文摘

人类间充质干细胞(hMSCs)获得了强烈的研究兴趣因其免疫调节、组织分化、炎症和网站导航属性。尽管证据证明biodistribution注入hMSCs使用静态荧光成像靶器官或全身成像技术,令人惊讶的是鲜为人知的hMSCs如何动态地在宿主组织在单细胞水平上在活的有机体内。这里,我们注入荧光标记clinical-grade hMSCs成immune-competent小鼠中性粒细胞和单核细胞表达一个荧光标记在溶菌酶M (LysM)启动子。使用活体的双光子显微镜(TPM),我们能够首次捕捉动态hMSCs和LysM之间的相互作用⁺颅盖骨髓粒细胞的受体小鼠在实时系统有限合伙人的挑战。有趣的是,许多注入hMSCs完好无损尽管一再与宿主细胞接触中性粒细胞。然而,我们能够观察的破坏和随后的周围一些hMSCs粒细胞的吞噬作用。因此,我们的成像平台提供了机会来洞察hMSCs的生物学和治疗机制在活的有机体内在单细胞水平上在生活主机。

1。介绍

人类间充质干细胞(hMSCs)自我更新前体细胞能够分化为骨,脂肪组织,软骨,和骨髓基质细胞根据刺激(1]。可用数据表明hMSCs周的多效性的自然使他们感知和响应炎症过程的微环境(2]。虽然hMSCs被发现在低频率在活的有机体内在各种成人组织包括骨髓、肌肉,脂肪,和真皮,可以扩展到大量在适当的培养条件。出于这个原因,hMSCs一直在迅速扩张的临床应用治疗调查包括全世界有超过200的当前活动的临床试验(1,3- - - - - -6]。广泛的疾病,包括糖尿病、动脉粥样硬化、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、克罗恩病、心肌梗塞、中风、帕金森病、骨头和软骨修复,伤口愈合,移植物抗宿主病(1,3)已经使用hMSCs作为细胞治疗治疗。这些临床试验旨在探索的治疗潜力hMSCs关于它们的免疫调节特性,组织再生能力,贪污增强,组织保护和修复能力。同样,hMSCs已经应用在活的有机体内在各种人类疾病模型的有效性在immune-competent老鼠包括皮肤和脊髓修复(7],亨廷顿氏舞蹈症,[8),其他脱髓鞘疾病(9],移植物抗宿主病(10]。

尽管hMSCs强烈的研究兴趣和活跃的临床应用,已经有一些争议和小证据关于hMSCs biodistribution和实际的细胞行为的注入在活的有机体内。调查人员利用各种全身成像和静态组织学分析跟踪的存在和可能的本地函数hMSCs病变和正常解剖网站(11]。这些跟踪模式包括磁共振成像(12,13),近红外全身在活的有机体内成像系统(14)、铬⁵¹(Cr-51)跟踪15,生物发光和静态荧光显微镜(16- - - - - -21]。最近,Eggenhofer等人追踪的命运Cr-51标记同源的msc被注入静脉注射进C57BL / 6小鼠,表明可行的msc只能恢复肺灌注后24小时(22]。基于这些数据,作者得出结论,msc,而短暂的静脉输液后,可行的msc被困在肺组织细胞碎片运到和肝脏中清除,并且注入msc必须发挥其免疫调节和再生的影响通过一个第三方的细胞类型。

上述研究都是在证明有用,在炎症侮辱或组织损伤,注入hMSCs积累疾病地点,因此支持的假设在活的有机体内生存和自导靶器官的能力。然而,器官或whole-mouse跟踪研究缺乏完整的组织微环境内的单细胞决议全面探索注入hMSCs的行为。另一方面,高分辨率检测固定组织分析是动态信息的缺乏关于细胞迁移和相互作用,这是重要的免疫细胞功能的特点在活的有机体内。更有益的是个别hMSC相互作用动力学的研究在实时undisrupted活组织微环境。

在我们目前的研究中,我们利用活体的TPM监测静脉注入,荧光标记hMSCs免疫主管老鼠的骨髓中主机髓细胞表达溶菌酶M (LysM)主要是中性粒细胞,monocytes-can并处追踪在单细胞水平。通过观察在高清hMSCs和宿主先天免疫细胞之间的相互作用动力学系统前后有限合伙人的挑战,我们提供第一个本地窥hMSCs如何与周边的免疫细胞在本机小鼠骨髓环境中,从而直接反驳索赔的一项研究认为,由于可行的MSC不经过肺部,注入MSC的免疫调节和再生效果必须通过其他细胞介导的。此外,我们也被俘在活的有机体内的积极过程hMSC LysM-expressing骨髓细胞的破坏。

2。材料和方法

2.1。老鼠

C57BL / 6小鼠(# 664)获得杰克逊实验室(美国我巴尔港)。含有GFP插入C57BL / 6小鼠溶菌酶M轨迹(从托马斯•格拉夫博士)得到23]。Eight-to-twelve-week-old老鼠用于这些实验。动物被安置、繁殖、动物资源中心和处理设施凯斯西储大学根据经批准的协议。同样,所有动物实验和严格遵守执行积极实验动物协议批准凯斯西储大学制度动物保健和使用委员会。

2.2。细胞标记和注射

Clinical-grade来源于hMSCs获得造血干细胞核心设施的情况下在凯斯西储大学综合癌症中心,他们被扩大,拥有更新和tri-lineage分化潜能(chondrogenic成骨的,和脂肪形成的)(24- - - - - -28]。我们将这些细胞称为hMSCs而不是hMSPCs(人类间充质干细胞和祖细胞)(1)因为这些hMSCs已经展示了丰富的干细胞活动作为日常的一部分协议在造血干细胞设施综合癌症中心。简而言之,整除的冷冻hMSCs在预热完成媒体(解冻,洗αMEM补充谷酰胺、笔/喉炎,二性霉素b, 10% FCS)。他们然后用PBS洗两次,随后贴上5μM CellTracker红色CMTPX(英杰公司)或2.5μM CellTracker橙色CMTMR(首席技术官;在PBS英杰公司)在室温下15分钟。Two-to-four-fold卷PBS添加了1%的边后卫淬火标签反应和细胞与PBS洗两次。标记细胞被注入注射。在不同的浓度。表示,老鼠也注入了吗注射。100 ng美国血清有限合伙人(σ)。

2.3。鼠标手术和准备活体的成像

活体的TPM的颅盖了如前所述[29日]。短暂,小鼠麻醉喷雾异氟烷(2%的感应,1.5%的维护)30% O₂空气和放置在一个立体定向持有人/ 70%。头发上的头骨用Nair将剩下的头发被剪下来的头发洗。皮肤切除,和牙科丙烯酸被用来创建一个槽的颅盖保持水柱促进成像。动物的体温是36.5,38°C之间的监控和维护使用温控环境室、加热垫,和直肠探头在整个鼠标准备和成像。呼吸频率和动物反应被用来确保足够的麻醉水平。呼吸速率维持在~ 60 - 100每分钟呼吸和动物反应被脚和尾巴压力评估。10到30分钟在成像之前,老鼠注入注射。与100年μL(2.5毫克/毫升FITC-dextran(σ)或100μL的0.2μM qtracker - 655(表达载体)允许血管可视化显示。

2.4。TPM设备和数据采集

完成后,组织准备活体的成像,整个鼠标成像装置,包括立体定向持有人,是放置在显微镜下阶段,封闭在一个定制的温控环境室。组织在使用徕卡SP5装有DM6000阶段,20 x水油浸物镜(附加说明1.0;徕卡HCX-APO-L)和16 w Ti /蓝宝石红外激光(变色龙,连贯)调到激发波长800 nm和860 nm之间。成像平面(776×776μ米)收集在5μ米步骤是每隔30秒重复3小时屈服xyzt收集的数据集通过一个四通道nondescanned外部探测器使用一套过滤分离≤495海里,500 - 550 nm, 565 - 605 nm和625 - 675 nm发射光谱。原始图像数据集使用伊万里瓷器被用于处理和分析软件(BitPlane, Inc .)如下所述。

2.5。免疫荧光组织学

完成后的活体的骨髓成像,hMSC-infused老鼠被公司牺牲₂窒息。肺、肝、淋巴结和脾脏收获和固定在2% PFA在4°C。高分辨率xyz成像成堆的固定,unsectioned样本收集使用徕卡SP5 /双光子成像设备如上所述。分析了图像栈使用伊万里瓷器软件(BitPlane, Inc .)如下所述。

2.6。图像分析

高分辨率荧光4 d成像数据集来自活体的TPM实验分析了使用伊万里瓷器软件(BitPlane, Inc .)。一个典型的成像776×776×150的体积μ米³进行了分析。我们利用通道减法算法伊万里瓷器中可用软件为了确定hMSC-CTO信号的定位与LysM-GFP骨髓信号。简而言之,创建一个新的首席技术官渠道使用Matlab数学函数在伊万里瓷器频道首席技术官信号(通道3,即ch3)重叠GFP信号(ch2)被分:ch3-ch2。这个步骤减去绿色荧光蛋白的荧光通道的首席技术官通道在像素级别。细胞识别和跟踪进行使用功能点分析伊万里瓷器细胞直径为15μm。xyzt为hMSCs和LysM位置数据⁺电池出口到Matlab进行进一步分析hMSCs和LysM之间的互动频率⁺中性粒细胞。我们定义中性粒细胞与hMSC交互通过解析中的中性粒细胞的重心是20μ米半径的hMSC,而中性粒细胞的数量满足这个位置要求总细胞数在图像领域,获得时间和平均30分钟间隔平均%的细胞间的相互作用。确定定向迁移的中性粒细胞与hMSCs,我们比较个体的角组件瞬时速度的中性粒细胞25μ米半径hMSC和比较他们之间形成的矢量角的中性粒细胞和hMSC中心。我们认为任何中性粒细胞向(< 95°)或(> 95°和< 180°)hMSC并计算“细胞通量指数”定义为:(细胞迁移的细胞迁移towards-number数量)/总细胞内25μm hMSC半径。细胞被指定为迈向hMSC包括那些拥有切向方向角(90°),与绝对角度95°的极限值。

3所示。结果

测试biodistribution和组织归巢的潜在hMSCs immune-competent老鼠,我们荧光标记4×10⁶hMSCs药物静脉注射到C57BL / 6受体小鼠。一天后,这些老鼠接受了骨髓的活体的TPM成像通过完整的颅盖,和静态、固定器官TPM成像的肺、肝、淋巴结和脾脏(图1(一))。像预期的那样从其他发表报告,我们发现大量的注入hMSCs肺、肝脏和脾脏,与1443年、1825年和4142年细胞每毫米³分别成像组织。有趣的是,我们可以很容易的发现更少数量的hMSCs淋巴结和骨髓,每毫米90和337个细胞³分别成像组织(图1 (b))。

尽管我们很容易想象个人CMTPX⁺信号在不同解剖网站hMSC输液后,这些最初的在活的有机体内器官荧光标记的跟踪实验hMSCs黑暗背景的背景下在已知的成像领域充满了无数nonfluorescent宿主细胞。特别是,从第一组实验中,我们不能正式区分是否来自完整hMSCs可视化荧光信号,或从吞噬细胞,如中性粒细胞和单核细胞吞噬死亡hMSC碎片到达肝脏,淋巴器官或骨髓。事实上,最近的一份报告表明,至少在小鼠系统,活老鼠MSC由静脉注射只能发现在肺部,而只有MSC残骸被发现在肝脏和脾脏22]。为了严格测试,我们使用高分辨率动态TPM成像骨髓腔颅盖下面。此外,我们选择的收件人老鼠的基因编码绿色荧光蛋白(GFP)取代了LysM轨迹编码溶菌酶,一种酶,这种酶是粒细胞,如中性粒细胞中高度表达,在较小程度上,单核细胞(23]。使用这种荧光探针的结合,我们开始观察细胞完整性和标记hMSCs bone-marrow-resident中性粒细胞和单核细胞之间的相互作用(“粒细胞”)。我们荧光标记8×10的⁶hMSCs首席技术官和注射注射。成一个天真鼠标,然后进行活体的TPM成像小鼠骨髓腔的颅盖一天后。如图1可以可视化,多个hMSCs colocalize在同一个LysM骨髓的一般附近⁺粒细胞,大多数hMSCs接近粒细胞,一些细胞被认为是缺乏接触GFP⁺细胞(图2(一个))。大部分的可视化hMSC-associated CTO信号占据了骨髓血管周的地区,确认之前,发表的研究结果30.- - - - - -32)(图2 (b))。然而,CTO-labeled hMSCs不表达GFP(图2 (b))。通过严格的观察,一些首席技术官信号可被视为在GFP细胞内夹杂物⁺LysM⁺粒细胞,表明细胞残骸注入CTO-labeled hMSCs这些细胞内包涵体的来源被发现在LysM⁺细胞(图2 (c);白色箭头)。然而,在相同的成像领域我们也能够发现更大的首席技术官⁺细胞没有coexpress GFP信号,表明这些可能是完整,可行hMSCs注入一天前(图2 (c);黄色箭头)。因此,通过减去重叠GFP信号从活体的CTO信号成像序列,可以区分完整hMSCs GFP⁺LysM⁺粒细胞吞噬荧光hMSC碎片。相反,我们的数据表明,最近的报告,完整hMSCs确实生存过去的肺部和可以迁移到骨髓至少一天后注射。政府(22]。

配备的技术能力来检测单个hMSCs和粒细胞完整活老鼠的骨髓,我们应用时间分辨活体的TPM可视化和交互粒细胞动力学的响应,并hMSCs受体小鼠的骨髓进行活跃的系统性有限合伙人挑战(图3)。麻醉,hMSC-infused下鼠标位于TPM成像目标在连续的顺序xyz成像数据采集,我们注入100 ng美国血清有限合伙人注射。和可视化hMSCs和GFP的行为⁺粒细胞(补充电影1,见补充材料网上http://dx.doi.org/10.1155/2013/656839)。LysM⁺细胞与hMSCs只偶尔在两个小时前成像有限合伙人注入(数据未显示),第一个30分钟后有限合伙人注入(图3;= 0 -30′′)。30分钟左右开始注射LPS后,我们观察到戏剧性的变化在粒细胞行为,包括增加他们的瞬时速度和明显的整体活动(图3)。50分钟post-LPS政府,粒细胞开始集群(“群”)在一些hMSCs(数字3(一个)和3 (d);补充1)的电影。我们一起检查了几个参数,有助于观察中性粒细胞的“蜂拥”行为,即:(I)总细胞积累(反映总GFP荧光的变化;图3 (b));(2)neutrophil-hMSC接触的频率(计算时均%细胞间的相互作用;图3 (c));(3)迁移的速度和轨迹中性粒细胞(图3 (d));和中性粒细胞(IV)通量靠近和离开neutrophil-hMSC集群(枚举作为细胞变化指数;图3 (e))。总GFP信号(如总GFP的反映⁺粒细胞)在跟踪hMSCs变量,减少(图3 (b)面板1)或表现出瞬态波动信号强度(图3 (b),面板2),而其他hMSCs经历了戏剧性的GFP信号强度的增加随着时间的有限合伙人后注入(图3 (b)小组3)。为了进一步证明了动态招聘、集群、和直接细胞GFP之间的相互作用⁺细胞和一些hMSCs,我们分析了时均GFP的百分比⁺细胞内20遍历μm hMSCs半径。一些,但不是全部,hMSCs经历越来越多的与GFP的交互⁺粒细胞从有限合伙人治疗(60 - 90分钟后的数字3 (c)和3 (d))。这些动态数据表明,观察hMSCs没有遇到相同的粒细胞“蜂拥”行为在同一时间或程度不尽相同,一些标签hMSCs似乎没有参与“蜂拥”行为在整个成像会话。我们的观察LysM有助于解释观察到的行为⁺细胞显示粒细胞集群可以形成在骨髓内的不同地点不同时期后有限合伙人管理(补充电影1)。一些“群集”的位置发生在区域没有任何可观察到的标记hMSCs,可能大概是由于无标号的存在,内生基质细胞或msc刺激与TLR4受体激动剂(33- - - - - -37]。

理解的命运注入hMSCs尤其临床相关性的持久性和消除在活的有机体内可能与他们的临床疗效。如图2,LysM⁺粒细胞能够吞噬CTO-labeled hMSC的碎片,从完整,可行的hMSCs。为此,我们能够使用动态活体的TPM活动形象化死亡过程hMSC碎片和随后的分布和由多个LysM消化hMSC细胞碎片⁺细胞在骨髓(图4;补充电影2)。在40分钟的时间内,我们观察到一个hMSC消化成多个大片段(图4(一))。这些片段是由多个LysM⁺细胞(图4 (b))。至少一个的首席技术官⁺绿色荧光蛋白⁺细胞被远离集群迁移到血管(图4 (c))。CTO-containing GFP的荧光强度⁺细胞出现调光器与周围明亮的中性粒细胞(图4 (b),= 80′插图),这表明LysM迁移⁺ 细胞可能代表单核细胞的细胞(38,39]。有趣的是要注意,观察到的碎片hMSC过程开始之前,任何有限合伙人管理动物,表明部分注入hMSCs被积极消除之前出现炎症。此外,完整hMSCs最初观察到成像会话的开始(LPS)前一个小时还明显完好无损在整个两小时后成像跟踪注射LPS在中性粒细胞聚集行为。分析所有可用的图像数据集,我们观察到151首席技术官⁺事件在一小时成像会话有限合伙人管理之前,与18首席技术官⁺信号组成的完整hMSC细胞(11.9%)。在两个小时的数据采集有限合伙人管理后,我们观察143首席技术官⁺事件,有14首席技术官⁺信号生成的完整hMSCs (9.8%)。没有统计上的显著差异()之间的比例完整的首席技术官⁺hMSCs有限合伙人之前和之后的挑战,表明,至少在3小时的极限成像会话,有限合伙人管理没有造成加速破坏hMSCs的骨髓。

4所示。讨论和结论

有很多争论如何治疗管理hMSCs发挥其免疫调节功能在活的有机体内(即。,systemic versus local effect). In rodents, hMSCs have been shown to confer therapeutic effects on the outcome of various disease models including systemic lupus erythematosis (SLE) and sepsis [40- - - - - -42]。一个新兴的模式表明,hMSCs可以表现出促炎(1型)和抗炎(2型)的反应在活的有机体内根据特定的刺激hMSCs[遇到的35]。特别是,这种调制的hMSC函数证明发生在刺激与toll样受体(TLR)受体激动剂(33,35,37]。为了应对与TLR4受体激动剂LPS刺激骨髓msc移植炎性细胞因子如MCP-1 [36和引发34),会影响粒细胞的动员。所有的信息(s)的msc在炎症中的作用,然而,来自间接方法包括大部分细胞分析几乎没有细胞之间的相互作用动力学信息粒细胞和msc在炎症反应。

在这项研究中,我们跟踪的命运注入hMSCs骨髓的小鼠免疫能力和观察他们的动态交互与东道国bone-marrow-resident LysM⁺中性粒细胞和单核细胞前后系统有限合伙人管理。我们的原位单细胞成像数据直接驳斥了先前发表的报告声称静脉注射小鼠msc无法达到组织除了肝脏,肺,脾,hMSCs的生物学效应在活的有机体内因此可能是由于系统性作用[22]。作为我们动态成像研究中观察到,住hMSCs能够交通骨髓,在异种移植生存环境一个完整的宿主免疫系统,和与周围的中性粒细胞系统性挑战toll样受体激动剂。与此同时,我们也观察到破坏和后续hMSCs通过宿主免疫细胞的吞噬作用。

特别感兴趣的是我们发现老鼠粒细胞具有高度动态的“蜂拥”行为在hMSCs应对有限合伙人的挑战和hMSCs保持基本完好无损在这样一个活跃的宿主先天免疫反应。描述的观察粒细胞行为类似于周边器官如肝脏感染过程中(38),这表明集群和粒细胞的动态行为是一种普遍现象在活的有机体内。hMSCs已被证明直接回应TLR刺激(33- - - - - -37)和释放趋化因子MCP-1和引发嗜中性粒细胞招募(34,36];因此,它是可能的,骨髓中性粒细胞积极应对当地发布的趋化因子hMSCs LPS刺激后。另外,中性粒细胞可能直接回应有限合伙人(43]或信号发布的其他细胞在骨髓中由于TLR刺激,和hMSCs和粒细胞窝在同一个信号源所在细分市场或同一解剖部位退出,进入细胞colocalize骨髓。额外的实验需要询问各种nonfluorescent基质和骨髓来源的角色元素出现“黑暗”或没有标签在我们的成像背景在这个动态炎症hMSCs与宿主细胞相互作用和破坏的hMSCs异种移植环境目睹了在当前的研究中。此外,未来的研究需要解决如何在活的有机体内与hMSCs的交互影响中性粒细胞的功能和行为变化和其他宿主免疫细胞。

一个限制在我们目前的研究是缺乏lineage-specific GFP荧光标记来区分⁺积极参与hMSCs反应细胞。而> 95%的GFP⁺细胞在小鼠模型表达Gr1一起⁺/ CD11b⁺/标记符合中性粒细胞(38,39),我们无法确定确切的真实身份成像细胞属于单核细胞/巨噬细胞或中性粒细胞血统(图4 (b)插图)。多色lineage-specific荧光记者需要进一步区分这些细胞类型的响应hMSCs和有限合伙人的挑战。本研究的另一个限制是,我们的描述hMSC行为与颅盖骨髓中性粒细胞被限制而不是其他骨髓腔,如发现在股骨和其他长骨头。作为后者的活体的成像将需要额外的操作,比如删除骨骼和肌肉,以及机械变薄的皮质骨,这些过程可能引入额外创伤底层hMSC-neutrophil生物学。因为这个原因我们故意限制观察颅盖骨髓以减少组织损伤和炎症。

我们也感兴趣的变量之间的相互作用动力学中性粒细胞和不同hMSCs骨髓(图3)的注入hMSCs当别人完好无损(图发生细胞凋亡4)。有趣的是,LysM hMSC破坏和随后的吞噬作用⁺细胞并没有加剧了LPS刺激。变量相互作用动力学可能是由于异构注入hMSC人口中分化和成熟期间发生在体外文化过程或结果不同的地方信号受到hMSCs在不同microniches骨髓。另一个,虽然不太可能,可能是细胞输注细胞群污染物没有msc。在将来,一个可能的方式解决这个问题将是构建marker-specific输注hMSCs荧光记者而不是使用非特异性,pan-cell荧光染料。在这两种场景中,重要的是要了解这些细胞的行为在活的有机体内他们代表实际的细胞产品目前被注入到患者参加各种积极的临床试验。此外,最近的数据支持了这样的观点,即中性粒细胞是活跃的参与者在各种自适应免疫反应(44- - - - - -47),这将是非常有趣的研究相关的功能性变化hMSC debris-containing中性粒细胞在各种炎症或病态的设置,以及是否吞噬hMSC蜂窝组件可能代表一个潜在的机制hMSCs发挥他们的免疫调节作用在活的有机体内。在一起,我们当前的研究展示了活体的TPM的价值和效用的方法在生物学和进一步发展我们有限的理解原位细胞机制hMSCs流量,对宿主组织起到治疗和免疫调节作用。

作者的贡献

j·t·迈尔斯和a . y .黄的构思和计划的实验。j·t·迈尔斯进行的实验。j·t·迈尔斯和d s Barkauskas分析数据。d . s . Barkauskas j·t·迈尔斯,a . y .黄起草。所有作者同意提交前期末报告草案。

利益冲突

作者没有任何利益冲突声明。

确认

作者感谢大卫·瓦尔德博士,医学博士,Ph.D., Director of Hematopoietic Stem Cell Core Facility, Case Comprehensive Cancer Center, for helpful comments and suggestions related to hMSC preparation, characterization, and handling. The authors also thank Dr. Thomas Graf for generously providing theLysM^{+ / GFP}老鼠和承认的贡献Iuliana说Bobanga博士,医学博士,和Josepoh Nthale for helpful review and suggestions during the preparation of this paper. This research was supported by the National Center for Regenerative Medicine Pilot Grant (Tech 09-071), with partial funding support from the National Cancer Institute (CA154656), St. Baldrick’s Foundation, Alex’s Lemonade Stand Foundation, Gabrielle’s Angel Foundation, Hematopoietic Stem Cell Core Facility of the Case Comprehensive Cancer Center (P30 CA43703), and T32 EB7509 (to D. S. Barkauskas). Case Western Reserve University acknowledges the contribution of the State of Ohio, Department of Development, which provided funding in support of Center for Stem Cell and Regenerative Medicine: Commercial and Clinical Application project.

补充材料