文摘
离子通道参与多种细胞过程包括干细胞分化。无数家庭生物离子通道存在的可尊敬的通过,例如,离子选择性,闸门机制、组成、或细胞生物功能。描述这组离子通道的明显表达我们之间的离子通道基因的信使rna表达水平相比人类keratinocyte-derived诱导多能干细胞(hiPSCs)和他们的体细胞来源,从摘头发角质细胞。这种比较显示,26%的离子通道的分析调查显示upregulation hiPSCs只有6%是表达下调。此外,万能表达更高的角化细胞相比,离子通道的数量。进一步缩小特异性“诱导多能性”细胞的离子通道表达我们比较他们的表达模式与分化后代,即神经元和心肌细胞来源于“诱导多能性”细胞。最后,hiPSCs展览一个非常可观的和多样化的离子通道表达模式。他们能给一个详细分析洞察他们的贡献许多细胞过程甚至疾病机制。
1。介绍
离子通道是由各种各样的不同的家庭孔隙蛋白质。最初,离子通道主要是闻名的作用在神经系统发挥着至关重要的作用在信号传输和突触神经突。但事实上它们参与其他许多细胞过程包括细胞大小规定,肌肉收缩,免疫系统的激活1),或激素释放2]。不同的离子通道此外公认的高兴奋细胞心脏的重要性:心肌细胞的工作心肌以及心脏传导系统的细胞。在心脏,特定的离子通道负责,例如,为监管一代的动作电位和心脏肌肉收缩强度和时间3]。此外,离子通道发挥重要作用在几个分化和成熟过程4- - - - - -6]。提出了研究旨在仔细看看离子通道表达人类多能干细胞(hiPSCs)给一个起点为进一步分析他们的不同的角色在早期发育和分化过程中细胞状态。
从体细胞hiPSCs生成时间超表达的特定转录因子和强烈类似于多能胚胎干细胞(7,8]。多能性是在别人定义的能力分化成三个生殖细胞层和无限的对称细胞分裂。这个细胞系统被广泛用于研究发育过程或疾病机制研究[9,10]。尽管它变得明显,分化过程影响离子通道表达(11),离子通道的不同的作用在这些过程到目前为止只有知之甚少。然而,很明显,某些离子通道在干细胞生物学中发挥关键性的作用,包括细胞命运决定、细胞周期调控、细胞骨架重组(6,12- - - - - -15]。
的可能性则包括个人或patient-specific-pluripotent细胞的生成,可随后分化成细胞类型的影响。这已经是用来研究pathomechanisms在多种组织和细胞类型9,16- - - - - -18]。所谓channelopathies基于突变在离子通道发育障碍的原因和各种研究的主题是19,20.]。阐明离子通道的作用在细胞分化、成熟或他们的角色在pathomechanisms有根有据的多能细胞离子通道分布知识,代表最早的发展阶段,是必不可少的。在这方面,我们比较几个离子通道的表达水平在人类角质细胞重新编程的后代,hiPSCs。角化细胞来源于摘头发(21,22)代表的一个最有前途的细胞来源的生成研究hiPSCs [23]。我们已经阐明离子通道调节各种渠道家庭和亚型。此外,我们比较离子通道的家庭和亚型的表达水平,发现监管重组期间,iPSC-differentiated后代,即神经元和心肌细胞。这些比较可能是一个起点评价贡献和不同的离子通道的功能,例如,在干细胞自我更新和分化过程。
2。材料和方法
2.1。道德的声明和捐赠信息
知情同意后由捐助者(伦理乌尔姆大学的协议编号88/12)完整的头发的头发根被拔光聚集在消毒后头皮。我们使用头发健康志愿者(年龄在24 - 45岁之间,男性和女性性别)。
2.2。hiPSC生成和细胞培养
角化细胞获得从人类头皮头发已经描述了22]。与香港补充角质细胞在EpiLife传播媒介(两种表达载体,卡尔斯巴德、钙、美国)。hiPSCs被慢病毒转导角质细胞产生四个重组因子(Oct4、Sox2 Klf4,和cMyc)如前所述[23]。重组后对大鼠胚胎成纤维细胞他们保持feeder-free基底膜基质(BD生物科学,富兰克林湖,新泽西,美国)涂覆盘子mTeSR1介质(干细胞技术、温哥华、钙、美国)。
2.3。基因表达微阵列
基因表达微阵列进行6角化细胞样本和9 hiPSC样本与安捷伦整个人类基因组芯片工具包(4 x44k微阵列工具包G4112F,安捷伦科技,圣克拉拉,CA,美国)。500 ng的总RNA用于生产Cy3-CTP-labeled cRNA RNA与安捷伦低输入班轮放大设备。cRNA纯化和1,65μ每个数组g为杂化17在65°C和10 r.p.m h。与安捷伦基因表达之后,数组被洗了洗缓冲区1和2与乙腈最后1分钟。幻灯片进行扫描使用分辨率的扫描控制7.0软件5μm。扫描数据提取与特征提取9.1软件。表达水平背景调整和分位数规范化GeneSpring GX 12软件。微分表达式使用学生的角化细胞和hiPSCs之间进行了分析t以及。> 2和褶皱变化值< 0.05被认为是显著的和突出显示粗体(upregulation)或斜体)差别(对这些基因在结果表中。的比较与iPSC-derived神经元的细胞则发表的数据GSE34879 (GSM856936、GSM856937 GSM856915, GSM856916)和心肌细胞GSE17579 (GSM438022、GSM438026 GSM438034, GSM438021, GSM438032, GSM438036)使用(从NCBI基因表达综合,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。褶皱变化如果> 2所示。
3所示。结果
3.1。离子通道的微分表达式hiPSCs相比,角化细胞
我们首先比较各种离子通道的表达家庭从hiPSCs hiPSCs角质细胞和心肌细胞和神经元,分别。从387年调查(表1)绑定hiPSCs离子通道基因从父母的角化细胞,101(26%)显示,表达显著增加(褶皱变化> 2,;以粗体标记),而23(6%)明显下降(褶皱变化>−2,;在斜体标记)。在第二步不同监管从hiPSCs hiPSC-derived神经元离子通道进行调查,我们发现29离子通道转录调节(褶皱变化> 2;以粗体标记),而6明显下降(褶皱变化>−2;在斜体标记)。心肌细胞,mRNA水平的只有7离子通道成员调节(褶皱变化> 2;标记以粗体显示)和10 mRNA水平明显下降(褶皱变化>−2;在斜体标记)。
3.2。电压门控钙通道
电压门控钙通道参与Ca是至关重要的2 +涌入从而发挥重要作用在几乎所有细胞的钙信号。High-voltage-gated渠道包括神经n型钙通道,定义糟糕brain-specific异形战机渠道,密切相关的P / q型通道,和dihydropyridine-sensitive l型渠道负责兴奋收缩偶联的骨骼,光滑,和心脏肌肉以及激素分泌的内分泌细胞(了24])。而主要为钙离子渗透他们也为钠离子表现出低渗透。经细胞去极化他们调解钙流入细胞。通道由主要的α亚基以及监管βα2 /δ,γ亚基。的亚基形成离子进行孔隙而相关联的子单元的一些功能包括调制控制(25]。CACNA1A突变是参与共济失调(例如26]。我们分析了他们的表达与42探针。在重组期间14(33%)都显著调节只有1(2%)显著下调。从万能干细胞的神经元,如预期的那样,神经alpha-subunitsCACNA1D, CACNA1Eareupregulated连同几个神经通道亚单位(α2δ,β,γ)。在心肌细胞中,心脏的α亚基CACNA1C是调节。值得注意的是,没有任何电压门控钙通道分化后代表达下调。
3.3。Sperm-Associated阳离子通道
Sperm-associated阳离子通道或CatSper蛋白通道是钙离子通道。他们是鞭毛蛋白参与精子的运动性,因此影响生育(27]。在万能干细胞重新编程,从7使用探针只有一个显示和没有差别明显对这些重大upregulation。我们观察到在分化后代没有什么值得注意的。
3.4。烟碱乙酰胆碱受体
尼古丁乙酰胆碱受体发挥作用在interneuronal突触和神经肌肉接头。他们是由五个子单元作为homomeric或者heteromeric受体。它们位于突触后网站和绑定的乙酰胆碱他们允许阳离子的传播,特别是钠离子和钾离子,也在一些版本钙离子。这导致膜的去极化和触发器进一步信号通路(28]。乙酰胆碱受体和子单元被认为在各种pathomechanisms扮演的角色,例如,精神疾病,心血管疾病、癌症29日- - - - - -31日]。来自21个探针,5(24%)显示一个重要upregulation虽然3(14%)显示从角质细胞到细胞则差别明显对这些。只在神经元,神经元烟碱乙酰胆碱受体CHRNA6α亚基是调节,在心肌细胞。
3.5。循环Nucleotide-Gated渠道
循环nucleotide-gated通道形成四聚物的通道在绑定cGMP-allow流的阳离子。,这些渠道追踪细胞内浓度cNMPs产生电压的响应(32]。他们的主要角色是杆感光细胞去极化,但他们也发现在其他组织如嗅感觉神经元(33),睾丸、肾脏或心脏(34),在细胞发展中发挥作用,如神经生长锥的指导(35]。据报道,这些基因缺陷导致色素性视网膜炎(36]。从7使用探针显示一个重大upregulation和一个显示在重组(14%),差别明显对这些虽然是心肌细胞分化的神经元或不同的监管。
3.6。GABA受体
GABA(γ-氨基丁酸)受体ligand-gated氯通道。自GABA是主要的抑制性神经递质在中枢神经系统GABA受体脑功能起着重要的作用。受体是由五个单元heteromers形式。GABA受体的药物目标麻醉剂和其他精神药物。我们分析了29个探针内GABA受体亚基。万能的角化细胞,其中6例(21%)显著调节只有一个(3%)显著下调。有趣的是,没有一个是在神经元分化或表达下调,GABRB3表达下调,GABRP在调节心肌细胞。到目前为止,或多或少不知道GABA受体或心肌细胞的子单元。
3.7。甘氨酸受体
甘氨酸受体抑制受体的突触后的网站。它们由甘氨酸激活和调节氯离子的大量涌入。因此,GlyRs调节不仅运动和感觉神经元的兴奋性,也是必不可少的感光信号的处理,神经发展,炎性疼痛敏感(37]。heteromeric毛孔是由五个单元。关于他们在pathomechanisms的角色,据报道,突变是导致hyperekplexia(也称为惊吓疾病)38]。我们有7探测和分析他们在hiPSCs显著改变。转录水平alpha2单元和β亚基在分化神经元高度调节,指着他们在神经系统功能的作用。
3.8。Ionotropic谷氨酸受体
谷氨酸是主要的兴奋性神经递质在中枢神经系统。因此,ionotropic谷氨酸受体为学习和记忆过程中发挥关键作用。他们位于突触后膜,由几个heteromeric子单元。Ionotropic谷氨酸进一步分为AMPA受体(丙酸alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole), NMDA (n -甲基- d)或根据kainate受体受体激动剂的敏感性。来自36个探针,5例(14%)显示显著增加表达式和2例(6%)显示表达式相比,则降低角质细胞。正如预期的那样,几个子单元是调节神经元(没有下调)。没有在心肌细胞调节,而kainate亚型GRIK5表达下调。
3.9。Hyperpolarization-Activated循环Nucleotide-Gated渠道
Hyperpolarization-activated循环nucleotide-gated通道是为形成和形成一个Hyperpolarization-activated钾通道。CNG频道显示一个非常复杂的heteromeric结构与各子单元和域发挥重要作用在它们的功能39]。他们导致心脏起搏器电流(40),但也发现在神经元41]。我们分析了5个探头,其中3例(60%)显示一个重要upregulation虽然没有重组后表达下调。在神经元HCN3通道记录是调节中扮演重要角色在一些神经功能包括基底神经节输出神经元的兴奋性(42]。虽然HCN4例如中扮演着一个关键的角色在心脏的传导系统,我们没有观察到心肌细胞特定的监管。
3.10。5 -羟色胺受体
血清素(5 -羟色胺)受体ligand-gated受体主要发现presynaptically神经元。3型受体是唯一的离子通道,另5 -羟色胺受体G-protein-coupled受体。它形成一个heteropentameric孔隙根据血清素激活允许钠和钾的流动,导致去极化。5 -羟色胺受体调节神经功能,因此参与各种脑功能。分析6探针型3显示的一个重要upregulation 5 -羟色胺受体2(为33%HTR3A)调查虽然在hiPSCs表达下调。虽然我们预计5 -羟色胺受体在神经元分化,调节神经元或心肌细胞没有调节亚基,而只有受体转录HTR3A在神经元表达下调。
3.11。电压门控钾通道
电压门控钾通道是由一大群子单元具有不同特点例如失活速度。功能的通道是由heterotetramers。的通道是非常具体和低亲和力钾钠或其他阳离子。电压门控钾通道负责复极化sodium-mediated兴奋后兴奋性细胞的动作电位,因此发现在神经元和其他细胞动作电位。我们分析了81个探针。角化细胞hiPSCs, 25(31%)显著调节只有3(4%)显著下调。在神经元中,几个单元调节包括KCNB1,为Kv2.1和编码KCND2更出名的,都是在心脏细胞兴奋性以及他们的作用KCNF1 KCNH8,和KCNIP1,所有已知的神经元兴奋性的贡献43]。应该注意的是,KCNT1实际上是钠激活但是字母列表中包括一个更好的概述。此外,几个“S”子单元调节(KCNS2在神经元)或表达下调(KCNS3在神经元;KCNS1在心肌细胞和3)。这些单元无法形成功能通道作为与其他alpha-subunits homotetramers而是heterotetramerize形成导电通道。这些亚基参与修改通道响应和电导率(44]。一些其他组织中了解不同的角色,例如,但他们与疼痛调制(45)或气道反应(46]。
3.12。内心整流钾通道
内心整流钾通道有更高的倾向于允许钾离子流入细胞而不是外部的细胞。因此,他们发挥重要作用在维护静止膜电位。他们的激活是本构或由ATP控制绑定和g (47]。功能通道是形成人类——或者heterotetramers。这些渠道可以找到主要在神经元,心脏细胞、胰腺、肾脏。从20分析探针在hiPSCs角质细胞相比,8例(40%)显示一个重要upregulation和3(15%)显著下调。GIRK2信道编码KCNJ6在神经元调节中扮演多个角色各种组织包括胰腺和大脑48,49),与癫痫发作有关老鼠缺乏基因(50]。另一方面,Kir6.1,编码KCNJ8,调节心肌细胞和被报道参与心脏骤停在早期复极化综合症的发病机制(51]。
3.13。两个p钾离子通道
两个P钾离子通道包含两个造孔P域。二聚作用后形成一个外向整流钾通道。他们可以发现在几个组织和各种化学或物理手段激活(TRAAK渠道)。我们分析了23个探测器。4(17%)显著调节而4(17%)显著下调。在神经元KCNK3重要,设置静止膜电位和挥发性麻醉剂(主要目标52),以及KCNK4,机械封闭,导致轴突寻路,生长锥的能动性,和神经突伸长,以及可能有一个角色或疼痛联系检测(53,54),是调节。KCNK5和6个表达下调。的差别在心肌细胞,对这些基因KCNK5观察和12。
3.14。Calcium-Activated钾离子通道
Calcium-activated钾离子通道主要是激活细胞内钙;一些家庭成员也电压门控。家庭由大,中间,和小电导的家庭成员。通道是由两个单位(KCNM家庭)或最常见的四个单元(KCNN家庭)。例如,它们参与afterhyperpolarization后神经元的动作电位和主要是发现。此外,他们扮演着不同的角色在细胞机制,包括干细胞生物学(4- - - - - -6,55]。我们分析了18探针的9(50%)显著调节和重组后没有明显下调。在神经元中,只KCNN2在心肌细胞表达下调,而KCNMA1大电导bk通道编码,参与心率调节(56),是调节。
3.15。P2X受体
P2X受体受体细胞外ATP和激活打开离子通道,主要是钙。英吉利海峡是由人类——或者heterotrimers。他们发现在几个组织,主要是在神经系统和肌肉组织。它们参与一系列生理过程如突触传递的调制,血管,心脏节律,收缩性和免疫反应(57- - - - - -61年]。在干细胞P2X受体对胚胎干细胞增殖的影响报道(62年]。从9分析探针1(11%)显著调节和表达下调。这些受体/渠道管理在分化后代。
3.16。瞬时受体电位通道
瞬时受体电位通道(TRP通道)的非选择性阳离子通道。他们显示不同的偏好阳离子以及不同的激活机制和功能。TRP通道广泛表达整个有机体调解等多种功能。这些包括在其他传感器活动范围广泛的肥厚性刺激和突变TRPM4现在公认的原因人类心脏传导障碍(了63年])。此外,TRP通道与一些疾病的发作或恶化有关,和缺陷基因编码TRP通道(所谓的“TRP channelopathies”)构成某些神经退行性疾病由于异常的Ca2 +信号属性(综述(64年])。此外,TRP通道影响干细胞分化和生存65年,66年)和参与neuronal-stem-cell-derived发展(67年]。我们分析了40调查。重组后,11(28%)显著调节和没有明显下调。在神经元,这些渠道是显著地调节而单纯TRPC3据报道在心肌细胞调节,参与传导干扰引起的腺苷受体A1AR增强输入通过TRPC3通道(68年]。
3.17。电压门控钠通道
电压门控钠通道主要包括α单位和一些可选的调节或管理单元。他们是高度选择性的钠和参与多种细胞功能包括动作电位的形成(69年]。从24个探针分析,6(25%)显著调节和两个(8%)显著下调“诱导多能性”细胞的角化细胞。这些通道似乎表达不同种类的干细胞,在开发过程中70年- - - - - -72年]。这是进一步报道,例如,SCN5A“诱导多能性”细胞高度调节,参与癌症干细胞入侵(73年]。SCN2A,SCN3A,和SCN3B描述在神经元调节,参与神经元兴奋和癫痫发病机理(74年]。虽然电压门控钠通道扮演多个角色也在心脏系统(70年,75年,76年),我们观察到没有这个频道家庭在心肌细胞的变化。
3.18。Nonvoltage-Gated钠离子通道
上皮nonvoltage-gated钠通道是阿米洛利敏感。它们形成heterotrimers和参与离子液体运输在多个器官的上皮细胞。我们分析了6个探针和一个(17%)的显著调节而没有明显下调。有趣的是,调节SCNN1A在“诱导多能性”细胞随后下调在神经细胞和心肌细胞,指着一个可能的功能的干细胞。值得注意的是,它已经表明,镇压由视黄酸压制的多能性SCNN1A基因与其他几个多能性因素(77年]。
3.19。二端口通道
二端口通道cation-selective离子通道激活第二信使烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAADP)。在激活钙释放细胞内的商店(78年]。我们分析了5探头虽然没有一个显著调节两个(40%)显著下调“诱导多能性”细胞的角化细胞。这些渠道管理在神经元或心肌细胞。
3.20。Zinc-Activated Ligand-Gated离子通道
的zinc-activated ligand-gated绑定的锌离子通道被激活。直到现在一个家庭成员是已知的,在一些组织中表达79年]。它的确切功能尚不清楚。所示的表达没有明显改变探针在所有细胞。
4所示。讨论
虽然离子通道主要以他们的角色在他们可以发现在几乎所有电激细胞组织和另外参与各种过程,如细胞分化和成熟3,4,6,12,24,47,70年]。这些大量的通道蛋白仍然低估了关于他们的角色在胚胎发育和细胞命运的决心。最有趣的一个在体外模型发展过程的说明,针对疾病的细胞损伤是由多能干细胞。因此,我们感兴趣的离子通道表达hiPSCs重组后,将这组与iPSC-derived分化后代,即神经元和心肌细胞。对离子通道在hiPSCs我们旨在开始与基因表达微阵列数据分析。比较,我们选择的细胞produced-namely, keratinocytes-as细胞类型的引用。6角化细胞的比较样本9 hiPSC样本应该最小化hiPSC线之间的经常观察到的差异。我们发现近三分之一(32%)的离子通道探测我们调查显示一个重要基因表达的变化。值得注意的是,这是一个upregulation。另外,虽然许多离子通道基因没有表达他们在hiPSCs角质细胞。这表明一些分析通道组未知可能扮演角色在干细胞生物学,例如,体内平衡,增殖或分化。有趣的是,分化成神经元或心肌细胞后,随后监管相对较小的组。 This includes ion channel transcripts playing important roles in the respective tissues. Nevertheless, we compared already published sets of data from different experimental setups and additionally limited the analysis to a strong fold regulation. This might lead to high dropout rates of regulated genes during measurement. Still, various channel transcripts were “logically” up- or downregulated during differentiation into neurons or cardiomyocytes, following embryonic development. iPS cells and especially patient-specific iPS cells from persons suffering from genetic mutations leading to hereditary syndromes are a very valuable tool to investigate pathogenetic mechanisms and disease associated molecular and cellular changes [80年- - - - - -82年]。各种通道亚型参与多个致病的机制是进一步分析通道记录有趣的监管病人具体的“诱导多能性”细胞和分化后代阐明疾病可能的研究途径。
关于提出的研究显然,基因转录水平没有明确规定模仿蛋白质含量和转译后的修改或蛋白质的活动。这组数据是试图描述一个全球转录监管概述离子通道的发展在不同的步骤。应该注意的是,在这种情况下,一些基因探针绑定在一个他们不显示upregulation相同。有时他们表现出同样的趋势,但意义小姐,但在某些情况下也有相当大的差异。这可能暗示某些未知剪接变体。更详细的研究这些假设的剪接变体可以给洞察其功能,扩大知识仍然稀缺。
这项工作的目的是成为一个起点和指导未来工作专注于单一渠道及其组成、定位和功能hiPSCs及其分化后代。这些研究可能会更好在体外差异化协议但也解释了一些相关的许多疾病pathomechanisms在离子通道基因突变。
利益冲突
没有利益冲突声明。
确认
作者感谢Sabine Seltenheim优秀的技术援助使我们的实验室研究。使本文的研究是由来自乌尔姆大学的医学院奖学金(Bausteinprogramm, l . SBR.0011)和德意志Forschungsgemeinschaft (Alexander Kleger KL2544/1-1, Stefan Liebau BO1718/4-1),德国心脏研究基金会(F / 34/11;亚历山大Kleger和Stefan Liebau), Else-Kroner-Fresenius-Stiftung (2011 _a200;亚历山大Kleger和Stefan Liebau),勃林格殷格翰集团国际(Stefan Liebau它们;亚历山大Kleger C1),和亥姆霍兹公司协会(vh - vi - 510托拜厄斯·m·boecker和Stefan Liebau)。亚历山大Kleger亏欠的巴登-符腾堡州Stiftung Eliteprogramm金融支持的研究项目的博士后。