们的研究表明,4 KSR和5 f KSR可以增强CD133⁺CD38⁻随着CD34分组人口增殖⁺CD38⁻细胞的扩张。同时存在的两种人群的优势是,他们可以加强和提高成熟血细胞的能力调整有利于细胞移植。此外,细胞无血清培养系统在具备干细胞可以维持他们比血清的存在。因此,这些数据表明Wnt1 CD34的有力刺激器⁺CD38⁻和CD133⁺CD38⁻细胞的那时。

3.2。扩大了细胞的表型

我们证明所有4包含CD34文化条件⁺CD38⁻,CD133⁺CD38⁻,CD34⁻CD38⁺人群。我们接下来进一步调查这些扩大细胞祖细胞的表型。为此,细胞从4条件分别收获和接受骨髓、淋巴,和红色的血统分析使用CD33(骨髓)、CD71(红色的),CD3, CD19(淋巴)标记。结果表明有明显存在骨髓/红色的祖细胞的早期标志物但不是淋巴祖细胞(图在所有文化条件3)。然而,细胞培养4 cIMDM和5 f cIMDM包含更多的骨髓/红细胞比细胞祖细胞培养4 f KSR和5 f KSR。此外,结果表明,介质含有血清诱导的细胞表型改变CD34的损失⁺细胞和获得更多的祖细胞CD34⁻CD38⁺人口(4 f cIMDM = 62.8折,5 f cIMDM = 89.7折)比在无血清培养基(4 f KSR = 20.1折,5 f KSR = 13.0折;表2)。这些数据表明血清效应增强自发分化。

综上所述,CB-CD34⁺纯度的浓缩铀数量在4培养KSR和5 f KSR展览(1)更高的CD34显著增加⁺CD38⁻和CD133⁺CD38⁻细胞比4 f cIMDM或5 f cIMDM,(2)更有效地维护CD34⁺表现型4 cIMDM或5 f cIMDM条件,(3)不如medium-containing血清条件下骨髓/红色的祖细胞。有趣的是,所有4条件显示相同的概要文件的淋巴系无明显存在这些家族的祖细胞。因此,4 KSR和5 f KSR CD34具备干细胞可以扩展和维护⁺细胞超过4 cIMDM或5 f cIMDM条件。

3.3。扩大细胞能重建血液细胞谱系

集落形成在体外表明造血干/祖细胞的效率发展成骨髓和红色的殖民地在各种细胞因子的组合因素的存在。在这方面,这在扩大后的CD34能力进行了分析⁺细胞。扩大后CD34⁺细胞在4种不同条件下5天,收获和播种在半固体的甲基纤维素中描述的材料和方法。结果表明,扩展4各种细胞培养条件包含的能力产生克隆细胞祖细胞:CFU-GEMM, CFU-GM BFU-E, CFU-M类似新鲜CD34孤立⁺肽(图4(一)和4 (b))。虽然总CFU-G数在所有细胞因子培养条件显示数量略有减少,与新鲜的孤立的组相比,它在统计学上并不显著。此外,扩大CD34⁺丰富人口4 KSR和5 f KSR可以生成更成熟的血细胞在液体培养分化(数字4 (c)和4 (d))以及那些在cIMDM培养条件(数据未显示)。这些发现表明重新繁衍人口容量扩大公司的成就在体外。

3.4。扩大CD34⁺纯度的浓缩铀的人口4 KSR和5 f KSR维持多能性基因表达

事实上,基因的表达原癌基因,nanog,oct3/4,sox2通常作为多能性和自我更新基因标记的胚胎干细胞,随后其他干细胞包括肝星状细胞。因此,我们进一步检查是否我们扩大CD34⁺纯度的浓缩铀的人口在两个4 KSR和5 f KSR条件能保持或不具备干细胞基因。为此,细胞两种情况下分别收集经过5天的扩张,进一步分析记录原癌基因,nanog,oct3/4,和sox2通过实时rt - pcr。数据显示,所有的基因被发现在4 KSR和5 f KSR条件(图5)。令人惊讶的是,原癌基因,nanog,和oct3/4是调节细胞内收集从5 KSR中收集的比4 f KSR文化和新鲜CD34孤立⁺细胞(,数据5(一个),5 (b),5 (c))。因此,扩大细胞在4 KSR和5 f KSR可以通过保护和/或维持他们具备干细胞多能性基因表达的支持。因此,这些发现支持的重要性Wnt1 CD34的加速度⁺CD38⁻细胞增殖在7天5 f KSR媒介,既维护公司属性在细胞和分子水平。

4所示。讨论

造血干细胞可以从几个来源。3主要来源是骨髓(BM),外周血(PB)和脐血(UCB)。其中,脐带血(CB)作为肝星状细胞收集最强大的来源,尤其是在非侵入性程序集合。此外,CD34⁺人口包含肝星状细胞分离CB展品提供优越的优势比在BM和PB在许多方面,如展示包含最高最低HLA抗原和扩散的潜力。这些特征是至关重要的造血干细胞移植(成就的2]。尽管CD34的比例⁺CB细胞丰富,细胞数量在单一单元为自体移植是不够的。基于这方面,扩大技术是需要为了获得高收益的CD34⁺CD38⁻细胞和维持他们具备干细胞及其分化成所有血液细胞类型的能力。在这项工作中,我们成功地生成扩张CD34的文化条件,产量显著增加⁺CD38⁻和CD133⁺CD38⁻细胞在无血清培养基补充细胞因子鸡尾酒。

CD34的⁺CD38⁻细胞代表原始HSC人口血液细胞移植应用程序非常重要。CD133的⁺CD38⁻近日出现在CD34⁺纯度的浓缩铀的人口也是静止的来源干细胞中在活的有机体内重新繁衍功能(26,27]。此外,调查,CB AC133⁺CD38⁻是一种改进的标记,大片和丰富LTC-IC和SRC (28]。因此,成功的CD34的扩张⁺CD38⁻和CD133⁺CD38⁻细胞是一个梯形不仅能够克服不足数量的细胞也提高干细胞移植。有趣的是,我们观察到大量的CD34⁺CD38⁻细胞(~ 18.5折)4 F KSR介质经过7天的文化。更引人注目的是,支持Wnt1文化5 f KSR介质,CD34的更高的显著增加⁺CD38⁻细胞获得了(~ 24.3折)经过7天的文化。这些调查表明Wnt1肝星状细胞的扩张刺激器。折叠的CB-CD34扩张⁺CD38⁻细胞增殖比先前的研究在这个研究显示更大的成就和三岛的同事获得了约7倍扩张自洽场的培养细胞在细胞因子组合,传真照片,Flt3-L, IL-3, il - 6在osteoblast-differentiated MSC馈线细胞(16]。然而,扩张的肝星状细胞没有馈线细胞更容易处理的程序,非常方便的进行大规模,没有问题对馈线细胞在造血细胞的依恋。此外,我们发现CD34的数量⁺CD38⁻细胞在无血清培养基高于FBS-containing媒介。因此,无血清条件的实用程序(4 f KSR和5 f KSR)可以降低交叉污染的风险由动物产品和CD34的表现出更高的效率⁺CD38⁻和CD133⁺CD38⁻细胞扩张相比,血清媒体(4 f cIMDM和5 f cIMDM)。此外,我们的数据4 KSR和5 f KSR还表示CD34的低量⁻CD38⁺祖细胞比4 f f cIMEM cIMDM和5。CD34的⁻CD38⁺或coexpression CD34和CD38更坚定的祖细胞在移植可能导致不那么有效,而更原始的HSC函数发现富集CD34⁺CD38⁻人口(15]。这些发现表明,4 KSR和5 f KSR更合适的公司扩张和文化条件能够保持CD34⁺人口比4 cIMDM和5 f cIMEM文化条件。,相比之下的所有4条件工作,CB-CD34文化条件的效率⁺CD38⁻和CD133⁺CD38⁻公司扩张可以安排顺序从高到低效率5 f KSR 4 f KSR 5 f cIMDM,分别和4 f cIMDM。

一个体外CD34的扩张⁺细胞使用各种细胞因子的鸡尾酒是另一种方法来克服的限制和发展主要由许多研究小组。细胞因子的组合因素:自洽场、Flt3-L传真照片,il - 6已广泛应用体外CD34的扩张⁺medium-containing血清细胞(29日- - - - - -31日]。然而,长期的文化导致了增加了更多的承诺祖细胞可能稀释真正的公司数量,减少移植的效率。我们也发现了同样的现象在CB-CD34高产祖细胞⁺细胞培养4 cIMDM和5 f cIMDM血清含有条件即使在很短的时间为7天。因此,血清应该取消从干细胞的文化。据报道使用自洽场,Flt3-L,传真照片,il - 6 / sIL-6R公司在无血清条件和能力的扩张增加点头/ SCID-repopulating细胞扩张[32]。此外,可爱的团队表明,在无血清条件用丙戊酸治疗7天可以提高2倍左右CD45的扩张⁺34⁺祖细胞(33]。然而,这些研究观察到的人口更忠诚的公司而不是原始的公司。

事实上,Wnt信号通过规范化途径被激活细胞命运的决心。他们在造血作用的角色已被确定为一个生长因子对造血干细胞的发展。Wnt1一直在建议中发挥作用ESCs的区分人类和hematoendothelial细胞(34]。先前的研究已经报道的意义Wnt信号蛋白质家族公司的扩张和自我更新(22,35];然而,Wnt1从未研究CB-HSCs扩张。在这里,我们第一次证明Wnt1有效地支持CB-CD34⁺CD38⁻和CD133⁺CD38⁻细胞的扩张。这种效果是在无血清培养基比血清培养基更有效。此外,Wnt1补充与Flt3-L无血清培养基,自洽场、传真照片和il - 6 (5 f KSR)也能够具备干细胞维持房地产扩大细胞而不影响造血祖细胞的分化能力。5 f KSR-expanded细胞可以产生所有血液细胞在合适的生长因子为每个血液细胞谱系分化。相比之下,细胞培养4 f KSR没有Wnt 1;肝星状细胞的扩张潜力下降。因此,该数据证实的刺激活动Wnt1 CB-HSCs扩散。

一般来说,Wnt信号通路介导的干细胞的命运和维护鼠标的ESCs和为其在未分化状态34,36]。Wnt3a规范化Wnt通路激活,发现促进短期multilineage调整休眠c - kit细胞(37]。激活Wnt /β连环蛋白信号通路可以扩大肝星状细胞在肝星状细胞自我更新过程中发挥作用。然而,本构激活β连环蛋白可以废除肝星状细胞分化和肝星状细胞重建在活的有机体内(38]。因此,Wnt1可能发挥功能的upregulator CB-HSCs扩散通过同样的途径Wnt3a或Wnt /β连环蛋白信号通路。据报道,从293 t转染条件培养基收集Wnt1,胎儿肝脏AA4 Wnt5a,或者Wnt10b可以增强⁺Sca⁺工具包⁺细胞(小鼠肝星状细胞)扩张39]。Wnt通路的激活也发现了Notch信号的关系,这是很重要的在造血作用的早期发展40]。Wnt-mediated维护所需的未分化的肝星状细胞的集成Notch信号抑制分化。因此,它会建议Wnt1可能调解Notch信号通路的upregulation CB-HSCs扩大和维护具备干细胞的细胞。流程还需进一步澄清Wnt1蛋白质交互的角色等级信号在肝星状细胞自我更新的调控。

也在目前的研究中,我们调查是否增强CD34的扩散⁺细胞或公司由4 KSR和5 f KSR会影响到多能性和自我更新活动。在细胞水平上,我们证明了扩大生产克隆细胞祖细胞:细胞有能力CFU-GEMM, CFU-GM BFU-E, CFU-M类似新鲜CD34孤立⁺细胞(图4(一))。此外,液体培养分化试验表明公司的能力在这两个4 KSR和5 f KSR生成更成熟的血细胞(数字4 (c)和4 (d))。这些发现支持重新繁衍人口容量扩大公司的成就。在分子水平上,我们也证明了扩展公司从4 KSR和5 f KSR表示关键多能性和自我更新的基因原癌基因,nanog,oct3/4和sox2。Oct3/4,一个关键的转录因子介导胚胎干细胞的多能性维护,发现监管sox2表达在胚胎干细胞然后激活Oct-Sox控制表达的增强剂nanog甚至oct3/4和sox2自己(41]。因此,我们的数据显示mRNA转录因子的表达,oct3/4 nanog, sox2 ESCs调解维持多能性和自我更新(42,43]。我们的结果也显示这些基因的相似之处表现在公司新鲜CD34孤立⁺细胞。因此,这些建议4 KSR和5 f KSR鸡尾酒可以稳定多能性和自我更新基因的表达是至关重要的干细胞的特征。

肝星状细胞移植已被用于治疗造血障碍,坚实的恶性肿瘤(44,45],nonhematopoietic疾病目前在临床试验在世界各地的许多国家。除了扩大公司的财产在维持干细胞池在移植病人造血系统,引起血细胞的承诺也是必不可少的免疫功能。在癌症患者大剂量化疗后,嗜中性白血球减少症通常发生。髓系血统,在先天免疫反应中发挥的作用可以防止细菌感染的初始阶段移植。我们的结果与先前的观察是一致的体外CD34的扩张⁺细胞主要承诺与微不足道的扩张到淋巴髓系祖细胞谱系(46]。因此,自然骨髓/红色的承诺体外文化可以提高移植在临床研究效率,降低死亡率。最近,第一阶段临床试验证明的利用率体外扩大CB-CD34⁺细胞连同nonmanipulating CB单位促进患者骨髓移植率(47]。这些数据,因此,强调了扩大CB单位为治疗目的的重要性虽然nonmanipulating之间的真正支持的移植机制和操作一个没有被探索。

总之,这项工作表明,在相同的细胞因子的鸡尾酒,无血清培养基是一个更好的选择比利用CD34血清培养基⁺CD38⁻和其他公司扩张,不仅动物产品污染少,细胞的扩张效率更高。此外,Wnt1可以加强自洽场、Flt-3L传真照片,采用无血清il - 6 (5 f KSR)刺激CD34⁺CD38⁻和CD133⁺CD38⁻公司增殖。同时存在的两种人群的优势是,他们可以加强和提高血液细胞的重组的能力。此外,人类细胞因子在文化媒体的利用是可行的,安全的,,而不是复杂的或通过使用动物产品的系统风险。此外,这种鸡尾酒可以维持造血属性的公司在细胞和分子水平。最后,Wnt1可以刺激公司的生存和增殖,表明Wnt1包括小说类造血细胞的监管机构。这项工作的影响是未来治疗价值的脐带血移植血液和nonhematologic疾病,血液银行/干细胞银行应用程序,和血液学的研究。开发更高效率的扩张方法也将进一步探讨。

利益冲突

作者宣称他们没有金融或政治利益冲突。

确认

作者要感谢圣玛丽医院,在那空Ratchasima Suranaree军队医院,Buriram医院Buriram,泰国、CB集合的慷慨援助。他们也感谢国家科学和技术发展机构(NSTDA),科技部,Suranaree科技大学,那空Ratchasima,泰国的金融支持。

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