开发一种新的两步协议从沃顿商学院的Jelly-Derived生成功能性肝细胞在缺氧条件下间充质干细胞

文摘

缺乏捐赠的肝脏和肝细胞是肝移植的主要限制。因此,代hepatocyte-like细胞治疗的应用程序可以提供替代选择。在这项研究中,我们开发了一种新方法建立肝细胞从沃顿商学院的jelly-derived间充质干细胞(WJ-MSCs)细胞系WJMSCs-SUT1和WJMSCs-SUT2缺氧条件下。这种新方法能快速驾驶WJ-MSCs细胞系为肝血统在18天。证实了实现肝原性的分化表型和功能的描述。超过80% MSCs-derived hepatocyte-like细胞(MSCDHCs)实现功能性肝细胞包括肝标记基因和蛋白表达水平,糖原存储、低密度脂蛋白的摄取、尿素生产,白蛋白分泌。这项研究强调了建立新的肝原性的感应协议在缺氧条件下为了模拟缺氧微环境中典型的细胞生理学。总之,我们提出一个简单,高效,节省时间的协议的生成功能从WJ-MSCs hepatocyte-like细胞缺氧状态。这种方法的成就可能克服供体肝细胞的限制,提供了一种新的途径治疗价值在肝脏细胞治疗威胁生命的疾病,再生医学,药理学药物筛选毒性测试,和其他医疗相关的应用程序。

1。介绍

原位肝移植已被证明是一种有效的治疗患者肝功能异常的结束阶段。然而,这种治疗方法是限制了捐献器官的短缺。虽然肝细胞移植治疗已被证明是成功的在某些情况下,如liver-based代谢紊乱,捐献器官不足和肝细胞仍然障碍这种技术(1]。最近,干细胞是一种很有前途的工具,使用细胞疗法因其优越的属性包括自我更新和广泛的潜在成几个细胞类型分化。到目前为止,间充质干细胞(msc)已被证明获得承诺能力不仅multilineages分化潜能,而且免疫调节特性(2]。此外,msc可以广泛地扩大在体外,由于有效的低温贮藏和容易访问等各种来源的骨髓、脂肪组织、羊水、胎盘脐带沃顿的果冻,(3- - - - - -6]。这些使得msc成为一个好的干细胞治疗的临床应用目标候选人。

脐带沃顿的果冻是一个丰富的msc具有优越的优势来源等其他来源的收集,与msc(更少的道德问题,和浓缩7]。几项研究已经表明,msc从各种来源包括沃顿jelly-derived间充质干细胞(WJ-MSCs)具有肝原性的分化潜能在体外和在活的有机体内(8- - - - - -13]。有趣的是,hepatocyte-like细胞产生脂肪tissue-derived msc显示在小鼠模型的治疗效果与急性肝衰竭和慢性肝损伤(14,15]。最近的研究也报道临床改善晚期患者移植后慢性丙型肝炎肝衰竭的骨骨髓来源hepatocyte-like细胞(16]。基于这些数据,从msc代hepatocyte-like细胞再生医学在临床应用显示了巨大的潜力。

根据先前的出版协议,几项研究已经表明昂贵的成本,耗费时间,多个步骤诱导msc向肝血统(10,17- - - - - -21]。因此,一个更简单的方法需要建立一个有效的协议,生成功能hepatocyte-like细胞msc。在这项研究中,我们开发了一种新方法诱导WJ-MSCs细胞系,WJMSCs-SUT1, WJMSCs-SUT2,肝血统其次是表征的MSCs-derived hepatocyte-like细胞(MSCDHCs)在细胞和分子水平。在这里,我们显示肝原性的分化的成就的WJ-MSCs在缺氧条件下使用我们新的感应协议。hepatocyte-like细胞产生WJ-MSCs提供一个替代的功能性肝细胞来源,将提供巨大的优势在肝脏疾病的治疗,药物发现,包括毒理学研究和其他的医学应用。

2。材料和方法

2.1。细胞系

两个人类WJ-MSCs细胞系,WJMSCs-SUT1 WJMSCs-SUT2,建立,以博士Wilairat Leeanansaksiri的实验室(Suranaree科技大学、泰国)。WJMSCs-SUT1和WJMSCs-SUT2源自WJ-MSCs的培养在杜尔贝科修改鹰的介质为1.0 g / L葡萄糖(DMEM-LG)(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)含10%胎牛血清(的边后卫)(美国UT HyClone,洛根)和胚胎干细胞条件培养液(装备)37°C公司为5%₂和5%啊₂,分别。两个细胞系表达细胞表面标记:CD29⁺,CD44⁺,CD90⁺,CD34⁻、CD45⁻,包含能力分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和间充质干细胞的标准特征。

2.2。肝原性的诱导分化在体外

WJMSCs-SUT1和WJMSCs-SUT2扩展直到达到90%融合然后遭受到肝细胞分化过程通过使用我们的新两步协议(图1)。短暂,WJMSCs-SUT1 WJMSCs-SUT2分别孵化阶段1中分化培养基含有血清DMEM-LG补充与100 U /毫升青霉素(σ,圣路易斯,密苏里州,美国),100年μg / mL链霉素(σ,圣路易斯,密苏里州,美国),2μg / mL两性霉素B(美国纽约百时美施贵宝),20 ng / mL人类肝细胞生长因子(HGF) (Peprotech,落基山,新泽西,美国),10 ng / mL纤维母细胞生长因子4 (FGF-4) (Peprotech,落基山,新泽西,美国),和5毫米烟酰胺(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)7天。随后,在第二阶段分化培养基培养这些细胞进一步实现肝成熟的组件作为血清DMEM-LG补充与100 U /毫升青霉素(σ,圣路易斯,密苏里州,美国);100年μg / mL链霉素(σ,圣路易斯,密苏里州,美国);2μg / mL两性霉素B(美国纽约百时美施贵宝);40 ng / mL制瘤素M (OSM)(σ,圣路易斯,密苏里州,美国);2μ地塞米松(σ,圣路易斯,密苏里州,美国),和20μl /毫升胰岛素,转铁蛋白、硒(+预混料)(BD生物科学,富兰克林湖,新泽西,美国)18天。每周两次分化培养基的改变。未分化细胞从2细胞系作为消极的控制。

2.3。免疫荧光染色

细胞被固定为4%多聚甲醛在室温下10分钟和permeabilized Triton x - 100 0.3%磷酸盐(PBS) 20分钟。非特异性免疫染色阻止了30分钟孵化的细胞在PBS溶液含有3%牛血清白蛋白(BSA)(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)在室温下。细胞培养在屏蔽解决方案在一夜之间在4°C主要抗体如下:兔多克隆反白蛋白(铝青铜)和小鼠单克隆反细胞角蛋白18 (CK-18) (1: 100) (DakoCytomation、斯特鲁普、丹麦)。细胞被洗3次与PBS和孵化1小时在室温下与二次抗体FITC-coupled多克隆山羊anti-mouse免疫球蛋白G (1: 100) (BD生物科学,富兰克林湖,新泽西,美国)或FITC-coupled多克隆猪anti-rabbit免疫球蛋白G (1: 100) (DakoCytomation、斯特鲁普、丹麦)。细胞核染色的透露了3分钟核染料4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。3洗后,细胞和抗衰落安装解决方案(美国向量实验室,伯林盖姆,CA)和荧光显微镜下检查(BX51)(奥林巴斯、日本)。

2.4。周期性Acid-Schiff (PAS)染色

4%多聚甲醛固定后,细胞被孵化5分钟在1%高碘酸(σ,圣路易斯,密苏里州,美国),用蒸馏水洗净前孵化与品红试剂(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)15分钟。在自来水洗5分钟后,苏木精复染色进行1分钟。光显微镜下细胞被清洗和可视化(CKX41)(奥林巴斯、日本)。

2.5。低密度脂蛋白测定吸收

低密度脂蛋白(LDL)的吸收与Dil-Ac-LDL染色检测设备(生物医学技术,斯托顿,妈,美国)。执行的分析是根据制造商的指示。简单地说,包含10个细胞在无血清DMEM-LG孵化μ克/毫升1,1′-Dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate-acetylated-LDL (Dil-Ac-LDL) 4小时37°C。荧光显微镜下细胞进行清洗和可视化(BX51)(奥林巴斯、日本)。

2.6。尿素测定

细胞和血清含有5毫米NH DMEM-LG孵化₄Cl(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)为24小时。在上层清液尿素浓度测定,比色测定QuantiChrom尿素测定工具包(美国生物测定系统,海沃德,CA)根据制造商的指示与吸光度读者(基准+)(Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国)。未分化细胞(0)和人类肝癌细胞系(HepG2)表示为负控制和积极控制,分别。

2.7。白蛋白测定

成就后分化,白蛋白浓度在上层清液由ELISA试验筛选AssayMax白蛋白酶联免疫试剂盒(Assaypro,圣查尔斯,密苏里州,美国)根据制造商的指示与吸光度读者(基准+)(Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国)。细胞培养上清液从(0)和未分化的细胞HepG2被表示为一个消极的控制和积极控制,分别。

2.8。RNA提取和rt - pcr

细胞受到总RNA提取总RNA通过使用迷你包(组织)(Geneaid、台湾)和核糖核酸酶抑制剂治疗(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的协议。互补脱氧核糖核酸是由RevertAid第一站互补脱氧核糖核酸合成装备(Fermentas、圣Leon-Rot、德国)根据制造商的协议。PCR反应混合液中增加相应的cDNA包含10 x PCR缓冲,1 U Taq 25更易与L MgCl₂、10 L更易与核苷酸混合和10μmol / L的每个引物组相应的目标基因。使用的引物序列见表1。放大条件如下:最初在95°C变性5分钟后跟35周期为45秒95°C的变性,在56 - 62°C退火30秒(见表1指温度使用),在72°C扩展1分钟,最后在72°C扩展10分钟。样本2%琼脂糖凝胶上分离,用溴化乙锭染色,在紫外光照射下拍摄。未分化细胞HepG2被表示为一个消极的控制和积极控制,分别。

2.9。统计分析

所有数据都表示为平均值±标准偏差(SD)计算。由SPSS17.0统计软件统计分析计算(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL),学生的结果进行了分析t以及与意义。

3所示。结果

3.1。细胞形态学的MSCs-Derived Hepatocyte-Like (MSCDHCs)

细胞的形态学改变决心0天,7,分化后10日和18。感应后,我们观察到从成纤维细胞的细胞形态改变WJ-MSCs成多边形圆细胞肝细胞的功能。超过80%的WJMSCs-SUT1和WJMSCs-SUT2可以诱导成hepatocyte-like细胞形态的归纳。此外,WJMSCs-SUT1形态从成纤维细胞的形状变成了上皮圆形稍早在10天的区别而WJMSCs-SUT2显示这个特性在12天(图2)。控制,2细胞系没有显示自发分化成hepatocyte-like细胞文化时期(数据没有显示)。

3.2。Hepatic-Lineage标记的表达

hepatic-lineage标记的mRNA表达在不同时间点测定分化时期。我们发现的未分化阶段WJMSCs-SUT1 WJMSCs-SUT2可以表达一些hepatic-specific基因记录包括水平低AAT,铝青铜,CYP3一个4,G6P(图3)。感应,MSCDHCs两2细胞系生成显示成熟肝的重要upregulation标记,AAT和CYP3一个4,时间的方式。另外,我们观察到的相关性肝关键转录因子的表达,,肝和成熟的标志铝青铜在MSCDHCs生成2细胞群。有趣的是,在后期的分化,WJMSCs-SUT2有更快的响应比WJMSCs-SUT1 hepatic-lineage感应。这个结果是由早期的表达成绩单天12时检测不到的MSCDHCs WJMSCs-SUT1同一天。然而,WJMSCs-SUT1和WJMSCs-SUT2可以表达所有测试hepatic-lineage标记在mRNA水平分化期(图的最后阶段3)。

我们进一步分析了更加成熟的肝标记,白蛋白(铝青铜)和细胞角蛋白18 (CK-18),在蛋白质水平。CK-18的低表达在未分化的阶段(0)这两个细胞系(数字4(我),4(m))。分化后,超过80% MSCDHCs生成两2细胞群显示重要的铝青铜upregulations(数字4(一)-4(h))和CK-18(数字4(我)4(p))时间的方式。这些发现表明,WJMSCs-SUT1和WJMSCs-SUT2也可以表达hepatic-lineage标记蛋白质水平以应对我们的感应中除了其他肝mRNA表达。总的来说,这些结果说明WJMSCs-SUT1 WJMSCs-SUT2可能诱导成hepatocyte-like细胞特性不仅在细胞表型方面而且在肝标记表达式mRNA和蛋白水平。

3.3。肝细胞功能MSCs-Derived Hepatocyte-Like细胞

肝细胞的生物学功能进行评估在分化细胞在分化不同阶段。首先,分析了糖原存储的容量PAS染色。结果显示低水平的PAS染色在未分化的阶段(0)天WJMSCs-SUT1 WJMSCs-SUT2。然而,产生感应,MSCDHCs 2细胞系的糖原颗粒明显的阳性染色显示细胞质早在7天更强的染色12天18(图和最强的一天5(a))。此外,超过80%的分化细胞这两个细胞群有能力积累细胞内低密度脂蛋白(LDL)像功能性肝细胞以时间依赖方式而未分化细胞(0)没有执行这个能力(图5(b))。此外,白蛋白分泌和尿素生产也决定为了证实肝细胞功能。我们发现,未分化的阶段(0)天WJMSCs-SUT1 WJMSCs-SUT2并没有检测出分泌白蛋白即使他们已发现白蛋白基因和蛋白质表达水平。然而,在分化过程中,MSCDHCs两2细胞系生成不断分泌白蛋白自进入成熟一步从每天12 - 18(图6(一))。最后,我们还测试了代谢功能的分化细胞解毒氨脲是一种更少有毒。在一致性、分化细胞WJMSCs-SUT1和WJMSCs-SUT2可以生产尿素氨解毒过程分化期(图的所有点6 (b))。综上所述,这些数据表明,WJMSCs-SUT1和WJMSCs-SUT2可以提交对功能性hepatocyte-like细胞在缺氧条件下用我们的新肝原性的归纳协议。

此外,分化细胞的百分比已经评估基于肝表型(ALB-expressing细胞,CK-18-expressing细胞)和功能(低密度脂蛋白和PAS阳性染色细胞)通过计算每一个标记的阳性染色细胞的数量与总数量的细胞所引用的染色细胞核从相同的样本。肝表型的诱导肝细胞高表达状态标记铝青铜(WJMSCs-SUT1 %,%为WJMSCs-SUT2)和CK-18 (WJMSCs-SUT1 %,WJMSCs-SUT2 %)。肝的功能,这些细胞可以高度储存糖原细胞内所示阳性染色细胞的PAS染色(WJMSCs-SUT1 %,WJMSCs-SUT2 %),而超过80%的低密度脂蛋白阳性染色细胞中观察到两个2细胞系。综上所述,我们的开发协议在缺氧条件下可以产生功能性肝细胞的高收益从80年的90% WJMSCs-SUT1和WJMSCs-SUT2诱导的细胞。在这里,我们成功地生成的一种新方法建立高产和功能从WJ-MSCs hepatocyte-like细胞可能在临床应用优势,肝毒性药物筛选测试包括毒理学研究,和其他的医学应用。

4所示。讨论

预计WJ-MSCs作为一个有前途的治疗目的的工具。这主要是由于其广泛差异化能力,非侵入式收集,和低免疫原性。他们有免疫调节刺激T细胞的抑制作用在体外这将是一个优势外源的移植(26]。先前的研究发现,人类脐带基质干细胞可成功异种器官移植到免疫活性的老鼠与很少或没有宿主免疫反应(27]。这些发现支持低免疫原性WJ-MSCs的属性在体外。此外,WJ-MSCs有更广泛的分化潜能等多种细胞类型胰岛素生产细胞(28),神经细胞(29日),心肌细胞(30.)包括hepatocyte-like细胞(17]。此外,临床前研究发现WJ-MSCs可以改善肝脏功能,恢复存活率,减少肝纤维化和肝损伤动物模型(13,31日]。尽管WJ-MSCs尚未应用于临床试验相关的肝脏疾病,最近的初步研究证明placenta-derived msc的安全和成功的治疗2型糖尿病患者(32]。根据他们的优势,WJ-MSCs似乎对肝脏疾病的治疗具有有益的影响。

在这项研究中,我们的目标是调查的新方法建立的效率在体外诱导WJ-MSCs与人类肝家族通过测试WJ-MSCs细胞系WJMSCs-SUT1和WJMSCs-SUT2。基于几种肝原性的归纳方法,我们开发了一种新的两步协议诱导在体外缺氧条件下肝原性的分化WJ-MSCs类似于人类生理的正常微环境。一般来说,现有的出版协议,用于肝原性的诱导msc在正常大气的20%执行O₂和5%的公司₂。在这里,我们使用低氧环境(5%啊₂和5%的公司₂)加速肝原性的分化的潜力WJ-MSCs基于这个条件的优越的优势。在人类胚胎干细胞,也有证据表明,缺氧是适合使用最终肝hepatocyte-like细胞诱导产生高收益(33]。此外,缺氧可以激活低氧诱导因子1 (HIF-1目标基因)表达asretinoic acid-receptor-related孤儿受体α()成绩单HepG2 [34]。Rora upregulations参与控制ADIPOQ和G6PC表达调控中扮演角色的脂质和葡萄糖在肝细胞新陈代谢,分别为(35]。从这些数据,缺氧似乎提供适当的环境维持生理活动包括hepatic-lineage分化肝细胞。此外,缺氧preculturing msc被证明能增加细胞归巢,移民,和移植效率在体外和在活的有机体内研究[36]。因此,它有可能缺氧条件也增强了这些效率MSCDHCs除了改善肝原性的分化。hepatocyte-like细胞产生缺氧条件可能保留这些承诺提供一个伟大的收益的能力在治疗的目的。

根据开发一个新的协议,实现MSCDHCs代观察WJMSCs-SUT1和WJMSCs-SUT2通过序贯治疗我们的新cytokines-based鸡尾酒的媒介。连续曝光的这些细胞因子是模仿老鼠胚胎肝脏发展的行为。在分化的早期阶段,我们使用FGF-4, HGF和烟酰胺的主要诱导因素。事实上,fgf表达的心脏中胚层扮演一个角色在感应腹前肠内胚层启动肝早期发育。之后,肝脏芽的形成是发生和快速hepatoblast增殖刺激hepatogenesis HGF,是一个关键因素。烟酰胺是一种水溶性酰胺的烟酸或维生素B3作为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD的主要前体⁺)和磷酸化衍生物辅酶ii⁺合成(37]。实际上,河畔⁺和辅酶ii⁺扮演角色在维持能量的细胞功能包括DNA修复和基因组的稳定性。肝原性的分化,烟酰胺已被证明加强主要鼠肝细胞的增殖,形成小肝细胞的殖民地(38]。基于这些数据,我们还利用烟酰胺结合第一阶段肝原性的感应介质。后期的分化,我们利用OSM,地塞米松,其主要因素。据报道,OSM分泌造血细胞参与胎儿肝细胞的成熟的命运18]。除了这些因素外,据报道,地塞米松需要维护liver-enriched转录因子的表达都是至关重要的,刺激肝脏特异性基因转录(39]。它被称为化学定义为支持补充在体外在各种哺乳动物细胞增殖。肝原性的感应,它似乎维持细胞生存单层在诱导期。因此,我们也使用地塞米松及其诱导更成熟肝细胞分化在我们的系统。

hepatic-lineage标记表达式,是一个关键liver-enriched转录因子,起着重要的作用在刺激肝脏特异性基因的表达在肝脏开发(40]。在肝原性的分化过程,早期的表达中检测出MSCDHCs产生WJMSCs-SUT2 12天,与成熟的肝upregulations标记如铝青铜,AAT,CYP3一个4所示。同样,MSCDHCs来自WJMSCs-SUT1显示的兼容性和hepatic-specific基因表达式但推迟到18天。这些发现暗示WJMSCs-SUT2有趋势分化成肝血统在回应我们的归纳法比WJMSCs-SUT1更快。虽然这些hepatocyte-like细胞可以表达所有成熟的肝标记,的表达法新社这是一个不成熟的肝细胞的标志还发现即使在后期的分化。这些数据表明,hepatocyte-like两2细胞系细胞或MSCDHCs生成包含一些hepatoblasts或肝祖细胞。同样,先前的研究表明,人类placenta-derived多功能细胞(41),脐带基质干细胞(17),间充质基质细胞来源于脐带沃顿的果冻10)尚未完全分化为成熟肝细胞,因为法新社表达式中还检测到分化细胞在诱导期。基于这些结果,msc与原始起源似乎保留了未成熟表型即使他们推动向特定的谱系。

后期的分化,MSCDHCs生成WJMSCs-SUT1和WJMSCs-SUT2实现特征的功能性肝细胞LDL吸收试验,证实了PAS染色为糖原存储、白蛋白分泌和尿素测定。相比以前的出版协议(10,17- - - - - -21),我们的方法提供了从WJ-MSCs hepatocyte-like细胞产量高,约80%以上的诱导细胞。我们的协议不需要任何涂层培养皿的细胞外基质物质增强肝原性的分化。此外,这种方法要求更短的分化时期,大约2周,相比其他协议的执行时间,至少为3周。在这里,我们将演示一个简单的,效率高,节省时间的协议功能从WJ-MSCs hepatocyte-like细胞的生成。总之,这些发现为一个提供一个新的选择在体外肝细胞一代可能克服的局限性肝细胞捐献者在临床应用中以供将来使用。

5。结论

总之,我们报告一个简单,效率高,节省时间的协议功能从WJ-MSCs hepatocyte-like细胞的生成。这种方法成功推动WJ-MSCs进入肝在缺氧条件下血统。证实了实现肝原性的分化表型和功能包括肝标记基因和蛋白表达水平,糖原存储、低密度脂蛋白的摄取、尿素生产,白蛋白分泌。MSCDHCs代从这个新方法的成就可能在临床应用提供更大的潜力和克服缺乏捐赠的肝脏原位肝移植的主要限制。这项工作的影响是治疗价值在细胞治疗肝脏疾病的治疗和其他再生医学,药物的肝毒性药物筛选方法,和其他未来的医学应用。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突的存在。

确认

这项工作是由国家研究委员会的泰国和部分Suranaree科技大学,泰国。

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