人类脂肪组织衍生干细胞促进肝脏再生毒性损伤的大鼠模型

文摘

的持续缺乏捐献器官和异体移植术的风险,肝脏再生的可能性与自体干细胞脂肪组织(ADSC)是一个有趣的替代。使用一个模型,在雄性sd大鼠中毒性肝损伤,产生重复腹腔内retrorsine和烯丙醇的应用,人类ADSC的能力来支持恢复肝功能的调查。三分之二的肝切除术进行,人类ADSC注入一个剩余肝脏叶组1 (= 20)。注入的细胞培养基中执行组2 (= 20)作为控制。环孢霉素应用于实现免疫耐受。手术后每周都抽取了血液样本以确定liver-correlated血值。6和12周后手术,动物被牺牲和组织学部分进行了分析。ADSC明显提高术后白蛋白(< 0.017)、总蛋白(< 0.031),谷氨酸草酰乙酸的转氨酶(< 0.001)和乳酸脱氢酶(< 0.04)水平相比,注射的细胞培养基。移植细胞可以发现手术后12周在组织学部分。本研究指向ADSC作为一个有前途的替代肝细胞或肝器官移植患者的严重肝功能衰竭。

1。介绍

慢性乙型肝炎肝硬化的基础上或C,自身免疫性肝炎、慢性酒精滥用,原发性硬化性胆管炎,原发性胆汁性肝硬化肝脏功能不足只有几个可能的原因。无论慢性肝损伤纤维化的原因是最终的端点。慢性肝病的最常见原因是慢性病毒性肝炎导致炎症和坏死后胶原的沉积在门户和门静脉周的时尚1]。目前,治疗仅限于肝脏器官和很少肝细胞移植。两者都是,只有有限数量的患者由于缺乏捐献器官,与肝细胞供应困难。人类肝细胞在细胞培养难以维护,不扩大在体外,倾向于去分化在文化2]。间充质干细胞(MSC)代表一个有利的同种异体的移植细胞类型,因为它们与低immunoprivileged主要组织相容性复合体(MHC)我和MHC II表达式,因此降低同种异体的移植排斥的风险(3]。MSC从脂肪组织(ADSC)已被证明成功分化成hepatocyte-like细胞与变量关于形态学和功能,如尿素的形成、糖原合成、细胞色素P450酶的活动,和表达hepatocyte-specific基因的成绩单(4,5]。最近老鼠ADSC管理通过阴茎静脉显示出促进肝再生中肝缺血再灌注损伤的大鼠模型和随后的肝切除术通过显著提高细胞有丝分裂指数,antiproliferating细胞核抗原水平与肝再生相关的蛋白质和基因的表达(6]。

评估ADSC体内对肝脏再生的影响,需要进行研究和实验性肝坏死。实验性肝坏死可能引起不同的代理商,CCl烯丙醇等₄、乙硫氨基酪酸和半乳糖胺。然而,烯丙醇主要是唯一的毒素,引起门静脉周的破坏模式与在病毒性肝炎(1]。优化这个模型的慢性肝病,剩下的肝细胞的增殖必须抑制另外为了防止在几天内恢复肝功能。Retrorsine pyrrolizidine生物碱是选择性的肝脏,然后代谢成它的生物活性形式。结果是蛋白质和DNA的烷基化。反过来,这阻碍了细胞周期通过抑制有丝分裂,从而防止正常肝细胞增殖持续好几个月。此外,retrorsine发起正弦阻塞的肝损害正弦内皮细胞(7,8]。研究表明,肝组织损伤的唯一的烯丙醇的应用或烯丙醇的组合retrorsine促进只有轻微的移植细胞的增殖(特别是肝细胞)。一个额外的2/3肝切除术大大提高移植细胞的增殖(9]。

在严重或慢性肝损伤肝细胞增殖的同时抑制肝内门静脉周的地区的干细胞被激活和迁移对肝小叶的中心而分化为肝和胆的细胞。据推测,还涉及骨髓衍生干细胞在肝再生10,11]。出于这个原因,我们假设从不同的来源的干细胞也可以扮演一个角色在肝功能的恢复。考虑到缺乏捐献器官和陪异体移植术的风险,如感染或移植失败,和必要的免疫抑制其负面影响,支持肝脏再生与自体脂肪组织衍生干细胞似乎是一个有趣的和有前途的选择。尤其如此,脂肪组织足够可用在大多数人们和组织采样不会引起重大的缺陷。

2。方法

所有的化学物质,如果不是另有规定,从Sigma-Aldrich购买,德国慕尼黑。

2.1。隔离和脂肪组织衍生的文化间充质干细胞

所有的参与者提供了他们的书面知情同意参与这项研究。这个过程以及知情同意的形式得到伦理委员会的批准。这个研究的指导方针和批准下海德堡大学的伦理委员会和医学协会的地区普法尔茨,德国。知情同意后,刚切除皮下脂肪组织6名健康成年女性的一系列34-59岁(平均年龄39.5岁)和BMI的22-33(平均体重指数26.6)择期整形外科,腹壁整形术,用于隔离的间充质干细胞使用程序修改胡安et al。12]。短暂,在去除纤维组织,脂肪组织在1% BSA / PBS洗两次,剁碎,胶原酶消化的酶(胶原酶CLS;220 U /毫克,Biochrom AG),柏林,德国,1.5毫克/毫升,1% BSA / Krebs-Ringer-solution) 45分钟在不断摇晃在37°C。成熟的脂肪细胞和结缔组织被离心分离(700×g, 7分钟。RT)。resuspended沉淀细胞,通过100年μm筛网过滤器(Neolab、海德堡、德国),并与1% BSA / PBS洗两次。红细胞裂解(3分钟后,155毫米氯化铵,10毫米碳酸氢钾,和0.1毫米EDTA)细胞的密度又洗了两次,镀2×10⁴细胞/厘米²在扩张中。12小时后删除不依从细胞中被改变。扩张中取代了每隔一天。

细胞培养在扩张中(60%杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM))(表达载体,卡尔斯鲁厄,德国),40% mcdb - 201(σ),1×胰岛素转铁蛋白硒(德国海德堡,正欲),10⁻⁸抗坏血acid-2-phosphate M地塞米松,0.1毫米,2%胎牛血清(Biochrom,柏林,德国),100 U /毫升青霉素(Biochrom), 0.1毫克/毫升链霉素(Biochrom), 10 ng / mL rhEGF (Miltenyi, Bergisch格拉德巴赫,德国)和10 ng / mL rhPDGF-BB (CellSystems,圣Katharinen,德国)。交换媒介是每隔一天。一旦细胞融合达到了70%,他们分离trypsin-EDTA 0.25% (Biochrom,柏林,德国)和山肩为3.5×10³细胞每厘米²。文化在37°C和5%孵化有限公司₂。

2.2。脂肪形成的分化和油红染色

细胞被播种在扩张中细胞密度为24.000 /厘米²。达到90%的融合后,脂肪生成被交替使用基础培养基诱导(5% FCS / DMEM)补充IDI-mix (500μM 3-isobutyl-1-methylxanthine;1μM地塞米松;1μ吲哚美辛)2天基础培养基+ 10紧随其后μg / mL胰岛素1天。感应循环重复3次。确认成功的脂肪形成的分化,胞质甘油三酸酯脂滴沾了油红O染色法(如前所述13]。

2.3。成骨分化和茜素红染色

播种后的密度24.000细胞/厘米²扩张,细胞生长在媒介融合的90%。成骨的感应是通过改变介质DMEM包含5% FCS,补充了50μM L-ascorbate-2-phosphate, 0.1μM地塞米松,10毫米β甘油磷酸酯二钠。钙沉积被茜素红染色显示结果如下:层的矿化MSC与PBS过剩和洗两次固定prechilled 70%乙醇在−1小时20°C。经过短暂的洗涤与H₂啊,细胞层是孵化40毫米茜素红(pH值4.2)在室温下1分钟。非法人染料的愿望后,细胞被洗两次过剩的H₂O和显微分析之前用PBS。

2.4。流式细胞术

hADSC扩展到四人通过检查表面标记表达式使用流式细胞仪。下面的单克隆抗体(mab)共轭荧光染料使用:anti-CD13-APC, anti-CD31-FITC, anti-CD34-FITC, anti-CD44-APC, anti-CD45-FITC, anti-CD49a-PE, anti-CD73-PE, anti-CD90-APC, anti-CD105-FITC, anti-CD106-APC从正欲(所有)。同形像抗体包括荧光染料。

细胞分离与0.25% trypsin-EDTA,孵化与直接共轭马伯FACS-buffer (1% FCS, 0.1% NaN₃在冰PBS) 30分钟,用流式细胞仪缓冲洗两次,用1%多聚甲醛/ PBS和固定。细胞进行了分析使用FACSCanto流式细胞仪系统(正)。与女主角进行了数据采集和分析软件(正)。

2.5。CM-Dil标签

细胞分离有0.25% trypsin-EDTA (Biochrom)和离心机在室温下与250克。上层清液的排放和60%的颗粒resuspended DMEM低葡萄糖(1 g / L d -葡萄糖)(表达载体),40% mcdb - 201 1×胰岛素转移硒(正)、地塞米松可达米,0.1毫米抗坏血acid-2-phosphate, 100 U /毫升青霉素(Biochrom)和0.1毫克/毫升链霉素(Biochrom)最后一个1×10的浓度⁶细胞/毫升。20μM CM-DiI(活力CM-DiI V22888数目,分子探针)添加和孵化5分钟37°C。细胞培养另一个常数缓慢摇动40°C下15分钟之后,在室温下与250 g离心。上层清液排放,颗粒洗两次DMEM低葡萄糖(1 g / L d -葡萄糖)。那么细胞透过40μ,正欲M细胞过滤器(Falcon)和resuspended 60% DMEM低葡萄糖(1 g / L d -葡萄糖)(表达载体),40% mcdb - 201 1×胰岛素转移硒(正)、地塞米松可达米,0.1毫米抗坏血acid-2-phosphate, 100 U /毫升青霉素(Biochrom)和0.1毫克/毫升链霉素(Biochrom)的最终浓度2×10⁶细胞/ 100μl

2.6。动物

本研究通过动物福利委员会鲁普雷希特卡尔海德堡大学,德国卡尔斯鲁厄的省级权威,巴登-符腾堡州依照国家动物福利法案的指导方针。所有程序都是根据这个进行批准。

女性雄性sd大鼠中重140 - 200克从查尔斯河实验室购买。他们保持一个自动12小时光/暗周期和喂养标准的鼠粮(嗅嗅,德国)和水随意。经过一个星期的适应环境,血液通过尾静脉为胆碱酯酶(CHE)确定标准水平,血清总蛋白、白蛋白、谷氨酸草酰乙酸的转氨酶(得到),谷氨酸丙酮转氨酶(GPT),铁,碱性磷酸酶(美联社)和乳酸脱氢酶(LDH)。那么所有老鼠收到两种retrorsine腹腔内注射,相隔13天的间隔,每30毫克/公斤体重。Retrorsine盐酸溶解在(pH值2.5)、其次是由氢氧化钠中和0.1 N。第二个retrorsine注入后30天,动物收到10多次注射的烯丙醇每三天,每个0.31更易/公斤体重。烯丙醇的最后注入三天后所有动物进行了三分之二部分肝切除术。内侧肝左、右叶和左侧侧肝叶切除;所有其他叶保持原位。动物被随机分成两组。 Group 1 received 2 × 10⁶SC 200年μL DMEM直接注入其余侧肝右叶和组2收到200μL DMEM和担任控制。注射入口孔封闭了短双极电冲动。彻底清洗除去剩余的血液凝块后,自动渗透泵(2 ml4 Alzet查尔斯河,Sulzfeld,德国)植入了腹腔连续释放环孢霉素。腹壁被缝合在三层关闭。手术后护理管理丁丙诺啡和carprofen每12小时,如果需要的话。通过尾静脉血液是每七天八周,术后从第三天开始,直到动物被牺牲了。切的水平、总蛋白、白蛋白、,GPT,铁,美联社,LDH测定。血液水平之前第一个retrorsine注入被规定为标准的水平。每28天自动渗透泵所取代。手术后6 - 12周,十个动物牺牲的组织学分析干细胞的命运。

2.7。组织学分析

肝脏叶过程中切除2/3肝切除术以及那些被切除的随访期2、6、12和16周后注入ADSC或DMEM固定,石蜡包埋,处理6μ米部分如下。固定标本在分级乙醇脱水,嵌入在石蜡(Histosec,默克,达姆施塔特,德国),切成连续6μ米部分旋转切片机(Mod。RM2255;Leica-Microsystems,位于德国)。石蜡包埋的部分放入二甲苯,其次是分级乙醇(2×30秒100%,2×30秒96%和2×30秒70%)然后孵化与5 5分钟μ在PBS g / mL DAPI(表达载体)。最后的部分被洗了三次PBS和盖玻片用荧光安装介质(Dako,汉堡,德国)。

部分与荧光显微镜检查(DM 2500,徕卡)与ccd相机和记录(DFC 350外汇,徕卡)。覆盖不同的荧光通道的图像生成与徕卡应用程序套件2.7.0,徕卡。

2.8。血液参数的分析

分析血液参数进行使用ADVIA 2400分析系统(西门子医疗诊断);所有的化学品都从西门子购买医疗诊断。LDH,, GPT,美联社,格瓦拉是由测量动态酶活性。铁、总蛋白和白蛋白检测光度学的。

2.9。统计数据

由学生的结果进行了分析以及。Mann-Whitney等级和测试时使用正常测试失败了。被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。具备干细胞的决心

44岁的ADSC)阳性CD13 CD49a, CD63, CD73, CD90、CD105和存在。ADSC负了CD31、34和45(图1)。细胞因此满足最小的共识标准对于间充质干细胞(14,15]。脂肪形成的和成骨分化诱导评估多功能分化潜能。Adipogenically诱导细胞显示红色油浓度显著高于noninduced控制细胞在所有捐助者(图2)。Osteogenically分化ADSC显示高细胞外钙沉积,茜素红染色分析。Noninduced控制细胞并没有显示出细胞外钙沉积(图3)。

3.2。ADSC显著提高白蛋白、总蛋白水平,得到和LDH

retrorsine第一个应用程序之前,所有实验动物的血液水平符合基线水平对大鼠肝酶发表在《文学(图4(一))。他们被确定为标准的价值。术后白蛋白水平都在43 g / L的标准价值在整个时期的观察。有统计上显著高于白蛋白水平在细胞治疗动物比noncell治疗控制动物周手术后1到3 (= 0.016 - -0.017)。术后血清总蛋白在细胞治疗动物水平高于控制动物在整个周期的分析(图4 (b))。回到接近标准值(64 g / L)达成了在手术后第三周细胞治疗动物和一些延迟,第六周期间控制动物。在细胞内总蛋白水平在统计学上显著高于治疗组比对照组手术后在周2和3 (= 0.015 - -0.031)。

术后LDH水平控制动物躺下持续标准1605 U / L(图的价值4 (c))。在八周细胞治疗动物作为例外,LDH水平都高于控制动物,最大程度在手术后两周。在星期2,4,5,LDH在统计学上显著的高于细胞治疗组(= 0.003 - -0.04)与对照组相比。

术后有水平控制动物都在标准的130 U / L(图的价值4 (d))。在细胞治疗动物躺在noncell高于治疗动物从第一到第七周手术后,周一个统计学意义()。在周,特别是两个水平细胞治疗动物高于标准水平。术后CHE-levels显然是在标准的价值0.95 kU / L(图4 (e))。作为一个特定的标志显著降低肝功能和合成,其初始水平下30 - 50%标准的价值。两组切水平慢慢开始上升六周后手术。回到标准值没有达到8周期间的调查。参与对照组格瓦拉水平高于细胞治疗组;然而,没有统计上的显著差异()。

烯丙醇和retrorsine导致海拔GPT水平相比,手术前48 U / L(图的标准水平4 (f))。术后GPT水平高于对照组相比最大的细胞治疗组手术后第二个星期。之间没有统计上的显著差异细胞治疗和noncell对待动物。

美联社相比明显提高标准水平的125 U / L手术后直到星期6(图4 (g))。在星期6,碱性磷酸酶水平更高的动物相比,在细胞治疗的动物。没有统计上的显著差异()。

术后铁水平显然是在61年的标准水平μmol / L。除了星期5,动物细胞显示处理铁含量低于对照组(图4 (h))。两组没有统计学显著差异()。

3.3。注入ADSC可以检测到十二周后注射在肝脏组织学部分

高方差的坏死程度从老鼠到老鼠,瓣叶,部分,部分可观察到手术的时间。6和12周后手术注射肝标本石蜡包埋和组织学部分与DAPI染色CM-Dil-labeled形象化注射干细胞和细胞核(图5)。肿瘤形成的随访期内没有观察到细胞治疗后12周。

4所示。讨论

这项工作的目的是评价干细胞移植的可能性在慢性肝脏疾病领域,拓宽当前有限的治疗选择,从而提高生活的质量和整体影响患者的生存。因此,干细胞的集成支持肝脏病变肝组织和他们的能力的特定功能进行了分析使用一个模型在雄性sd大鼠中毒性肝损伤。烯丙醇与retrorsine主要用于建立肝损伤与门静脉周的位置,一个模式与病毒性肝炎,慢性肝衰竭的最常见原因(1]。烯丙醇诱导损伤发生的高峰期大约48小时后注射。高方差的坏死程度从老鼠到老鼠,瓣叶,在我们的实验中都可以看到部分,部分与其他作者的结果是一致的16,17]。这一事实使得很难获得统计学上显著差异由于个人的不均匀性数据。然而,我们的实验表明,注射ADSC 2/3肝切除术后肝脏受损可能会导致更高和更早的恢复肝功能noncell相比对照组治疗。这是鼓励了更高的白蛋白和总蛋白质含量的早期恢复。观察到的细胞疗法没有负面影响,尤其是没有肿瘤形成,与别人的结果是一致的(18]。

到目前为止,只有很少有研究分析了可能的有益人类ADSC对肝再生的影响。除了这些细胞很容易获得没有施主能级发病率有关,他们在文化与存活时间更长更高的增殖活动相比,BMSC [19]。BMSC的可能作用在发展中肝纤维化肝损伤过程中,由于拍摄白介素10中介,讨论有争议的是(10,20.- - - - - -22]。然而,我们没有看到证据,增强小鼠肝纤维化治疗脂肪组织衍生干细胞在我们的实验中。

与我们的方法使用未分化的ADSC,只有一些试图使用hepatocyte-like predifferentiated干细胞在肝脏再生。Banas等人报道减少血清水平,GPT,和氨后24小时内注射肝细胞,体外分化人类ADSC的尾静脉裸小鼠肝损伤的亚兰(3]。此外,Aurich等人提出更高的移植hepatogenically predifferentiated ADSC相比,未分化的ADSC当注射到小鼠的脾部分切除肝脏(4]。然而,有几个原因未分化的干细胞的使用。首先,未分化的MSC不如MSC-derived肝细胞接受氧化应激,因此更容易生存最初移植后缺氧阶段(23]。此外,predifferentiation是更昂贵,因此需要更多的处理步骤和文化组件意味着更高的风险在细胞培养中污染和浪费额外的时间不可能开始急需治疗。此外,未分化的BMSC,分化成hepatocyte-like细胞无细胞融合时直接管理到雄性sd大鼠中使用的肝脏肝内注射烯丙醇(24]。最重要的是ADSC被认为引起绝大多数的体内行为通过分泌生长因子和细胞因子,从而影响各种细胞功能在不同细胞类型。因此,predifferentiation不仅似乎是不必要的,但也可能会阻碍。符合,一些最近的研究评估未分化的ADSC在肝再生的影响。塞其等人表明,静脉注射ADSC显著提升在大鼠肝再生肝切除术三分之二。在第二天ADSC注射后,il - 6基因表达,VEGF, c-jun明显调节和不同与肝再生相关的蛋白质和细胞有丝分裂指数增加。,GPT,总胆红素水平,然而,没有显著影响ADSC注入(25]。

另一组研究人员在塞其等人注射小鼠ADSC。他们的模型由一个纯系小鼠模型的食源性肝病ADSC通过脾脏注射两次(6]。在14天随访期间,减少肝脏炎症细胞的数量,提高白蛋白的肝实质细胞的表达,可以确定和纤维化的改进。然而,血清参数没有评估和随访期为有限。此外,老鼠ADSC的结果不能直接与人类保持均匀ADSC,因为干细胞的不同物种之间的差异是已知的。此外,为了更好地模拟临床情况的多样性对于人类来说,它可能是远系繁殖有利使用鼠标或老鼠应变,在我们的实验中。符合,低质粗支亚麻纱et al。26)使用thioacetamide-induced远Wistar鼠慢性肝损伤模型。人类ADSC的两种不同的捐赠者与后续管理直接肝段28天。只有在特定的时间点血清白蛋白和pTT水平明显高于ADSC对待动物而控制。注入的ADSC没有标签管理和前,因此,只能慢慢在肝脏组织注射后14天通过免疫细胞化学。

与这些结果一致,ADSC的管理在我们的实验中也导致白蛋白水平大幅提高。此外,我们可以找到我们的prelabeled ADSC注射后12周。此外,我们不仅为我们的ADSC,流式细胞术,还进一步分析了其增殖和分化能力,目前仍被广泛认为是一个先决条件来确定细胞具备干细胞(14]。此外,显示一个更一般的结果,减少个体差异的ADSC活动,我们决定使用的六种不同的人类的捐助者。与上述研究,我们还进行了手术减少肝脏体积和一块内生的肝细胞增殖除了toxin-induced肝损伤关注ADSC的再生能力。结果,我们发现不仅白蛋白,正如上面所讨论的,ADSC组显著提高,但也有和LDH。

的显著增加和LDH水平可以讨论争议。一方面,烯丙醇也可以导致肝脏灌注损伤的血管内皮细胞的损伤(16]。肝再生还包括恢复肝脏灌注这可能导致增加流出细胞损伤的积累的参数,如有和LDH,因此增加了相应的血清水平的再灌注受损肝脏区域。另一方面,也可以假设一个提高血清水平表达的死细胞,移植的干细胞,也可能和释放细胞内的酶如LDH和实现。然而,注射干细胞可以找到从星期1到星期12手术后组织学部分(图5)。没有清除反应死亡干细胞由巨噬细胞被认为和CM-Dil无法在巨噬细胞中被发现。因此,我们相信,有和LDH实验的增加主要是由于恢复血液灌注在肝脏的连续增加清算和流出细胞损伤的累积参数。

美联社的增加和GPT第一次手术后的四个星期内,细胞治疗和控制组织,由著名的变化可以解释部分肝切除术后的胆汁流(16- - - - - -18]。在这个过程中,剩余的肝细胞暴露于负载的增加胆汁的组件。结合毒性坏死的肝实质这可能导致血压升高美联社和GPT。然而,我们没有看到ADSC的重大影响这一现象。

它已经表明,骨髓间充质肝的管理确实有影响肝实质的分布和功能。直接导致肝内注射干细胞细胞的广泛传播和更高的肝细胞而产生腹腔内注射导致主要门静脉周的分布和降低肝细胞的数量(27]。据报道,某些血浆蛋白的合成,如白蛋白、更高门静脉周的局部肝细胞比分布在其余的小叶。白蛋白合成随距离增加肝细胞的门静脉周的带向中心的小叶(27- - - - - -29日]。然而,在我们的研究中我们可以证明一个显著增加白蛋白合成肝内注射后的ADSC与对照组相比。一定分布格局的小叶内注射干细胞不能观察到的。注入的干细胞能找到注射后12周。在之前的实验中,注射干细胞只能慢慢约4周(30.]。

5。结论

这项研究表明,人类ADSC可以显著支持肝再生和功能在老鼠模型中毒性肝损伤和稳定整合到病变肝组织。这些结果指出未来可能的替代治疗急性或慢性肝病:患者自体ADSC的移植。这个愿景将提供可能克服现有的障碍在当前缺乏器官等治疗肝移植和肝细胞转移存在的问题,因为这些干细胞可以轻松,几乎无所不在地获得,甚至扩大之前治疗管理。然而,与标准化和安全协议,使临床医生在这个新的干细胞再生医学领域进一步的研究是必要的。

利益冲突

作者声明没有竞争的经济利益。

确认

本研究支持的说是老板霍普基金会,老总孔翰宁德国。作者要感谢莫妮卡Engstner,安娜Dyias, Regina贝克在细胞培养,流式细胞仪技术支持。作者想要感谢马丁施赖伯协助初步测试和外科手术。本研究在一定程度上在22日的欧洲组织修复社会会议,4 - 10月,2012年,雅典,希腊。

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