冠脉内自体CD133⁺细胞在心肌梗死和跟踪Tc99m MIBI闪烁扫描法的心脏地区参与细胞归巢

文摘

CD133间充质细胞使用磁microbead anti-CD133从骨髓单核细胞抗体(BMMNCs)。流式细胞术和使用特定的抗体免疫细胞化学分析显示,这些细胞CD133在本质上是89±4%⁺CD34和8±5%⁺。CD133⁺/ CD34⁺BMMNCs分泌cardiotrophin-1等重要的生物活性蛋白,血管生成和神经源性因素,形态形成蛋白质,促炎和体外重构因素。单内注入自体CD133⁺/ CD34⁺BMMNCs患者有效,减少梗塞大小为分析Tc99m MIBI心肌显像。大多数患者通过左冠状动脉治疗。9个月后细胞疗法,5 8例显示净积极回应治疗心脏的不同地区。吸收Tc99同位素和振兴的心脏面积inferoseptal地区更明显()与顶点和anterosptal地区冠脉内注射后的干细胞。这里的细胞选择属性对于他们的潜在的用于细胞疗法和导航可以跟着没有重大困难的显像。这里提出的细胞疗法是安全的,应该实践,我们发现,结合scintigraphic观察心脏领域的最佳应对自体CD133的注入⁺/ CD34⁺BMMNCs。

1。介绍

心脏衰竭是全球死亡的主要原因,和目前的治疗只能延缓疾病的发展。心肌细胞是一个稳定的细胞群,只有有限的潜在损伤后更新(1,2]。组织再生干细胞可能是由于渗透,这分化成心肌细胞(3]。实验室实验和最近的临床试验表明,细胞疗法可以改善心脏功能(4,5,这个心脏再生的影响是产生了巨大的反响。这些新发现激发了乐观,心力衰竭的恶化是可以预防甚至逆转细胞治疗(6]。

大量研究证明,骨髓衍生的细胞移植后急性心肌梗死、缺血性心肌病可能导致减少梗塞疤痕大小和改善左心室功能和灌注。此外,成功的影响可能会影响到细胞的数量(祖源)和质量,时间(7),路线(肌内、冠脉内)8),和类型的心肌病4]。

骨髓干细胞(bmsc)可以分化成多种细胞类型出现在心脏(9]。星座sex-mismatched移植后心肌组织分析解剖之后,这是表明间充质干细胞的大英博物馆中发挥关键作用的发展混合嵌合心肌细胞和内皮细胞移植后10]。

在一些随机研究bmsc由冠脉内注射,左心室射血分数(LVEF)测定心肌梗死后3 - 6个月(4];这是观察到有一个增加3 - 12%(平均6%)在心脏功能5],最近出版了一本非常有用的审查正在进行的临床试验的干细胞治疗心脏疾病在美国,这是一个不错的信息来源。

来源的干细胞治疗心脏病可能来自从造血祖细胞(BM、外周血、脐血),间叶细胞(BM,脂肪组织),骨骼(肌肉),内皮(BM,外周血)和心脏(梗死边界,心外膜)细胞5]。这些细胞具有高潜力的多功能活动和可以参与组织重构的分泌生长因子以自分泌或旁分泌的方式。在动物模型(老鼠),两个细胞类型,即骨胳肌母细胞或CD133⁺祖细胞,导致改善心脏功能11,12]。

当前的测试如心电图、LVEF(左心室射血分数),LVESV(左心室收缩末期容积)和LVEDV(左心室舒张期结束卷),评价的主要指标是干细胞疗法的疗效。然而,细胞疗法的疗效原位水平需要确定然后就可以考虑在任何治疗协议。通过磁共振成像和闪烁扫描法允许成像在活的有机体内跟踪的细胞,可以提供一个更好的理解和评价功能的影响心脏干细胞疗法。在这些直接与同位素标记的细胞和跟踪是一个有吸引力的建议13,14]。

在这里,我们报告,CD133⁺细胞与骨髓单核细胞分泌调控蛋白包括一些生长因子的大阵。当这些细胞注入立即在冠心病患者和postinfarction心硬化,他们能够修改振兴梗塞疤痕所探索的显像。

2。材料和方法

2.1。骨髓标本

骨髓样本获得5健康个体和15个不同的心脏疾病患者。所有获得的样本个体病人的知情同意后,依照规则修订的《赫尔辛基协议。所有参与者提供书面同意参与这项研究。塔吉克斯坦卫生部给他们的伦理委员会批准程序整地和承担这项研究。

2.2。细胞的准备

骨髓单核细胞(BMMNCs)分离()通过对聚蔗糖密度梯度离心- 400 (PAA实验室、前期准备、法国)。BMMNCs层收集和单核细胞/巨噬细胞细胞被孵化的消除与聚苯乙烯表面。CD133⁺BMMNCs分开了磁珠分离方法遵循制造商的指示(mac;Miltenyi研究、法国)。孤立的CD133的纯洁⁺分析了使用fluorochrome-conjugated anti-CD133单克隆抗体。这些包含CD34细胞准备⁺细胞和他们的数量是量化通过使用anti-CD34单克隆抗体免疫细胞化学(马伯,Miltenyi研究,巴黎,法国)。BMMNC-derived CD133⁺/ CD34⁺是从事这项工作描述的治疗方案。

2.3。细胞培养

BMMNCs或孤立的CD133⁺细胞被镀0.2% gelatin-coated井(σSaint-Quentin Fallavier,法国)和维护在内皮细胞基底介质MV2 (ECBM mv方,Promocell、海德堡、德国)补充ECBM-MV2补充(Promocell)。在6天的文化,不依从细胞被移除,新媒体应用,和文化进一步维护通过3天,10日或21日。

2.4。细胞因子的数组

为了分析在体外分泌生物活性蛋白质的骨髓干细胞,BMCD133的上层清液⁺细胞()分析了使用一系列蛋白质细胞因子(RayBio人类细胞因子抗体)。这项技术是基于“三明治免疫测定的原则。“这包括实质上的筛选,一式两份,174种不同的膜耦合anticytokines连同适当的控制(实验重复3次)。BMCD133⁺细胞(10⁶细胞每毫升)孵化rpmi - 1640年没有胎牛血清在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司₂为24小时。上层清液含细胞因子的检索和细胞因子之前被允许夫妻和他们的特定的抗体固定在膜上。膜饱和了2小时在室温下与牛血清白蛋白(BSA)。孵化的数组膜上层清液(连同控制)进行了一夜之间在4°C使用相应的抗体。连续几个洗后,膜被孵化的抗体和anticytokines生物素化的一夜之间在4°C。链霉亲和素,加上合,增加了膜在室温下2小时。antibody-coupled蛋白质的存在揭示了通过应用发射极耦合逻辑(增强化学发光)膜,根据制造商的建议。膜被暴露于感光胶片(美国柯达、X-Omat AR)。感光胶片上的捕获的化学发光强度测量和记录。减去背景噪音后,结果被表示为一个实验和化学发光强度的比例控制。 The positive control was considered as 1. Less than −2 ratio values indicated a reduction of the cytokine and a value greater than +2 indicated an increase in cytokine expression. The proteins detected by protein array from the three independent cell preparations were considered as bioactive proteins.

2.5。病人

15个患者诊断为缺血性心脏病和心肌梗死(递延Q-myocardial梗死没有重大并发症禁止3到6个月)。之前立即植入的干细胞,所有患者接受冠状动脉造影,进行血管造影系统“Infinix CC”(东芝、日本)。在左冠状动脉动脉造影术进行4 - 6 3 - 4预测预测和右冠状动脉。透视时间范围从2到9分钟。在一些科目,冠状动脉造影显示严重冠状动脉病理:左冠状动脉主干血管病变(4例)和3(7例)。

2.6。治疗的患者

骨髓是标准的胸骨穿刺后在局部麻醉的情况下。从单核细胞CD133干细胞分离使用聚蔗糖密度梯度离心法,其次是immunomagnetic分离。孤立的冠状动脉疾病患者的细胞注入动脉内的下到冠状动脉血管造影术平均剂量5毫升的悬架包含0.8 -150万个细胞。纯化CD133⁺阳性细胞被储存在4°C在0.9%氯化钠直到心肌内的注入。在冠状动脉灌注的干细胞进行了考虑心肌缺血的血管造影结果和地区:12例的干细胞直接引入到左冠状动脉,并在3例引入两个冠状动脉。所有的病人,除了他们的经典疗法治疗雌二醇(Estreva 0.75毫克/天两个月)。

2.7。临床赞赏

临床检查和当前使用的测试如心电图,EFLV(左心室的射血分数),LVESV(左心室收缩末期容积),和LVEDV(左心室舒张期结束卷)是为了评估心肌灌注的动态执行在所有冠心病患者和post-infarction心硬化细胞疗法之前和之后。11个15的治疗病人,我们进行心肌显像使用Tc99 m与配体methoxyisobutylisonitrile (MIBI)后1和3个月的时间间隔。这些患者8 11的9个月后再次被闪烁法进一步调查。

3所示。结果

3.1。孤立BMMNCs和BMMNC CD133⁺分化成贴壁细胞

BMMNCs孤立不同正常的骨髓捐赠者()。CD133⁺细胞被孤立,他们纯洁被发现超过%作为评估通过流式细胞术。这些细胞制剂包含% CD34⁺BMMNCs。

CD133⁺/ CD34⁺BMMNCs是在体外培养在特定条件下节中描述2。图1介绍了CD133⁺/ CD34⁺BMMNCs后3天6天(a)和(b)的文化。3周后在文化、贴壁细胞显示观察形态学方面完全不同。事实上,某些细胞长,磨损而其他人都很小(结果未显示)。

3.2。粘附细胞的数量是由各种类型的细胞

为了确定细胞组成文化的类型,immunofluorescent进行分析。这表明某些特定标记细胞被积极的平滑肌细胞(αSMactin⁺),其他的特定标记内皮细胞(CD31和vWF⁺)。

然后我们量化,通过计算每个细胞类型的百分比粘附细胞人口的比率/细胞核染色DAPI染色细胞(Interchem)在5个不同的显微视觉领域每个病人样本,40 x放大。这些系统枚举显示附着的细胞群组成%的反α光滑的肌肉细胞和%的内皮细胞。有趣的是,剩下的信徒的细胞群%是系统- 2标记测试。

3.3。信徒细胞分泌生物活性蛋白质

经过3天的文化,CD133的三个样品⁺/ CD34⁺BMMNCs细胞三种不同捐赠者的孵化条件培养基在37°C 36 h。Ray-Bio蛋白质阵列的上层清液进行了测试。如表所示1,CD133⁺/ CD34⁺BMMNCs分泌在体外cardiotropin-1等重要生物活性蛋白质,血管生成因素(胎盘血管生成素、angiopoitein-2基本成纤维细胞生长因子,生长因子,血管内皮生长因子(VEGF) - 121, VEGF - 165和VEGF-D),神经源性因素(agouti-related蛋白质、脑源性亲神经的因素,人类的纤毛神经营养因子,基本的神经生长因子,amphiregulin, neurotrophin-3, 4、苯丙酸诺龙和催乳素),形态形成蛋白质(BMP-4骨形态形成蛋白,5、6和7),和一些促炎和重构因素。然而一些细胞因子缺席在生物活性蛋白质测试(结果未显示)。

3.4。CD133的使用⁺/ CD34⁺BMMNCs对冠脉内注入

细胞疗法,孤立的CD133⁺/ CD34⁺BMMNCs注入是通过股动脉冠状动脉。患者检查后3、6和9个月。

病人的临床检查结果在这两个时间间隔显示净改进开始三个月,也灌注后6和9个月。检查表明,病人的一般身体状况改善,如努力容忍、身体耐力,和整体的自治权。此外,对待患者有一个更好的精神状态”完美的行动”的影响和控制。一个病人的治疗组也死于另外两个对照组(其中一个偶然)。

3.5。梗塞后疤痕大小减少冠状动脉内注入干细胞

11例病人的心肌Tc99m MIBI闪烁扫描法的执行评估心肌灌注的动态。图2介绍了Tc99的吸收动力学同位素前后心脏地区的压力(33 - 190天后的细胞疗法)。闪烁法调查的心在八11(表21和3个月后)患者的细胞在左冠状动脉灌注()和右冠状动脉(显示相当大的增加稳定的灌注,所监测的指标。持续的进步又指出,经过一段时间的9个月。在这些患者中,高的Tc99 anteroseptal地区(%)(表3(一)),inferoseptal(表3(b)),顶点(表3(c))细胞疗法后(休息和压力)和细胞疗法(压力)确定。图像评估定量测量在该地区活动的风险和表达为术后灌注和术前灌注的区别。后一个注入干细胞(图3),我们注意到差异Tc99同位素吸收Anteroseptal 8个里面有5个患者的心肌,7的8 Inferoseptal患者和6 8例顶点区域。这些结果表明,心肌的振兴是不一样的在不同的解剖部位的心。

如表所示4,对待患者分为两类:回应者(A)、(B)非急救员。Tc99包含高,细胞疗法后,巨大的改变在inferoseptal地区(在应答患者()。在非急救员,Tc99纳入不同地区的心脏没有明显不同术前和术后灌注压力条件下()。这些结果表明,inferoseptal区是一个很好的干细胞疗法的目标。7例8,吸收的同位素的核心是增加。

的领域受益于心肌振兴,9个月在两个病人的细胞疗法后呈现在图4。这两个(Sh.I之一。,病人没有。2),提出了最小吸收Tc99在治疗前之前,隔膜,anteroseptal inferoseptal区域(图4(一))。治疗后,心脏的地区前和中隔强劲复苏的(图4 (b))。这个病人被治疗52×10⁴CD133⁺/ CD34⁺BMMNCs,细胞被引入的左冠状动脉(LCA)。在第二个病人(M。病人没有。7),隔膜,anteroseptal inferoseptal区域受损(图4(一))。观察细胞疗法后,振兴在所有这些区域(见图4 (b))。这个病人被68×10治疗⁴CD133⁺/ CD34⁺BMMNCs,细胞被引入的右冠状动脉(RCA)。这些结果清楚地表明积极影响的细胞疗法所确定的scintigraphic诊断冠心病患者Tc99 m和post-infarction心硬化细胞疗法后9个月监测时期。这些病人继续取得进展的礼物。

4所示。讨论

骨髓CD133-positive (CD133⁺)细胞具有强大的造血和血管生成能力,可以分化成多种组织类型如脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞、神经细胞和肌细胞。我们测试的可行性、安全性和功能性的影响丰富CD133的使用⁺祖细胞在冠心病患者冠脉内管理和post-infarction心硬化。

我们注意到,当我们使用磁microbead技术CD133的浓缩⁺包含CD34细胞,细胞也准备⁺祖细胞。CD133⁺/ CD34⁺BMMNCs与特定的媒介可以分化成多种细胞类型,如内皮细胞、脂肪细胞、骨细胞、神经细胞、肌细胞(15(结果未显示)。在这项研究中,只有差异化的CD133⁺/ CD34⁺BMMNCs内皮和myofibroblastsαSMactin⁺细胞了。这些结果证实了先前的观察CD133的多功能特性⁺/ CD34⁺BMMNCs。

我们分析了生物活性蛋白质的分泌CD133⁺/ CD34⁺BMMNCs在体外。蛋白质分泌血管生成和神经源性因素,形态形成蛋白质和一些生长因子。一个有趣的生物活性蛋白质由这些细胞分泌cardiotrophin-1 (CT-1)是白细胞介素- 6型细胞因子家族的一员。这些细胞因子调节重叠的多效性的行为在不同的细胞类型包括心肌细胞、肝细胞、巨核细胞,破骨细胞,神经细胞。重要的是要注意,CT-1被证明特别保护心脏细胞免受缺血性损伤(16]。CD133的角色进行修复心脏地区的多步和几个因素的干预过程中无疑增强了我们选择的CD133在心脏病治疗协议。

CD133⁺/ CD34⁺BMMNCs也强烈pro-angiogenic(表能力1(一)分泌一些因素如血管生成素,angiopoitein-2, vegf - 121(血管内皮生长因子)和165年,VEGF-D, PLGF(胎盘生长因子)和b-FGF(基本成纤维细胞生长因子)。这些因素可能参与血管生成/后血管再生细胞疗法(17]。

我们已经表明,CD133⁺/ CD34⁺BMMNCs也产生一些炎性因子包括趋化因子i - 309 (CCL-1) MCP-1 (CCL-2) MIP-1家庭(CCL-4),咆哮(CCL-5) interleukin-1受体拮抗剂(IL-1ra) CXCL-16, MIF和sTNFR-1。这些干细胞分泌的促炎的因素(表1(b))在所有概率干预组织重构的梗死区。

骨髓干细胞分泌几个有趣的基质金属蛋白酶(MMPs)如MMP1(胶原酶),MMP3 (stromelysin), MMP9(白明胶酶),MMP13(胶原酶)及其抑制剂(TIMPs): TIMP2, TIMP4 TIMP1。基质金属蛋白酶属于一个大家庭的蛋白酶在细胞外基质重塑中作用和影响细胞行为如细胞增殖、迁移、分化和血管生成。金属蛋白酶组织抑制剂的天然蛋白质,特别是抑制基质金属蛋白酶和贡献对之间保持一个平衡矩阵破坏和矩阵(表形成1(c))。这些特殊家庭的存在蛋白质,由干细胞分泌,有利于他们的重要性矩阵引导组织基质的重建。

如表所示1(d)和1CD133 (e)⁺/ CD34⁺BMMNCs分泌neurophilic和骨形态形成具有生物活性的蛋白质。neurophilic因素基本上AGRP (agouti-related蛋白质),BNDF(脑源性神经营养因子),据(人类纤毛神经营养因子),沙土荒漠(schwannoma-derived生长因子,Amphiregulin)是一种生长因子以及星形胶质细胞的有丝分裂原,雪旺细胞,成纤维细胞(18),b-NGF(基本神经生长因子),NT-3 (neurotrophin-3),请(neurotrophin-3),激活素A,催乳素(表1(d))。这些因素促进神经发生和神经细胞分化[19]。这些因素的重要性在建立/重建轴控制心肌和神经支配。

CD133产生的形态形成的蛋白质⁺/ CD34⁺BMMNCs BMP-4, BMP-5、BMP-6 BMP-7(表1(e))。这些蛋白质构成的一组重要的形态形成的信号,需要全身orchestering组织架构(20.]。他们是主要演员在胚胎发育过程中,特别是在早期胚胎模式和骨骼形成(21]。他们还参与vasculature-guided神经元迁移在正常和病理条件下(22]。再一次,血管生成的协调行动,神经性和CD133提供的地貌成因的⁺/ CD34⁺BMMNCs似乎必要的细胞机制导致心脏复苏的伤害。

心脏病,心肌纤维的再生几个策略提出了不同的祖细胞(见部分1)。在这其中,CD133的使用⁺/ CD34⁺BMMNCs似乎是一个有吸引力的候选人。事实是,分子和细胞的干细胞提供属性对改变他们的微环境接触似乎是毫无疑问的。他们似乎有一个固有的重编程能力的微环境在细胞和分子水平。cell-cell-matrix交互是一个必要的阶段导致受伤的组织修复/疤痕。因此明显,CD133⁺/ CD34⁺BMMNCs干细胞治疗心脏病的一个选择,可以建议病人用最小的风险。

在这项工作中,我们因此CD133使用⁺/ CD34⁺BMMNCs在心脏组织重塑患者冠状动脉心脏疾病和postinfarction心硬化。介绍了在12个患者干细胞直接进入左冠状动脉和3例:到左和右冠状动脉。然而在实践中有更少的向右冠状动脉注入干细胞的频繁发生阻塞的血管。在这种情况下,引入总剂量的干细胞通过左冠状动脉造成的通过这些细胞的缺血区右冠状动脉通过间接的联系。

7 8例,冠状动脉左前降枝的细胞被注入,只有一个病人的细胞被注入在右冠状动脉。在1到9个月患者监测。我们尝试使用闪烁扫描法跟踪的影响引入干细胞的不同区域的心。因此本研究范围原位观察细胞输注后心脏病。

冠脉内干细胞注入了减少梗塞疤痕的大小。这振兴观察15例11的(结果未显示)可能是由于一个CD133后血管生成过程⁺/ CD34⁺BMMNCs疗法或cardiomyogenesis,或两者兼而有之。CD133⁺细胞可以分化成细胞和内皮细胞,但CD34⁺只能分化为内皮细胞通过细胞成血管细胞成熟。

9个月后细胞疗法,5 8例显示净积极响应在不同地区治疗心脏的评估显像。吸收Tc99同位素和振兴的心脏区域inferoseptal地区更明显比顶点和anterospetal地区冠脉内注射后的干细胞。此外,我们注意到,吸收的TC99同位素在细胞疗法之前和之后2例9个月后治疗。他们表明,细胞疗法由两个不同的路线(LCA或RCA)能够振兴心脏的不同区域,表明干细胞疗法可以生成抵押品脉管系统用于灌溉的心脏地区。9个月后,一个更好的精神状态也指出在所有治疗的病人。

总之,在这个非随机研究中,我们表明,CD133 BMMNCs分泌重要生物活性蛋白质和细胞疗法可以是一个很好的选择。冠脉内自体CD133⁺/ CD34⁺BMMNCs减少梗塞大小在冠心病患者和梗塞心硬化。细胞疗法的方法这里提出应该练习结合显像观察心脏领域的最佳应对自体CD133的注入⁺/ CD34⁺BMMNCs。

利益冲突

作者没有财务利益冲突。

确认

作者感谢j .先生Almajid从迪拜,Prrofessor h . Sadeghi于心血管手术,洛桑大学和k Farid博士从酒店上帝医院,巴黎,他们宝贵的帮助。这项研究由塔吉克斯坦卫生部临床试验,政府的数字,01011 td053。

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