基因表达谱的比较从人类脐带血和骨髓基质细胞:缺乏典型的“骨头”签名脐带血细胞

文摘

关于bone-regenerative能力,骨髓基质细胞(BMSC)仍然可以被称为“黄金标准。“然而,新生儿脐带血的基质细胞(CB)关于可用性特性优势,不成熟,和增殖潜力。详细的基因表达分析和超表达的基因表达差异提供洞察基质细胞的固有能力。微阵列和存在分析显示密切相关的基因表达模式两种基质细胞群来自CB。CB-derived细胞类型相比,BMSC显示高表达水平BSP,OSX,BMP4,OC,PITX2。慢病毒的超BSP但不是的OSX在cb的增加形成矿化矩阵的能力。BMP4诱导的分泌蛋白聚糖在chondrogenic颗粒文化和延长成骨的,但减少了脂肪形成的分化潜能。BMSC揭示了典型成骨基因表达的签名。相比之下,CB-derived细胞表现出更成熟的基因表达谱,没有对骨骼发展倾向。缺席的情况下BSP和BMP4——被定义为潜在的关键球员影响新生儿基质细胞分化潜力应该考虑在选择组织再生的细胞来源的方法。

1。介绍

关于再生软骨或骨肿瘤切除术后,事故,或因疾病影响骨骼,组织工程骨,伟大的必要性。细胞组成部分,这些方法已经在多年兴趣的焦点。

第一个描述(1),因此最好的研究nonhematopoietic基质细胞来源于骨髓(BM)。的在活的有机体内骨形成威胁包括招聘的造血细胞受体的起源这些骨髓基质细胞(BMSC)移植后在羟基磷灰石支架是由几组(2,3]。与骨髓捐赠相关的潜在风险的其他来源的基质细胞,例如,脂肪组织或外周血,有吸引力的替代品。由于它的不成熟和成年骨髓相比,新生儿脐带血(CB),可以收集动物没有道德问题,可以被看作是一个合适的新生儿基质细胞的来源与未来潜在的临床意义。脐带血含有至少两个不同的种群nonhematopoietic基质细胞与可比的增殖潜力(4),称为无限制的体细胞基质细胞(USSC)和绳血液基质细胞(CBSC)。迄今为止,USSC和CBSC不能孤立的前瞻性,但可以区分的基础上,细胞表面抗原,分化潜能,和基因表达。在流仪分析,CBSC显示更强的CD146的表达(MCAM,黑色素瘤粘附分子)相比USSC [4]。在在体外分化化验,CBSC但不是USSC拥有向脂肪细胞分化的潜力(5]。前的相关结果显示没有脂肪形成的潜在的表达式DLK1(δ果蝇在USSC homolog-like 1),因为USSC但不是CBSC表达DLK1(5]。最近的结果表明,DLK1可能不是唯一因素的抑制负责在体外脂肪生成USSC [6]。在微阵列和PCR分析,的表达HOX(同源框基因)被定义为额外的特色:USSC完全缺乏HOX基因表达,而CBSCHOX积极的(7]。此外,USSC可以从CBSC歧视的基础上的更高hematopoiesis-supporting能力coculture实验(6]。

迄今为止,证明CB-derived基质细胞的能力,形成真正的骨头和招募造血细胞移植后的标准化在活的有机体内化验是失踪。之前执行这样的化验,识别潜在的差异之间的分子水平cb的“黄金标准”BMSC是强制性的。关于immunophenotype, CB -和BM-derived细胞几乎是相同的。潜在的细胞表面标记来区分这些细胞定量流动仪分析CD146 [4),但这种抗原也描述表达的周,无论他们是否成骨的(3]。基因表达在转录组水平,差异描述细胞类型的不同来源(8]。在目前的研究中,进一步的基因表达差异在BM -和CB-derived细胞群被检查发现潜在候选基因的影响在活的有机体内再生潜力。是特别注意基因调节骨骼的形成通过软骨内或膜内的胎儿发育期间骨化。

软骨形成由细胞外基质和生长因子信号精确地调整以及细胞内信号通路和基因转录时空的方式(9]。必要的监管途径参与胎儿软骨形成FGF,刺猬,BMP或WNT信号(9,10]。BMPs-in特定BMP2,4,7——知道在早期采取行动(chondroprogenitor细胞决心和分化)和后期(终端分化肥厚性软骨细胞)软骨细胞成熟的9]。此外,BMP4还参与调节成骨细胞成熟(11]。在软骨内骨化,软骨基质是由成骨细胞骨基质合成所取代。最早、最重要的一个转录因子控制这个过程是runt-related转录因子2 (RUNX2),例如,绑定的赞助者osteoblast-specific激素骨钙素(OC)[12]。旁边RUNX2转录因子SP7 (osterix,OSX)对小鼠成骨细胞的分化:至关重要的失活Osx导致失败在骨形成12,13]。OSX位于下游的RUNX2,理由是它的缺失Runx2有缺陷的小鼠(13]。在骨形成的后阶段,新形成的骨基质矿化通过积累的羟磷灰石,胶原蛋白,noncollagenous蛋白质。分泌的磷蛋白质BSP(integrin-binding唾液蛋白)构成的主要部分noncollagenous人类骨细胞外基质的蛋白(14]。一个重要的角色Bsp关于在活的有机体内骨形成潜在的报道了小鼠BMSC:只克隆细胞系表达Bsp显示一个在活的有机体内成骨的潜力,而Bsp消极的细胞系是nonosteogenic [15]。

在目前的研究中,基因差异表达基质细胞从脐带血(USSC和CBSC)和骨髓(BMSC),潜在的影响在活的有机体内骨形成能力,被微阵列数据分析和定量rt - pcr鉴定。BMP4,BSP,OSX强的表达在BM - CB-derived基质细胞相比,选择超表达实验评估基因的作用在调节分化。进一步的分析表明osteosupportive角色BMP4和BSP,而OSX似乎有负面影响骨形成能力在体外。

2。材料和方法

2.1。隔离和扩张

的伦理审查委员会授予的杜塞尔多夫大学医学院伦理批准来隔离不同的细胞类型(研究。USSC / CBSC:没有。2975年,伴着:没有。3240)。

USSC和CBSC孤立使用相同的协议。区分细胞类型,以及脂肪形成的分化潜力DLK-1(5),HOX基因表达(7)确定通道4或5。immunophenotype和增长潜力的细胞类型进行比较的一项研究[4]。

细胞隔离进行发表过(5,16]。总之,人类CB收集从脐带静脉的书面知情同意的母亲。单核细胞分数(跨国公司)是通过聚蔗糖梯度分离(Biochrom AG)其次是氯化铵溶解的红细胞。5 - 7×10⁶跨国公司/毫升杜尔贝科修改鹰的培养基培养(DMEM)低葡萄糖(Lonza) 30%胎牛血清(FCS Hyclone) 10⁻⁷M地塞米松(Sigma-Aldrich), 1%的青霉素、链霉素、Lglutamine (PSG, Lonza)。单一的殖民地独立使用克隆与胰蛋白酶(0.25%)气缸(默克密理博)和扩大在同一介质没有地塞米松。

BMSC孤立使用健康的捐赠者从髂骨骨髓吸气如前所述[17]。

所有类型的细胞培养在37°C在湿润的气氛中有5%的公司₂直到达到80%融合。USSC和CBSC分离与0.25%胰蛋白酶,BMSC与0.25%胰蛋白酶/分离EDTA (Lonza)。

2.2。微阵列基因表达分析

通道5细胞株用于微阵列基因表达分析。根据RNeasy迷你包总RNA提取协议(试剂盒)。RNA准备被安捷伦2100生物分析仪检查RNA的完整性。所有样品在这个研究显示高质量RNA完整性数字(rin) 10。RNA被测光Nanodrop量化测量。互补脱氧核糖核酸的合成和随后的生物素标记的cRNA执行根据制造商的协议(3 '看表达工具;Affymetrix公司)。短暂100 ng的总RNA转换为互补,紧随其后在体外转录和aRNA生物素标记。分裂后,贴上aRNA是杂化Affymetrix PrimeView人类基因表达微阵列16 h在45°C,由链霉亲和素/藻红蛋白共轭染色,扫描按照制造商的协议。数据分析数字化进行了荧光信号强度与GeneSpring GX软件(更小。12.1;安捷伦科技)。后由RMA探针在每个probeset综述了所有样本分位数探针信号强度水平正常化减少interarray可变性(18]。输入数据前处理得出了基准转换中值的样本。分组后的样本根据各自的实验条件(USSC, CBSCs BMSC,三个复制),给定probeset不得不表达高于背景(即。,fluorescence signal of a given probeset was detected within the 20th and 100th percentiles of the raw signal distribution of a given array) in at least two of the three replicates in every single one of the three experimental groups. The resulting cell-type-specific gene expression profiles was compared by separating overlapping from cell type specific gene lists (Venn diagram analysis). Global similarity of gene expression profiles were determined by principal component analysis (PCA). Expression values were mean centered and scaled to unit standard deviation. Pruning options within GeneSpring GX software were set to a fixed number of principal components (numPrincipalComponents = 3).

仅在一个细胞中表达的基因数量(维恩图)组合使用提供的“集群功能注释工具”大卫生物信息学资源(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)[19- - - - - -21]。

2.3。定量逆转录聚合酶链反应(存在)

RNA进行隔离使用RNeasy工具包(试剂盒)。分化细胞的RNA分离使用三试剂按照制造商的指示(Sigma-Aldrich)其次是DNA消化DNase我(技术)。RNA隔离之前,chondrogenic小球在37°C孵化链霉蛋白酶E(默克公司)为1 h在胶原酶P(罗氏)其次是孵化24 h。与SuperScriptIII逆转录(RT)进行(技术)根据供应商的协议。互补DNA(互补),接近50 ng的RNA用于随后的存在与权力SYBR绿色PCR Mastermix(技术)。引物序列和相应的退火温度是列在表中可以在网上http://dx.doi.org/10.1155/2013/631984。筛选相关的基因WNT通路,WNT信号通路PCR数组(PAHS-04 SA生物科学,试剂盒)(基因的表达MYC和PITX2本文提出了)。后比较不同的潜在的看家基因的分化过程中基因表达稳定(数据未显示),我们决定使用人类核糖体蛋白L13a (RPL13A)作为参考基因正常化。为SOX9,TaqMan基因表达分析结合TaqMan 2 x普遍PCR主没有Amp擦掉)混合使用(所有生命技术)。所有反应都是在重复运行ABI第一步加上检测系统使用以下标准项目:95°C 10分钟;95°C 15年代,55/60/65°C 1分钟(40周期)。相对后计算基因表达的变化方法。

2.4。统计分析

标准偏差的数据给出了算术方法至少三个不同的细胞系。未配对与GraphPad Prism 5.01版进行了测试。值低于0.05被认为是重要的(*0.05;* *0.01;* * *)。

2.5。在体外分化

脂肪形成的诱导分化,细胞被镀在8.3×10³细胞/厘米²融合在6-well盘子,直到达到70%。每周两次去媒体改变了21天,交替感应和栽培介质。前由DMEM高葡萄糖(Lonza)补充10% FCS、青霉素、链霉素、Lglutamine 1% (PSG) 10⁻⁶M地塞米松,吲哚美辛0.2毫米,0.1毫克/毫升胰岛素,和1毫米3-isobutylmethylxanthine(所有Sigma-Aldrich);后者由DMEM高葡萄糖,10% FCS PSG 1%, 0.01毫克/毫升胰岛素。消极的控制,细胞在DMEM培养低葡萄糖,10% FCS,巴黎圣日耳曼。分化细胞被固定用甲醛和沾油红O (Sigma-Aldrich)可视化脂质空泡。彩色脂质空泡被量化为Windows使用ImageJ基于java的图像处理软件。至少3图片为每个实验进行了分析。彩色区域计算和相应的负控制被减去。

诱导成骨分化,细胞被镀在8.3×10³细胞/厘米²在6-well盘子。当达到70%融合,成骨分化中包含DMEM低葡萄糖补充30% FCS, 1% PSG, 10⁻⁷50 M地塞米松,μg / mL抗坏血酸,10毫米beta-glycerolphosphate(所有Sigma-Aldrich)补充道。消极的控制,细胞在DMEM培养低葡萄糖,10% FCS,巴黎圣日耳曼。成骨分化进行了14天;媒介改变了两次一个星期。检测矿化,与硝酸银染色(“冯Kossa”)或茜素红S应用标准协议。冯Kossa染色,细胞被固定在冷乙醇(70%,10分钟),孵化在硝酸银(罗斯,5%,30分钟),其次是硫代硫酸钠五水化物(默克公司1%,1分钟)。核快红硫酸铝溶液(默克公司0.1%,30分钟)申请复染色。用蒸馏水洗细胞染色的步骤之间的过程。茜素红S-staining,固定在冷乙醇(70%,10分钟),其次是孵化茜素红S (Sigma-Aldrich 2% 10分钟)和5用蒸馏水洗涤步骤。在染色过程中,茜素红的数量被量化。 800 μL醋酸添加和孵化的永久摇晃下30分钟。细胞层细胞分离与刮刀,漩涡,在85°C和孵化第一10分钟,然后在冰上5分钟。后离心步骤(24500克,15分钟),500年μL与200年上层清液的混合μ分析了L(氢氧化铵(10%)和光度学的(板读者,Bio-Tek仪器Inc .)在405海里。负控制的值减去的分化细胞。每个样本以一式三份。

诱导软骨形成,整除的细胞被离心机在7分钟150克15毫升聚丙烯锥形管。颗粒状细胞在DMEM培养21天高葡萄糖补充1% PS, 100 nM地塞米松,35岁μg / mL抗坏血acid-2-phosphate, 1毫米丙酮酸钠(所有Sigma-Aldrich), Insulin-Transferrin-Selenium(1/100稀释)(Gibco)和10 ng / mL TGF beta1 (mac, Miltenyi研究)。媒体被换了三次一个星期。番红精O /快速绿色染色的颗粒被嵌入在组织冷冻剂(荣格,徕卡),切成段6μ使用cryotome m。幻灯片与冷乙醇(70%)、固定沾染了红色染料O 30分钟和快速绿色(Waldeck) 5 s。在蒸馏水洗涤后,幻灯片在乙醇(96%)和二甲苯孵化。Entellan(默克公司)作为安装介质。

2.6。慢病毒超表达

分离DNA包含感兴趣的基因、特定的引物与限制性位点的限制性内切酶(表设计)。的基因片段插入pCL6IEGwo向量(S1和S2的数据)。大肠杆菌前10名(技术)是用于转换。验证正确的基因传递,构造(pCL6BMP4,pCL6BSP,pCL6OSX)测序使用BigDye终结者循环测序工具(技术)。慢病毒颗粒生产使用FuGENE转染试剂(罗氏)与信封质粒转染HEK293T细胞pALF-GALV,金刚石/ NL-BH辅助质粒,和表达载体包含eGFP pCL6IEGwo和克隆的基因序列(图)。HEK293T转染是按照下列协议完成。第一天:HEK293T镀在DMEM(高葡萄糖),10% FCS, 1% PSG (5×10⁵细胞/厘米²)在10厘米。第二天:HEK293T转染:DMEM(高葡萄糖),5μ克每一个质粒,和45μL FuGENE涨跌互现,孵化15分钟在室温和添加到HEK293T在DMEM(高葡萄糖),5% FCS。第三天:镀靶细胞(1×10⁵细胞/ 60厘米²)。HEK293T培养基被改变(DMEM(高葡萄糖),5% FCS, PSG 1%)。第四天:感染靶细胞:HEK293T上层清液含有病毒颗粒是无菌过滤(0.45μ过滤器)并将其添加到目标细胞(必要时稀释)。控制细胞(“模拟”)、中没有病毒颗粒(DMEM(高葡萄糖),5% FCS, 1% PSG)应用。天5和6:中等改变靶细胞(DMEM(低葡萄糖),30% FCS, PSG和1%)。确保目标细胞的转染效率高,通过flowcytometric eGFP表达测量分析。Fluorescence-activated细胞排序(流式细胞仪)完成核心流式细胞仪设备Heinrich-Heine-University医学中心的杜塞尔多夫,德国。

3所示。结果

3.1。新生儿USSC的基因表达谱和CBSC比成人BMSC更相似

得到的概述USSC的基因表达谱,CBSC, BMSC(三个复制),微阵列基因表达分析。结果描述了维恩图和主成分分析(PCA的数字1(一)和1 (b))。

维恩图解说明了计数的基因表达的一个或多个细胞类型。绝大多数基因共同表达了所有三个细胞类型(38608个基因,图1(一))。在这些基因不表达的所有细胞类型,USSC CBSC表达了385个基因在BMSC缺席。249个基因中CBSC USSC BMSC但不是,而222个基因的表达被USSC和BMSC共享。304个基因在USSC表达独特,自251年至375年在CBSC BMSC(图1(一))。详细分析,这些基因被分配到生物功能(基因本体论(去)计算)使用集群功能注释工具大卫的生物信息学资源网站。在表1,这些基因表达独特USSC CBSC,或列出BMSC与骨生成的过程。USSC和CBSC表现出独特的“骨”只有三个基因的表达在三个方面。相反,BMSC表达了13个基因组合在十项CB-derived细胞不表达(表1)。

主成分分析显示的三个复制一个细胞类型之间的关系描述为球体的三维空间。那些球显示高基因表达相似定位接近对方。三行骨髓细胞的分析揭示了在三维空间散射,而USSC的一式三份,CBSC密切相关(图1 (b))。

总而言之,微阵列数据的分析表明,类似的基因表达模式的USSC和CBSC BMSC(图1(一))。此外,BMSC表示比USSC或CBSC osteogenesis-related基因独特,指示从骨髓细胞固有的“成骨的签名”(表1)。此外,BMSC细胞系表现出更强的生物方差相比USSC或CBSC细胞系(图1 (b))。

3.2。差异表达基因定量rt - pcr进行评估:BMSC表现出成骨的签名

基因组广泛的微阵列分析后,得到一个更详细的了解存在评估基因表达不同的细胞群。微阵列基因表达数据的解释后,重点是放在与骨形成的过程相关的基因。分析了基因表达在至少三个不同的细胞系/细胞类型生物方差补偿。Integrin-binding唾液蛋白(BSP),osterix (OSX),骨形成蛋白4 (BMP4)、骨钙素(OC),paired-like homeodomain转录因子2 (PITX2)显示更强的表达式BMSC CB-derived相比细胞类型(图2,未配对以及:BSP:USSC / BMSC,,CBSC / BMSC,;OSX:USSC / BMSC,,CBSC / BMSC,不显著(n);BMP4:USSC / BMSC,,CBSC / BMSC, n。OC:USSC / BMSC,,CBSC / BMSC,;PITX2:USSC / BMSC,CBSC / BMSC)。相同器官的肌肉部分同源框果蝇2 (MSX2)在USSC强表示,BMSC,而CBSC显示降低基因表达(图2,未配对以及:USSC / CBSC,;CBSC / BMSC,)。的存在分析V-Myc禽流感病毒致癌基因myelocytomatosis同族体(MYC)发现最强的表达式USSC CBSC紧随其后。BMSC表示MYC略(图2,未配对以及:USSC / BMSC, n。CBSC / BMSC,)。

BMSC显示高osteogenesis-related基因的表达水平BSP,OSX,和BMP4。考虑,从骨髓基质细胞仍然可以被表示为最可靠的来源在活的有机体内骨再生(22),这些基因潜在的候选基因的调控成骨细胞类型的潜力。因此,这些基因的超表达实验进行评估新生儿基质细胞的基因功能。

3.3。过度的BSP导致增加钙化

对于不同的表达模式BSP在CB-derived细胞类型而BMSC(图2),进行两个慢病毒超表达实验BSP负USSC细胞系。转染效率被证明通过存在(图3(一个)USSC1: 215927倍强表达与模拟对照细胞,USSC2:强4185倍)。可能向脂肪细胞分化并不是过度的影响(数据没有显示)。相比之下,成骨的在体外分化潜能得到了改进BSP超表达分析冯Kossa和茜素红染色(图3 (b))和随后的量化(图3 (c))。冯Kossa染色显示一个加剧棕色/黑色染色由于过度后更强的钙化BSP相比nontransfected细胞(模拟)。光显微照片茜素红S-stained细胞分化后不允许的钙化的解释;因此,绑定茜素红S染料的量测量(图3 (c)USSC1:、n;USSC2:重要的)。

过度的BSP支持在体外成骨分化的USSC细胞系转染。因此,的表达BSP应该考虑当评估细胞的成骨的潜力类型。

3.4。过度的OSX导致降低成骨分化潜能

类似的表达BSP,OSX几乎没有在USSC最小表达式中检测出CBSC(图2)。因此,过度的OSX在两个USSC细胞系进行。图4(一)说明了基因表达OSX转染(USSC1模拟/ pCL6OSX:2831倍增加表达式,USSC2模拟/ pCL6OSX:1223倍)。由于OSX过度的表达RUNX2(runt-related转录因子2)调节(图4(一)USSC1:−2.3倍模拟细胞相比,USSC2:−1.7倍),而的表达BSP和BMP2(骨形成蛋白2)增加(图4(一),BSP:USSC1:增加15.1倍表达式模拟细胞相比,USSC2: 1.8倍;BMP2:USSC1: 2.1倍,USSC2: 1.5倍)。脂肪形成的分化潜能没有超表达的影响OSX(数据没有显示)。相比之下,矿化成骨分化减少中OSX转染USSC分析使用冯Kossa和茜素红染色和量化数据4 (b)和4 (c))。冯Kossa染色显示略有减少的钙化细胞系USSC1经过超表达的OSX这证实了量化的绑定茜素红S染料(数据吗4 (b)和4 (c),非常重要)。降低更明显的钙化后超表达的细胞系中检测出USSC2。在冯Kossa茜素红染色,几乎没有钙化是测量证实了茜素红S量化(数字4 (b)和4 (c),非常重要)。

OSX描述了对骨形成是必要的(13]。然而,在目前的研究减少在体外后USSC成骨的能力OSX过度的表达下降RUNX2被检测到。的upregulationBSP和BMP2超表达不支持后成骨的潜力。

3.5。过度的BMP4提高细粒和骨生成在体外但减少形成脂肪细胞的能力

骨形成蛋白4 (BMP4)强烈表达BMSC, CB-derived细胞群表现出较弱的表达(图2)。慢病毒基因传递的BMP4完成在两个USSC和两个CBSC细胞系中存在证明(图5(一),USSC2: Mock-cells强9381倍,USSC4: 34598倍强,CBSC1: 890倍强,和CBSC3:强5714倍)。减少造成的过度表达RUNX2而LRP5(低密度脂蛋白受体相关蛋白5)与WNT信号通路相关,显示一个upregulation(图5(一),RUNX2:USSC2:−1.7倍模拟细胞相比,USSC4:−3.1倍,CBSC1:−2.1倍,CBSC3:−2.1倍;LRP5:USSC2: 1.3倍,USSC4: 2.8倍,CBSC1: CBSC3: 3.1倍,1.6倍)。向脂肪细胞分化的潜力,影响成骨细胞、软骨细胞是可行的在体外分化化验。缺乏的能力向脂肪细胞分化USSC [5)不是超表达的影响BMP4。相反,CBSC分化的潜力向脂肪形成的血统是经过超表达的减少BMP4,评估油红O染色和染色的ImageJ-based量化(数字5(b)和5(c),未配对以及:CBSC1模拟/ pCL6BMP4,;CBSC3模拟/ pCL6BMP4,)。BMP4转染USSC CBSC分泌更多chondrogenic分化中蛋白聚糖颗粒文化说明了加强紫色/红色红色染料染色(图5(f))。同样,在成骨分化,转染细胞表现出增强的钙化由冯Kossa证明和茜素红S染色后续量化(数字5(d)和5(e), USSC2:,非常重要;USSC4:,非常重要;CBSC1:,非常重要;CBSC3:非常重要)。

总之,过度的BMP4在两个USSC和两个CBSC细胞系导致“开关”细胞的功能:脂肪形成的分化潜力降低,而chondrogenic和成骨的潜力得到了改善。

4所示。讨论

multilineage的评价在活的有机体内分化能力不同的基质细胞类型是特别重要的,例如,在骨组织工程领域的相关应用的细胞来源。依据这些在活的有机体内化验的详细分析基因表达谱结合在体外分化潜力洞察基质细胞和固有的能力来定义相关的基因分化的规定。因此,微阵列基因表达分析在目前的对比研究从骨髓基质细胞(BMSC)和脐带血(USSC和CBSC)。在第二个步骤中,基因表达不同的细胞群被定量rt - pcr验证分析。最后,三个与软骨和骨形成相关的基因(BSP, OSX,和BMP4)过表达评估线血液基质细胞的功能。

微阵列分析(图1)显示密切相关的基因表达模式USSC和CBSC反映出他们共同的脐带血来源。CB-derived细胞类型相比,高出三BMSC细胞系显示方差表达谱(图1 (b)),这可能是由于对供体年龄或性别差异。一个“成骨的签名”BMSC微阵列和存在分析后确定(数据1和2)根据在活的有机体内这些细胞的角色创建的骨内膜的利基调节造血干细胞的自我更新和分化23]。按照这个生物功能,BMSC表达高水平的PITX2(图2)which-beside其他功能描述影响骨髓基质细胞的造血支持能力(24]。osteogenesis-related基因BSP,OSX,BMP4,和OC显示更强的表达式BMSC USSC和CBSC(图2),反映了更多的新生儿脐带血血液基质细胞的不成熟状态。不像BMSC, USSC CBSC有减少的倾向骨骼发展。

的磷蛋白质BSP是人类骨骼的一部分细胞外基质(14]。Bsp表达式被描述是必不可少的在活的有机体内骨形成小鼠BMSC的潜力(15]。Bsp基因敲除小鼠(BSP^−−/)显示一个受损骨骼生长和矿化骨形成减少(25]。在目前的研究中,BSP被形容为一个基因表达之间有区别地BMSC CB-derived细胞类型(图2)。BSP可以被视为潜在的监管的关键球员证实了增强的钙化的骨形成的BSPoverexpressing USSC在一个在体外骨生成试验(图3)。此外,钙化的增加对应于猎手和戈德堡的研究报告BSP启动羟磷灰石晶体形成在骨形成过程中(26]。

相比BSP超表达的转录因子OSX(SP7)USSC导致下降在体外成骨的能力(图4),尽管OSX通常被描述为一个重要的监管机构对骨形成13]。Osx空的老鼠显示正常软骨与肥厚性软骨细胞成熟但未能形成骨骼突出特定的角色Osx在成骨细胞的分化13,27]。在这项研究中,超表达的OSX的差别造成了对这些upstream-locatedRUNX2在一个负面的反馈循环(图4(一))。增强的表现BSP和BMP2转染后OSX到USSC(图4(一))不支持矿化。类似的结果在Kurata等人的研究在人类胎儿基质细胞。过度的OSX并没有导致细胞外钙晶体(28]。同样,吉田和同事中Osx在初选小鼠成骨细胞,降低矿化成骨细胞分化的后期阶段。此外,Osx转基因小鼠表现出降低骨矿物质密度(骨量减少)29日]。相比之下,其他超表达研究murine-adipose-tissue-derived基质细胞(30.]或鼠BMSC [31日]报道一种改进成骨的潜力。这些有争议的结果可能是由于过度使用的不同的细胞实验可能揭示一个截然不同的表达模式所需的辅助因子诱导分化。其中一个是NFAT(核转录因子激活T细胞)形成一个复杂的OSX控制成骨细胞的骨形成(32]。

BMP4是一个分泌信号分子,在胚胎发生中扮演着重要的角色9,33]。关于肢体发展,BMP信号的阈值水平需要早期chondrogenic流程。双方的损失Bmp2和Bmp4小鼠基因敲除实验期间导致受损骨(11]。在目前的研究中,超表达的BMP4支持细粒和成骨的但减少了脂肪形成的人类细胞的分化(图5),对应于先前的研究在老鼠身上。菅直人等人描述Bmp4转基因小鼠,开发了一种表型特点是进步的异位骨形成(34]。另一个迪普雷报告和同事解决自己叙说异位的逆转录病毒超表达的影响BMP4在发展中小鸡的四肢。过度导致软骨的体积元素的增加造成的大量的矩阵(35]。在这项研究中,BMP4超表达在人类新生儿细胞减少的表达RUNX2(图5(一)建议RUNX2独立的刺激成骨分化。相比之下,的表达LRP5卷曲的,功能coreceptor (Fzd)受体在规范WNT信号,增强后BMP4超表达(图5(一)),表明WNT信号的作用BMP4使得促进矿化。由于成骨细胞和脂肪细胞共享一个共同的祖先,等差异化因素PPARγ(过氧物酶体proliferator-activated受体γ),不仅是必不可少的脂肪形成的细胞命运决定感应也在抑制成骨的发展过程36,37),反之亦然。本文中演示的数据的解释表明潜在的作用BMP4细胞命运决定的前体细胞促进分化向细粒/成骨的方向和抑制脂肪形成的分化。

总之,超表达实验提出了一个支持的角色BSP和BMP4在在体外成骨细胞分化;BMP4另外提升chondrogenic但减少脂肪形成的分化潜能,指示的作用BMP4在细胞命运决定向成骨细胞谱系。相比之下,OSX超表达并不支持矿化。

旁边的DLK1- - -HOX基因表达式描述我们组前研究[5,7),MSX2进一步基因表达不同USSC和CBSC之间(图2)。表达显著增强USSC CBSC相比。小鼠同源框基因缺陷MSX2显示缺陷在软骨内骨形成38]。Ichida及其同事报告奖励的效果MSX2间充质细胞向成骨细胞的分化。相比之下,MSX2抑制的表达PPARγ导致减少脂肪形成的分化潜能(39]。这些数据与我们的结果报告,USSC一致,表现出很强的成骨的潜力在体外但不是向脂肪细胞分化的能力,表现出较高的表达水平MSX2。相比之下,CBSC,减少潜在的分化成骨的血统在体外但能够形成脂肪细胞,没有表达MSX2(数据2- - - - - -5和[4])。

相反MSX2,无论是CB-derived细胞强烈的表达MYC而BMSC展出只有轻微的表达式(图2)。MYC编码转录因子原癌基因激活或压制基因参与细胞生长和细胞周期控制。例如,原癌基因压制增长逮捕基因的表达GAS1,特此促进细胞增殖(40]。这与扩展的增长潜力USSC CBSC BMSC的增长潜力(相比4]。

5。结论

从骨髓基质细胞相比,脐带血液细胞类型USSC CBSC缺乏一个签名相关的骨骼发展如图所示的微阵列基因表达和定量rt - pcr分析。过度的实验后,BSP和BMP4,缺席CB-derived细胞,被定义为潜在影响分化潜力的关键球员。BSP钙化在成骨分化影响化验。BMP4减少了脂肪形成的潜力,但增强的分泌蛋白聚糖在chondrogenic以及成骨分化化验后的钙化。因此,BMP4似乎决定细胞命运向细粒/成骨的血统。

理解不同的信号通路控制分化的影响是至关重要的预测的适用性再生疗法的不同的细胞群。因此,BMSC似乎更适合于骨组织工程细胞来源的方法相比,USSC或CBSC表现出不成熟的签名。

利益冲突

作者表明没有潜在的财务利益冲突。

确认

茱莉亚博世尤其感谢Jurgen Manchot Stiftung提供博士奖学金。作者感谢Daniela Stapelkamp技术支持以及Eva玛丽亚Freytag校对论文和有益的讨论。他们也谢谢凯瑟琳Raba(流式细胞术的核心设施,Heinrich-Heine-University医学中心Dusseldorf-Germany)的细胞分类。

补充材料

引用

1. a . j . Friedenstein r·k·Chailakhyan和美国诉Gerasimov“骨髓干细胞成骨的:体外培养和移植在扩散室,“细胞和组织动力学,20卷,不。3、263 - 272年,1987页。视图:谷歌学术搜索
2. s . a“库兹涅佐夫”p h . Krebsbach k Satomura et al .,“Single-colony派生的人类骨髓间质成纤维细胞形成骨移植体内后,“骨和矿物质研究杂志》上,12卷,不。9日,第1347 - 1335页,1997年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. b . Sacchetti a . Funari s Michienzi et al .,“自我更新osteoprogenitors在骨髓血窦可以组织一个造血微环境,”细胞,卷131,不。2、324 - 336年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. j .博世a·p·罗姆·t·f·Radke et al .,“不同的分化的潜力,”MSC”来自脐带血和脐带:cord-derived细胞真正的间充质基质细胞?”干细胞与发展,21卷,不。11日,第1988 - 1977页,2012年。视图:谷歌学术搜索
5. s . m . Kluth a . Buchheiser a . p .罗姆et al .,“DLK-1标记区分无限制的成体干细胞和脐带血间充质基质细胞,”干细胞与发展,19卷,不。10日,1471 - 1483年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. s . m . Kluth t . f . Radke, g . Kogler”USSC从脐带血造血的支持函数增加CB DLK-1 MSC和可能的作用相比,“干细胞国际文章ID 985285卷,2013年,12页,2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. 美国利特克,a . Buchheiser j .博世et al .,“HOX代码为“生物指纹”来区分功能不同的干细胞数量来自脐带血,”干细胞研究,5卷,不。1,40 - 50,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. b·j·h·詹森c . Gilissen h .鲁洛夫•et al .,“功能间充质干细胞数量之间的差异反映在他们的转录组,“干细胞与发展,19卷,不。4、481 - 489年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. m·b·戈德林k Tsuchimochi, k . Ijiri“软骨形成的控制。”细胞生物化学杂志》上,卷97,不。1,33-44,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. f .长”,构建强壮的骨骼:分子调节成骨细胞谱系,”自然评论分子细胞生物学,13卷,不。1,27-38,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. a . Bandyopadhyay k .教授k·考克斯b . d . Harfe v . Rosen和c j . Tabin”BMP4基因分析BMP2的角色,和BMP7肢体模式和skeletogenesis”公共科学图书馆遗传学,卷2,不。12篇文章e216 2006。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. 卡尔桑迪,“转录控制skeletogenesis”,基因组学和人类遗传学的年度审查9卷,第196 - 183页,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. k .中岛美嘉x周,g . Kunkel et al .,“小说锌finger-containing转录因子Osterix成骨细胞分化和骨形成,需要“细胞,卷108,不。1、17 - 29,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. r·h·金·h·s·夏皮罗,李j·j·j·l·Wrana和j . Sodek”描述的人类骨涎蛋白(BSP)基因及其启动子序列,”矩阵生物学,14卷,不。1,31-40,1994页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. k . Satomura p . Krebsbach·比安科和p·g·罗比,“骨髓基质细胞分化成骨imprinting-upstream。”细胞生物化学杂志》上,卷78,不。3、391 - 403年,2000页。视图:谷歌学术搜索
16. g . Kogler s Sensken j . A . Airey et al .,“一个新的人类体细胞干细胞从胎盘脐带血内在多能分化潜力,”实验医学杂志,卷200,不。2、123 - 135年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. g . Kogler t·f·Radke a Lefort et al .,“细胞因子的生产和造血支持活动绳血液无限制的成体干细胞,”实验血液学,33卷,不。5,573 - 583年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. b . m . Bolstad r·A·伊·m·搁浅地和t . p .速度,“比较规范化方法高密度寡核苷酸阵列数据基于方差和偏差,“生物信息学,19卷,不。2、185 - 193年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. g·丹尼斯Jr .) b·t·谢尔曼d . a . Hosack et al .,”大卫:数据库进行注释、可视化和综合发现,“基因组生物学,4卷,不。2003年5条P3。视图:谷歌学术搜索
20. d . w .黄、b·t·谢尔曼和r . a . Lempicki”系统和综合分析大量基因列表使用大卫生物信息学资源”自然的协议,4卷,不。1,44-57,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. b·t·谢尔曼·d·w·黄问:棕褐色et al .,”DAVID知识库:gene-centered数据库集成异构的基因注释资源来促进高通量基因功能分析,“BMC生物信息学第426条,卷。8日,2007年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. p·g·罗比,“骨再生的细胞来源:好的,坏的,丑陋的(但有前途),“组织工程B,17卷,不。6,423 - 430年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. d . j . Prockop“骨髓基质细胞作为nonhematopoietic组织干细胞,”科学,卷276,不。5309年,第74 - 71页,1997年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. a . Kieusseian j . Chagraoui c Kerdudo et al .,“表达Pitx2正常造血基质细胞是必需的,”血,卷107,不。2、492 - 500年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. l . Malaval n·m·Wade-Gueye m . Boudiffa et al .,“骨涎蛋白发挥功能作用在骨形成和osteoclastogenesis,”实验医学杂志,卷205,不。5,1145 - 1153年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. g·k·亨特和h·a·戈德堡”调制晶体形成的骨磷蛋白质:谷氨酸作用acid-rich序列由骨涎蛋白羟磷灰石的成核,“生物化学杂志,第302卷,第1部分,175 - 179年,1994页。视图:谷歌学术搜索
27. 机票的。原田和g . a .横行”控制成骨细胞的作用和调节骨质量,”自然,卷423,不。6937年,第355 - 349页,2003年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. h . Kurata p v .第5期,j . Chan)和n . m . Fisk”Osterix诱导成骨的基因表达而不是人类胎儿间充质干细胞分化在初级,”组织工程,13卷,不。7,1513 - 1523年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. c . a .吉田,h .小森,z Maruyama et al .,“Sp7抑制成骨细胞分化在老鼠,后期”《公共科学图书馆•综合》,7卷,不。第三条ID e32364, 2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. l .吴,吴y, y林et al .,”所倡导的脂肪衍生干细胞成骨分化osterix的过度表达,“分子和细胞生物化学,卷301,不。1 - 2、83 - 92年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
31. 问:你,p .瓦尔韦德,j·陈,“Osterix增强骨髓基质细胞增殖和成骨的潜力,”生物化学和生物物理研究通信,卷341,不。4、1257 - 1265年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
32. t .甲贺,y松井,m . Asagiri et al .,“NFAT合作Osterix调节骨形成,”自然医学,11卷,不。8,880 - 885年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
33. p . Bakrania m . Efthymiou j·c·克莱因et al .,“BMP4基因突变导致眼睛、大脑和数字发育异常:BMP4和刺猬信号通路之间的重叠,“美国人类遗传学杂志》上,卷82,不。2、304 - 319年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
34. l .菅直人m . Hu w·a·戈麦斯和j·a·凯斯勒”转基因老鼠overexpressing BMP4开发fibrodysplasia ossificans progressiva (FOP)例如表型,”美国病理学杂志》,卷165,不。4、1107 - 1115年,2004页。视图:谷歌学术搜索
35. 迪普雷d,自己叙说e·j·贝尔·m·k·理查森et al .,“过度BMP-2和BMP-4改变的大小和形状发展中女性肢体骨骼元素”机制的发展卷,57号2、145 - 157年,1996页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
36. t . Akune大庭,PPAR Kamekura et al。。γ不足提高从骨髓祖细胞通过成骨细胞骨形成,”临床研究杂志,卷113,不。6,846 - 855年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
37. 高田i, a . p . Kouzmenko,加藤,“osteoblastogenesis与脂肪形成的分子开关:对靶向治疗,”专家意见的治疗目标,13卷,不。5,593 - 603年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
38. Satokata, l·马·h·Ohshima et al .,“Msx2不足导致骨骼生长和外胚层的多向性的缺陷小鼠器官的形成,“自然遗传学,24卷,不。4、391 - 395年,2000页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
39. f . Ichida r .西村k .要么et al .,“互惠Msx2的角色在调节成骨细胞和脂肪细胞分化,“生物化学杂志,卷279,不。32岁,34015 - 34022年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
40. t·c·李,李l, l . Philipson e . b .络腮胡子,“Myc压制逮捕gas1基因转录的增长,”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷94,不。24日,第12891 - 12886页,1997年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

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