不同的文化媒体影响扩散、表面抗原决定基的表情,和绵羊的MSC分化

文摘

骨科植入物包括工程骨组织通常在羊进行测试。为了避免外源或异基因的细胞的排斥、自体的细胞是最好使用,也就是说,绵羊的间充质干细胞(oMSC)。不像人类的MSC,绵羊的MSC还没有得到深入研究关于隔离,扩张,和表征。在这里,我们调查了培养基成分对增长的影响特点,分化,oMSC的表面抗原表达。胎牛血清的培养基不同(FCS)内容的补充和/或额外的表皮生长因子(EGF)。我们发现FCS强烈影响oMSC核扩散和特定的组合补充因素(mcdb - 201, ITS-plus、地塞米松和L-ascorbic酸)确定表面抗原表位的表达。我们比较两个出版协议oMSC分化成骨的,脂肪形成的,和chondrogenic命运和发现(i)相当大的捐赠者捐赠的变化,(2)取决于协议变化,和(3)变化造成preculture介质组成。我们的研究结果表明,oMSC的隔离和文化在不同生长媒体高度关于oMSC表型和行为变量。此外,变化从捐赠者捐赠严重影响生长速率、表面标记表达式,和分化。

1。介绍

间充质干细胞(MSC)是一个特点和高度适应性再生医学和组织工程的细胞来源。1968年,Friedenstein和同事描述为第一次镀骨髓细胞血清中导致殖民地的形成呈贴壁细胞,可以分化成成骨细胞(1- - - - - -3]。今天,MSC在临床应用中所扮演的角色一直在探索I / II期临床试验涉及,例如,自身免疫性疾病,治疗急性移植物抗宿主病(GvHD)和造血细胞移植4,5]。MSC的其他应用程序,尤其是结合生物材料的修复受损组织和软骨和骨骼一样,为未来的治疗提出了谨慎乐观。然而,新型生物材料用于临床应用通常是在一些临床前研究涉及动物模型进行测试。羊整形是一个方便的大型动物模型的研究,因为他们的可用性,易于处理和住房,成本,和道德接受(6,7]。特别是,成熟的羊是人类骨骼视为一个有价值的模型营业额和改造活动,因为7 - 9岁的动物也显示出类似的骨骼结构和组成。此外,他们拥有成年人的体重与长骨维度使人类植入物的使用(6,8- - - - - -10]。因此,在骨科研究、羊经常用于临界大小的骨缺陷,然后处理不同的生物材料结合(predifferentiated) MSC [8,9,11- - - - - -17]。尽管相当数量的报告采用oMSC在组织工程中,对绵羊的oMSC或multipotency的证据在体外仅限于一些研究[18- - - - - -23]。在这些研究中,有广泛的生长和分化培养基的组成的变化,以及用于分析表面抗原的表达。增长媒体oMSC通常是基于αmem、DMEM或DMEM结合MCDB201。血清含量变化之间的2% (24)和20% (18,23的自体或胎牛血清(FCS),和其他补充剂如ITS-Plus预混料、地塞米松、L-ascorbic酸,或生长因子和表皮生长因子(EGF)和血小板源生长因子(PDGF)可以应用24]。因此,培养oMSC人口相当大的差异,他们的行为在组织工程应用程序假定。

对人类MSC (hMSC),系统的研究已经揭示donor-dependent异质性在增殖和分化25- - - - - -28]。的品种特征、命名(如骨髓基质细胞,多功能成年祖细胞和间充质干细胞),和媒体文化间充质干细胞和组织委员会国际社会的细胞治疗提出了引入标准化hMSC表型特征的,如上所述的意见书霍维茨等人(2005年29日和Dominici et al . (2006)30.]。尽管大型donor-dependent变化,hMSC向脂肪细胞的分化,成骨细胞和软骨细胞是如今标准化根据Pittenger协议和媒体出版于1999年(31日]。相比之下,没有标准化的协议描述和分化oMSC可用为止。

这里我们oMSC培养进行了系统的研究,在八个不同的增长媒体定义组成。第一个媒介,测试是一个描述几次oMSC[的文化21,22,32,33),由包含10% FCS DMEM低葡萄糖。第二介质通常用于hMSC文化(34- - - - - -36FCS),只有2%,但mcdb - 201, ITS-Plus,地塞米松,L-ascorbic酸(总结缩写后作为补充的“S”)和10 ng / mL表皮生长因子(EGF)。结果分化preculture后两个媒体不能再现的多样的强烈为每个捐赠者。此外,大量的脂质滴,表明脂肪形成的分化可以观察到在实验控制,当调查trilineage分化潜能。因此我们决定打破oMSC multipotency更加系统和有一个详细视图的扩张,分化,oMSC表面标记表达式,在八个不同的培养基含有不同FCS和表皮生长因子组合,有或没有补充剂如前所述。我们的研究结果表明,oMSC强烈依赖于FCS的扩散内容,而EGF和年代只是次要的角色。此外,表面抗原表位CD73 (5′-ecto-nucleotidase), CD90 (Thy-1)和CD105 (Endoglin)诱导根据FCS但不是EGF浓度培养基。最后,oMSC是依赖于捐赠的分化,协议的依赖和依赖培养基。

2。材料和方法

2.1。隔离和绵羊的MSC的扩张

所有的动物实验是根据ILAR FELASA规则和被一个动物实验伦理委员会批准任命的北莱茵州Westfalia。绵羊的骨髓MSC被分离出40毫升送气音从Rhoen羊髂骨与2毫升1.107%补充Di-Sodium-AEDTA (Alleman制药、Rimbach、德国),防止凝固。单核细胞是由聚蔗糖密度梯度离心收获(密度1.077克/毫升;Biochrom,德国柏林)和随后的25厘米²组织培养瓶增长媒体详细如下。

第二天,不依从绵羊的细胞被介质变化。进一步介质变化进行每3 - 4天。融合在80 - 90%,干细胞和干细胞使胰蛋白酶化胰蛋白酶(美国Walkersville Lonza)然后在细胞密度为500.000每75厘米²组织培养瓶。

2.2。增长的媒体

生长曲线和系统的表面抗原进行分析与oMSC生长在八个不同的媒体包含不同组合的FCS (F),补充(S)和表皮生长因子。媒体组合是总结表1。

生长曲线和倍增时间确定后,通过计算细胞数量每个通道,使用卡西细胞计数器(默克公司,达姆施塔特,德国),1 - 5通道,使用指数增长公式:

在哪里是细胞的数量在给定的时间点,是最初的细胞的数量,是增长率(/天),给定的时间(天)。

的倍增时间被转换之前的计算公式(参见[37])

2.3。分化

细胞分化诱导使用细胞分离和培养在F10或F2-S-EGF媒介。F10类似于一个标准中用于oMSC在先前的研究22,33,38,39],F2-S-EGF是一个标准的介质通常用于hMSC [34- - - - - -36,40]。

分化的分析了oMSC通道2 - 3,在F10 preculture后或F2-S-EGF。21天的分化是由文化感应媒体根据hMSC出版协议(协议1)(31日,35和oMSC分化(方案2)19,21]。测试媒体的构成可以从表2,3,4;所有媒体包含2毫米谷酰胺,100 U / mL青霉素,和100年μg / mL链霉素(PAA, Coelbe,德国)。

茜素红染色(40毫米)是用来确定磷酸氢钙积累。细胞培养是在4%甲醛固定15分钟,洗两次蒸馏水。细胞被染色的20分钟,在蒸馏水洗,拍照。

协议1后,脂肪形成的感应中首次增加了24 h后;后来,脂肪形成的诱导和维护中添加交替。协议2,只有脂肪形成的感应中添加了21天。媒体被换了三次一个星期。

在冰冷的50%乙醇固定,30分钟后10分钟染色油红O染色溶液溶解在0.02% (w / v100%的甲醇,1 M氢氧化钠)是用来确定lipid-laden脂肪细胞。文化与迈耶的苏木精复染色(σ,Steinheim,德国)和拍照。

经过21天的文化,颗粒聚集在4%甲醛固定,石蜡包埋,组织学上沾染了红色染料的红色在40%乙醇0.01% (w / v)为2分钟。治疗后在升乙醇系列中,幻灯片是安装和拍照。

2.4。通过流式细胞仪分析表面抗原决定基的表达式

流式细胞术、细胞使胰蛋白酶化和大约2×10⁵在PBS细胞每样洗两次。抗体常用染色人类或绵羊的MSC(表5)细胞孵育45分钟在冰上。样本在1%福尔马林固定或直接与FACS-Canto测量(BD生物科学,Walkersville,德克萨斯)。减少荧光在福尔马林固定7天内被排除在以前的实验(数据未显示)。无污点的细胞作为控制背景荧光。至少1×10⁴每个样品测定的事件。通道1中所有细胞进行了分析。

2.5。统计分析

数据分析是使用GraphPad棱镜6执行软件。通过方差分析比较组间进行(方差分析)模型与图基的多重比较测试。差异与被认为是具有统计学意义。从获得的数据独立样本(3 - 4),表示为均值±标准差。

3所示。结果

3.1。形态

一般来说,oMSC出现的形态呈平面在所有媒体增长。然而,小形态可以观察到的变化。绵羊的MSC生长在媒体包含10% FCS (F10)和/或补充(S)在P0小与最初的大蚁群的规模。在P1,细胞培养在媒体包含EGF显示少分化形态更加分散的界限。总的来说,oMSC最初生长在媒体没有年代和EGF显示一个小菌落大小、更少的信息接触和粗略的形态(图1)。此外,细胞生长在F2-S F2-S-EGF媒介迅速形成大细胞聚集在通道数量> 1(图片没有显示)。

3.2。细胞增殖

图2显示了初始种群密度P0,生长特性,为每个媒介翻倍。oMSC培养媒体含有10% FCS (F10)最初显示较高的细胞密度和较大的菌落大小、媒体相比,含有2% FCS (F2)。然而,低FCS内容媒体之外的年代(F2-S和F2-S-EGF)显示高细胞密度和更大的群体大小,而媒体没有年代(F2和F2-EGF)。

细胞培养在F2和F2-EGF中花了60天从P0 P1和大约125天通过P2。这些媒体因此估计不是用于oMSC文化。生长曲线从F2-S-EGF透露一个扁平的形状两个四个捐助者,扩散后下降通道3的地方。重要的是,年代和EGF F2介质的倍增时间减少31.9±14.3(F2-S)或(F2-EGF),但这两个因素的结合的倍增时间大大减少。所有F10文化媒体推广的快速扩散oMSC平均倍增时间约2天。细胞培养的F10媒体、年代和EGF的倍增时间减少来(F10-S)(F10-EGF),但结合显示增加一倍时间(F10-S-EGF)。

3.3。表面抗原表达

我们观察到大的变化从捐赠者捐赠在通道1(图3(一个)),从完全负面的高度积极的价值观(CD105, F2-S-EGF: 0 - 70%)。(图的热图3 (b))显示了表面抗原决定基表达五个段落。CD44一直检测到在每一个媒介,虽然F10媒体更高的学位。CD45总体较低,但相反,在F10-S-EGF更加减少。MSC的表达相关的表面抗原表位CD73, CD90、CD105在F2媒体增加。EGF的差别导致了对这些标记。然而,是差别结合年代,对这些减速。F10的媒体的年代有一个更加突出的差别影响对这些表面标记,而EGF对这些标记就几乎没有影响。有趣的是,添加EGF的差别导致了对这些所有的标记,在F2和F10媒体。此外,热图表明的年代F10媒体导致总体减少检测的CD45和hMSC标记CD73 CD90、CD105。CD45特别高的介质F2,所有抗原表位似乎比其他媒体表达了向更高水平发展。 The addition of EGF and S reduced the expression of CD45 and CD166 in both, F2 and F10 media. F10 media showed overall lower expression of CD73, CD90, and CD105. Remarkably, the result did not change much with ongoing passages, especially for measurement of CD29, CD44, and CD166.

3.4。分化在F10 F2-S-EGF媒介

作为干细胞具有分化能力,我们测试的反应后oMSC preculture F2-S-EGF和F10媒体成骨的脂肪形成的,chondrogenic刺激。分化是化验根据hMSC出版协议和oMSC(表2)。

3.4.1。成骨分化oMSC

图4总结了成骨分化的结果。oMSC precultured F2-S-EGF和F10媒体均显示分化成成骨的血统至少三个捐助者之一。细胞捐赠1没有显示任何分化的协议,但著名的聚合物的形成。供体细胞2能够区分对成骨细胞使用协议1或协议2,当precultured F2-S-EGF中但不是当precultured F10的媒介。相反,供体3可以成功地分化成成骨的血统与协议1两,preculture F2-S-EGF中、F10的媒介。因此,成骨分化的变化是影响捐赠者变化,协议相关的变化和preculture依赖变化。

3.4.2。脂肪形成的分化oMSC

脂肪形成的分化oMSC是使用两种不同的协议(表执行3)和两个preculture条件(F2-S-EGF介质和F10介质)。调查oMSC的脂肪形成的命运时,脂质小滴的存在在所有控制培养条件(协议1和2,F10和F2-S-EGF preculture)是明显的(图5)。没有优秀的脂滴的形成通过差异化文化协议1或2后,当oMSC precultured F10介质。然而,preculture F2-S-EGF导致显著的脂滴形成三个捐助者,当使用协议2脂肪形成的分化(图5)。与成骨分化,因为每个捐赠者有区别的使用协议,我们没有检测到供体不同脂肪形成的分化,但一个强大的媒介依赖分化。

3.4.3。Chondrogenic分化oMSC

成骨的和脂肪形成的分化后,我们沿着两个不同的协议(表4)诱导chondrogenic oMSC分化。Chondrogenic分化是由使用TGF -3(1)协议或TGF -1结合BMP-7(方案2)。图6总结了oMSC chondrogenic分化的结果。当球相当大当细胞在F10 precultured介质和诱导后协议2细胞precultured F2-S-EGF中并通过协议1显示更有效的分化,诱导的颗粒形态和细胞结构。2控制条件没有颗粒可以在获得文化,表明颗粒的整体鲁棒性较低。自发分化也观察到在所有三个捐助者的控制,当precultured F2-S-EGF媒介。再一次,我们发现oMSC的分化依赖于捐赠,协议的依赖和preculture依赖。

4所示。讨论

最近,发表了许多研究采用羊从骨髓干细胞,称为绵羊的间充质干细胞(oMSC) [19- - - - - -21,23,33,41,42]。由于没有同意扩张(不同文化媒体)和描述oMSC(不同分化协议和表面抗原决定基分析),我们调查了培养条件的变化对扩散的影响,表面抗原表位与MSC分化,和表达。

oMSC文化媒体不同的成分导致形态差异,如前所述hMSC和其他细胞类型(43- - - - - -45]。然而,目前还不清楚这些形态变化以及相关功能或细胞分化的潜能。

最快的集落形成和扩散中观察到包含10% FCS的媒体。增加扩散取决于FCS的内容已经被描述为MSC人类和其他物种的起源,以及许多其他细胞类型(46- - - - - -49),突显出血清增长的媒体内容的重要性。添加EGF或年代(mcdb - 201、地塞米松、L-ascorbic酸和ITS-plus)单独导致减少倍增时间为高和低血清含量媒体,而EGF和S的结合导致了媒体更降低了F2倍增时间。在F10,没有进一步降低的倍增时间可以通过这些因素的结合。它被描述为hMSC增殖率显著增强了文化与某些生长因子如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子(FGF),或platelet-derived-growth-factor——(PDGF - BB) (47,50,51]。然而,添加EGF低血清含量介质导致nonfeasible文化oMSC P0, P1超过65天。oMSC能够扩散结合其他补充剂,和倍增时间显著降低介质相比,含有2% FCS孤单。因此,不是只有一个,但有几个因素协同工作的快或慢oMSC扩散。

F2-EGF介质的平均表达最表面的抗原表位的最低水平,而在F2中以最高速度(图3(一个))。这个上下文表明生长因子发挥关键作用的表达式或抑郁表面抗原表位与干细胞有关。hMSC,可溶性EGF可以触发ERK和Akt / PKB的信号,从而导致表面蛋白的磷酸化,激活的表皮生长因子受体(47]。oMSC EGF和表面标记萧条之间的联系仍然需要阐明,尤其是当考虑到外国物种起源在这项研究中使用的EGF(缺乏绵羊生长因子)。人类生长因子和胎牛血清的适当性文化的绵羊的细胞可能是值得讨论的。虽然有研究采用羊自体血清oMSC文化(17),我们的研究旨在比较与标准组件在细胞培养中常用的媒体。当然可能有不同的应对自体生长因子;然而,我们的研究结果添加到基本知识oMSC行为在不同的培养基。自反抗体不一定和绵羊的交叉反应细胞,使用反抗体,虽然经常应用于先前的研究[19- - - - - -21,23),是一个不完美的方法,进一步强调需要建立oMSC表征表面标记。

有趣的是,表面抗原决定基概要文件并没有改变显著和持续的段落。这也为hMSC之前被证明52]。然而,hMSC失去潜在的分化与通道5 - 6,因此一般表面标记追究MSC可能不是与分化,尤其是在一些类型的成熟细胞如成纤维细胞表现出相同的MSC标记集(52]。

CD45的高表达可能在F2媒体表明隔离cocultured细胞如巨噬细胞的差异经常被污染MSC文化(30.,53),这取决于媒体成分(FCS)浓度。

综上所述,表面标记表达式的分析显示显著差异取决于FCS内容,媒体补充添加生长因子,donor-dependent差异。

如前所述,有大的变化表征oMSC协议。表面标记表达式,Rentsch等人报道积极的免疫荧光染色CD9、CD44、CD54, CD73, CD90、CD105, CD166以及成功trilineage分化与上述协议2。以前的细胞培养介质中,类似于我们的F10。然而,我们的研究结果只做部分同意那些通过Rentsch et al .,关于CD73的积极表现,CD90、CD105,我们在研究中发现不一致。这一事实可能是由于不同的表面标记检测,以及不同应用抗体(物种特异性没有提到)。

流式细胞术结果马克卡迪等人也描述oMSC高度CD44阳性和存在,但与Rentsch et al .,为反CD90和CD105是负的,这与我们的结果一致。在相同的研究中,对扩散通过EGF刺激影响oMSC也证实,描述更加突出比媒体FCS仅为10%。自发的脂肪形成的分化或大型捐赠者变化没有在这些研究描述。

虽然我们没有观察到一个决定性影响分化,增加生长因子oMSC文化应该仔细考虑,作为测试的测量表面标记组减少了EGF之外。否则,10%没有EGF的FCS内容导致显著减少的倍增时间和retainment大部分表面标记的表达,但它并没有促进脂肪形成的差异化在我们的研究中。相当大的变化在FCS内容和添加补充或生长因子也通常hMSC文化。然而,标准化的协议来测量表面抗原表位和执行分化成骨、脂肪形成的,和chondrogenic血统(31日]。

考虑到各种来源的影响,很可能从羊身上oMSC骨髓的文化条件可能会影响他们的反应化学,物理化学,甚至地形因素在组织工程方法。分离抗体的绑定到特定的表面抗原表位是例行公事地实现一些孤立的细胞类型(造血干细胞、鼠标MSC)。我们建议oMSC,捐赠者的变化会影响预选的表面抗原表位(23CD44与存在相结合等)将被执行,因为这些标记通常为oMSC[高度积极的报道19- - - - - -21,23]。尽管整体强劲的CD44的表达,仍然没有标准应该oMSC表达的表面抗原表位。研究调查的multipotency oMSC不同表面抗原表位的选择,甚至测试相同的抗原表位导致不同的结果(反标记是积极和消极取决于研究)(17,19- - - - - -21,23]。

而对于hMSC,表面抗原决定基表达生长因子补充文化没有影响他们的区分能力(47];这种情况下仍然需要为oMSC澄清。虽然已经表明oMSC还能transdifferentiate与神经元细胞表型,这一目标只有通过变量成功(18]。此外,在相同的研究中,大型捐赠差异报告。一起自发分化观察到在我们的研究中,可能的multipotency oMSC可能不是在最近接受了细胞培养条件下稳定。此外,唯一的选择因素oMSC呈塑料遵守形态。因此,不同祖阶段可能会被孤立,被培养基诱导或noninducible [3,54]。它已经被描述为hMSC”细胞在这种文化差异明显,有些人祖属性和多功能分化能力,而其他人则缺乏这种能力,就像通常所说的成纤维细胞”(3]。我们在这里提出一个类似的异质性oMSC文化。

5。结论

这项研究增加了几个以前的研究证明了扩张的选择媒体的影响不仅对经济增长特征,而且表面抗原决定基表型分化潜力的MSC (55]。我们这里这些特征对oMSC相比,文化扩张媒体不同FCS内容后,EGF和/或其他补充。oMSC行为和表型是依赖于捐赠,preculture媒介,差异化协议。因此,我们得出这样的结论:oMSC文化的条件也会影响oMSC人口的构成,因此oMSC-based组织工程策略的结果。因此,标准oMSC文化条件和最低标准的描述,类似于意见书由霍维茨et al。29日和Dominici et al。30.),是必修课。下一步应关注消除协议,当使用介质的变化得到可重复的结果oMSC组织工程研究使用羊作为大型动物模型。

利益冲突

作者指出任何潜在的利益冲突。

承认

这项工作是由开始启动研究项目,德国亚琛工业。

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