脂联素缺乏症缓解低氧诱导的动员和循环血管生成细胞的归航

文摘

目的。我们研究了脂联素的影响缺乏循环血管生成细胞(CAC)动员、自导,新血管形成在急性心肌梗死(AMI)的设置。方法与结果。AMI是野生型诱导(WT) (和脂联素基因敲除Adipoq^−−/)小鼠()。AMI的一个星期后,骨髓(BM)浓度和本来的动员⁺和林⁻本来就⁺祖细胞(pc)明显减弱Adipoq^−−/条件,如评估通过流式细胞术。HIF-1-dependent mRNA表达的趋化因子,如Cxcl12(),Ccl5(),和血管粘附分子,如Icam1(),Vcam1(),梗死边界区域的显著降低Adipoq^−−/老鼠。组织学检查Adipoq^−−/老鼠可以减少梗死边界区(新血管形成能力)。总的来说,毛细血管密度呈正相关,本来⁺在BM电脑数字()和外周血(PB) ()和自导因素的表达Cxcl12(),Icam1(),Vcam1()。结论。脂联素缺陷降低了BM储备和动员能力,机电衰减低氧诱导趋化因子和血管粘附分子的表达,和新血管形成能力受损AMI后一个星期。

1。介绍

心血管疾病(CVD)是一个工业化国家的疾病和死亡的主要原因(1]。此外,心血管疾病的发病率增加主要是由于全球流行的肥胖(2),与肥胖相关的并发症,如糖尿病(3]。因此,脂肪组织的病理生理作用的化学汽相淀积最近得到了太多的关注。

脂肪组织是现在被认为是一个重要的内分泌器官4),分泌大量激素,adipocytokines,肥胖的代谢并发症(最重要的事件5]。一个特定adipocytokine,脂联素,据报道除了提供心血管保护有益对胰岛素敏感性的影响。脂联素的一些机制,发挥其antiatherogenic和消炎作用,综述了通过Goldstein et al。6)和相关的减少活性氧簇(ROS)的产生,衰减的促炎细胞因子的水平,如肿瘤坏死因子α,激活内皮一氧化氮合酶(以挪士)。

临床上,脂联素与空腹血糖和胰岛素水平呈负相关,减少2型糖尿病患者和冠状动脉疾病7]。尽管高脂联素浓度通常与良好的心血管疾病风险相关,脂联素的值作为心血管疾病的发展或进展的预后危险因素目前仍不清楚。例如,hypoadiponectinemia与早发性冠心病男性(8脂联素水平较高,已发现表明心肌抢救AMI后(9]。然而,其他研究小组报道,高脂联素水平与20年增加心血管疾病和全因死亡率10),不稳定性心绞痛患者的全因死亡率为冠状动脉造影(11),或慢性心脏衰竭患者的心血管事件12]。这些矛盾的发现脂联素的价值值得进一步调查一般CVD风险分层。

然而,脂联素的影响在体外细胞培养和在活的有机体内基因敲除研究更简单。在缺血再灌注(IR)损伤,脂联素的缺乏导致了更大的管理信息系统,增加心肌细胞凋亡和更高程度的炎症13]。这些效应可以抵消Adipoq^−−/大鼠的脂联素补充(13,14),另外减毒在WT小鼠心肌梗死后的心脏重构。脂联素也被报道促进血管生长在体外和在活的有机体内(15,16),抑制肿瘤坏死因子α全身的核转录因子κB (NFκB)信号(17,抑制内皮细胞凋亡的upregulation磷酸化5′活化蛋白激酶(p-AMPK) [18]。有趣的是,adiponectin-induced改善内皮细胞的增殖和迁移是类似于观察血管内皮生长因子(VEGF) [15]。从力学上看,脂联素激活AMPK / PI3 K / AKT /以挪士途径,导致upregulation磷酸化以挪士,进而增加生产(14,19]。

因为以挪士也扮演着重要的角色在CAC生物学(20.脂联素的影响差别),我们假设对这些CAC动员和MI后外围归航。柴田等人已经报道数量减少的本来⁺KDR⁺设置循环机电的下肢缺血(HLI)Adipoq^−−/老鼠(21),进一步发现循环脂联素和CD34⁺细胞水平相关的心肌梗死患者(9]。

在目前的研究中,我们已经确定的影响脂联素基因敲除的动员机电在AMI的设置。其次,我们已经检查了趋化因子和粘附分子的表达变化,涉及ischemia-directed机电的归航。总之,我们提供了新的证据,脂联素的缺乏导致机电的动员和导航能力减弱,导致减少新血管形成能力。临床上,这些影响可能转化为心肌疤痕扩展,损伤的心肌功能,更高程度的心肌重构。

2。方法

2.1。动物

国家和欧洲实验动物保健原则。所有动物实验程序批准的动物保健和使用委员会大学的安特卫普(许可证编号2008 - 03)。WT C57BL / 6Adipoq^−−/小鼠删除外显子2(翻译起始密码子)脂联素基因(B6.129 -应变的名字Adipoq^tm1Chan/ J) (22]从杰克逊实验室购买(巴尔港、主要、钙、美国)。对所有实验中,老鼠被安置在单独的通风笼(IVC系统)在无菌条件下,在一个正常的昼夜周期(12/12)免费的食物和水。所有的老鼠实验中使用4 - 5个月大的孩子。

2.2。心肌梗死小鼠模型和样本收集

MI被结扎诱导(小伙子)冠状动脉左前降枝的WT (),Adipoq^−−/(老鼠)。总之,小鼠麻醉(三溴乙醇0.25毫克/克,腹腔内),使用22 g静脉导管气管插管,机械通风和一个小的啮齿动物呼吸机(MiniVent 845型,哈佛装置,通风10点μL / g, H。180次/分钟,2厘米₂O呼气末正压通气)。左胸骨旁的胸廓切开术进行横切肋骨4和5。经过充分暴露的心脏,心包裂解,小伙子的结扎约2毫米低于左心房附件使用以聚丙烯缝线(Pronova BV-1, Ethicon,强生(Johnson & Johnson)。成功的小伙子结扎证明了白变色的心肌,海拔梗死心电图ST段的监测、和视觉识别的结扎动脉梗死区。与控制老鼠sham-operated (),也就是说,没有收紧童子结扎。随后,手术伤口关闭层;从通风小鼠断奶,气管切开,把热源下,直到完全康复。血液和组织样本进行在AMI后1周,按照HLI实验的柴田et al。21]。小鼠麻醉和血液样本是由直接腔内穿刺肝素涂层管。标本的梗死边界区收获,在液态氮被迅速冻结,并存储在−80°C,供以后使用。同样,在sham-operated老鼠,相应的左心室壁自由noninfarcted组织标本被收集并存储。的心脏,1毫米低于结扎,在多聚甲醛固定(4%)和嵌入在石蜡(PFPE),直到组织学分析。BM被冲洗都收获股骨与无菌磷酸盐缓冲盐水到肝素板管。

2.3。超声心动图

经胸廓的超声心动图(AplioXV 13兆赫线性探针,东芝)进行麻醉老鼠就在AMI的感应,在AMI后第七天,分别。左心室收缩末期(LVESD)和舒张末期(LVEDD)直径和前和后壁厚度测量midpapillary肌肉水平。部分缩短计算((LVEDD−LVESD) / LVEDD)×100。

2.4。组织均匀化,RNA提取和质量、互补脱氧核糖核酸的合成

组织与一个均质OmniTH组织均质器(梅特勒-托利多)。RNA分离使用RNeasy minifibrous组织工具包(试剂盒)后,制造商的指示。列DNAse治疗(试剂盒)被用来去除污染DNA的剩饭剩菜。RNA浓度和纯度进行了分析使用Nanodrop分光光度计读数(Nanodrop技术)在260年和280海里。RNA的完整性评估使用安捷伦2100生物分析仪(安捷伦科技)。互补DNA(互补)被transcriptor合成第一链cDNA合成装备(罗氏)根据制造商的说明和使用随机六聚体和益生元的组合(dT)逆转录引物。逆转录在55°C进行了30分钟,其次是5分钟的孵化85°C逆转录酶酶的灭活。互补脱氧核糖核酸样本放置在冰和储存在−20°C到进一步使用。

2.5。qPCR

Taqman基因表达分析(应用生物系统公司)是用于qPCR分析LightCycler 480仪器(罗氏)。所有的引物(见表S1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2013/260156基因内区生成)的设计。qPCR都使用了LightCycler Taqman大师混合(罗氏)最后一个反应20卷μl我们使用geNorm算法(23)以确定一个最优组合的参考基因内部规范化(例如,产生Hprt,Tpt1,真沸点)。的KO状态的控制Adipoq^−−/老鼠是由qPCR使用特定引物检测的缺陷Adipoq基因(WT正向引物:5′-TGGATGCTGCCATGTTCCCAT-3′;WT反向引物:5′-CTTGTGTCTGTGTCTAG GCCTT-3′;Adipoq^−−/反向引物:5′-CTCCAGACTGCCTTGGGA-3′)。所有qPCR反应进行了如下:在95°C初始denaturation-activation一步后10分钟,放大由45个周期95°C的变性10年代,退火60°C 30年代和荧光测量1 s的72°C。周期数测量使用baseline-independent二阶导数最大的方法。归一化相关基因表达是决定的方法。分析效率测量连续稀释的cDNA集中样本的基于标准稀释曲线的斜率。

2.6。组织学和免疫组织化学分析

PFPE组织形态学分析被用于梗塞大小(hematoxylin-eosin染色)和毛细血管密度的分析。为此,5 -μ米厚的部分染色过夜了兔子anti-mouse单克隆抗体(Abcam ab56299) anti-CD31和随后共轭二次驴anti-rabbit biotin-conjugated抗体(杰克逊ImmunoResearch实验室)和三级链霉亲和素HRP-conjugated抗体(正)。信号显示3、3′-diaminobenzidine (DAB) tetrahydrochloride色原系统(DAKO)。捕获的图像蔡司Axiophot显微镜配备一个奥林巴斯DP70相机和Adobe Photoshop创造合成图像进一步处理。的形态学分析测量左心室和MI周长midpapillary层面进行综合使用显微图像图像分析软件。

2.7。流式细胞术

BM是悬浮在PBS与肝素、过滤40μ米尼龙网(正)。白细胞浓度的大英博物馆悬挂和全铅样品测定使用血细胞计数器(60微指令,Horiba ABX)。10⁶白细胞在1毫升清洗液(用PBS补充南BSA为0.5%和0.05%₃与鼠)和preincubated anti-mouse货代拦截器(CD16 / CD32) (BD Pharmingen) 10分钟。以后,细胞进一步孵化在黑暗中30分钟在室温下使用下面的抗体:APC-conjugated鼠标血统(林)鸡尾酒(BD Pharmingen)和PE-conjugated anti-mouse干细胞antigen-1(本来)(BD Pharmingen)。红血球细胞溶解在ammoniumchloride缓冲区(干细胞技术)10分钟,紧随其后的是两个5分钟清洗步骤。5×10⁵事件数与FACSCantoII流式细胞分析仪系统(正)。清白的,fluorescence-minus-one (FMO)控制被用来确定自发荧光背景信号和允许适当的积极事件的控制。向前散射/侧散射(FSC / SSC)情节用于门单核细胞群。细胞聚集和细胞碎片被禁止FSC-height / FSC-area散点图。

2.8。统计分析

统计分析了PASW统计18 (IBM公司)。在GraphPad Prizm创建图表。表格数据表示为±SEM。除非另有规定,非参数测试(Mann-Whitney以及和克鲁斯卡尔-沃利斯检验比较两个或两个以上的团体和斯皮尔曼等级相关系数的相关性分析,因为nonnormality resp)使用的数据子集。一个双边值< 0.05显示统计学意义。

3所示。结果

3.1。基线特征

总的来说,我们观察到大梗死灶AMI后一周Adipoq^−−/相比WT老鼠(分别为61.5%和49.4%,分别地。)(补充图S1)和心脏衰竭的迹象(HW / TL 9.5和8.6,分别地)和减少LV功能超声心动图(部分缩短28.2%和35.0%,分别地。)Adipoq^−−/相比WT老鼠。不幸的是,由于小样本大小和高差异,这些差异没有达到统计学意义(表1)。基线WT骗局和形态学和超声心动图特征Adipoq^−−/虚假的老鼠可比(数据没有显示)。

3.2。脂联素基因敲除对电脑的影响数

我们使用flowcytometry确定本来的数量⁺和林⁻本来就⁺电脑在BM和PB AMI后一周。在Adipoq^−−/老鼠,BM-residing本来⁺和林⁻本来就⁺电脑数量在WT老鼠相比明显下降(;、职责)。PB-mobilized循环本来就⁺电脑被减少Adipoq^−−/老鼠(林)和一个类似的趋势是明显的⁻本来就⁺分数()。此外,在本来的比例减少⁺电脑在PB BM相比Adipoq^−−/老鼠(),建议动员adiponectin-deficient条件下缺陷,除了绝对减少可用的BM PC池(图1)。减少类似PC数PB和BM就是明证Adipoq^−−/AMI后被发现的Adipoq^−−/虚假的老鼠(数据未显示)。

3.3。脂联素基因敲除对CAC归航的影响

研究脂联素的影响,缺乏对外围CAC的MI的设置,我们确定几个低氧诱导的基因表达趋化因子和粘附分子与CAC贩卖。信使rna水平的Ccl5和Cxcl12被发现显著下调MI边境地带Adipoq^−−/老鼠相比WT (;、职责)。此外,两个整合素配体的mRNA表达涉及ischemia-directed祖细胞归巢,Icam1(),Vcam1(),减毒的MI边界区Adipoq^−−/老鼠(图2)。这减少趋化因子的表达和血管粘附分子MI边界区Adipoq^−−/老鼠可以表明动员和自导赤字BM-residing pc或机电,分别。信使rna的WT骗局和水平Adipoq^−−/虚假的老鼠相比,除了hif1a,高Adipoq^−−/虚假的集团(数据未显示)。

从力学上看,我们观察到几个强正相关性在归航因素的表达模式,以挪士和Hif1a在心肌梗死边界区。有趣的是,这些协会只有WT小鼠中发现,在观察之间的正相关关系以挪士和调节亚基的表达PI3 K (Pik3r1)(),以挪士,Hif1a(),以挪士和自导因素位于下游HIF-1,如Cxcl12(),Icam1()。此外,在WT老鼠,Cxcl12感应的upregulation有关Hif1a(),Icam1(),Vcam1()和Pik3r1()。相反,没有发现显著的相关性Adipoq^−−/老鼠。虽然我们的数据没有显示显著减少平均水平以挪士或Hif1aWT与表达Adipoq^−−/老鼠(图3),前面提到的关联似乎表明PI3 K / AKT /以挪士途径和HIF-1 hypoxia-signaling通路coregulated WT但不是Adipoq^−−/AMI后的老鼠。

3.4。脂联素基因敲除对AMI后新血管形成的影响

MI的毛细血管密度边界区增加超过两倍WT老鼠相比Adipoq^−−/老鼠(),指向一个新血管形成赤字adiponectin-deficient条件(图4)。总的来说,增加毛细血管密度呈正相关,本来⁺在BM电脑数字()和PB (),水平mRNA的归航的因素Cxcl12(),Icam1(),Vcam1(),这可能表明CAC动员之间的密切关系,自导,AMI后新血管形成。相反,毛细血管密度与梗塞重建参数的负相关,如胫骨length-corrected心脏重量()。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们调查的影响脂联素在CAC动员、外围自导信号,并在AMI的设置新血管形成。AMI后一周,Adipoq^−−/老鼠显示减少BM-residing和循环血管生成细胞的数量,恰巧与趋化因子的表达下调基因表达Cxcl12和Ccl5,血管粘附分子Icam1和Vcam1。BM储备减少,动员和导航能力机电可以减少新血管形成能力的重要因素,脂联素不足条件下观察。

的动员BM-derived机电进入流通主要是由低氧诱导生长因子和细胞因子(24]。在条件与氧张力下降,α亚基的低氧诱导因子1,HIF-1α,是调节在mRNA和蛋白水平(25并把原子核,促进血管生成和血管重建通过增强的表达多个proangiogenic因素,如CXCL12 [26),胎盘生长因子(27),VEGF (28]。主要趋化因子CXCL12被认为是参与ischemia-directed CAC动员和归航,发生沿(逆转)BM-to-PB CXCL12梯度(29日]。在微血管内皮,CXCL12激活PI3 K / AKT /以挪士信号通路,从而导致磷酸化以挪士和随之而来的生产(30.]。以挪士被报道对于CAC动员从大英博物馆31日,32upregulation]的基质金属蛋白酶9 (MMP9) [33]。

我们的研究结果证实可用的低池在大英博物馆和减少动员机电机电Adipoq^−−/条件。类似的结果在CAC BM储备和动员报告的柴田et al。21在HLI的设置。我们建议这些效应是由于以挪士的有缺陷的激活,从而衰减CAC生物学。陈等人。19)已经表明,脂联素可以刺激生产的在体外文化的内皮细胞,这一过程被证明是依赖AMPK。脂联素在人类脐静脉内皮细胞,进一步诱导AMPK磷酸化,这刺激了一种蛋白激酶的磷酸化PI3 K-dependent方式。反过来,磷酸化激酶的磷酸化以挪士,将以挪士转化为活性形式(15]。这些研究表明存在adiponectin-induced AMPK / PI3 K / AKT /以挪士信号通路。在这方面,陶等。14)证实,减少在该地区存在磷酸化以挪士心脏组织获得红外受伤的风险Adipoq^−−/老鼠。

没有事实证明刺激HIF-1信号在很多方面。首先,抑制环鸟苷酸(cGMP)降解的5型磷酸二酯酶(PDE5抑制剂西地那非、伐地那非)导致HIF-1增加α表达和增强血流恢复,毛细血管的形成,和祖动员HLI小鼠模型。因为没有激活鸟苷酸环化酶,酶负责cGMP生产,没有水平能对HIF-1有直接影响α。研究结果证实了这一假设HLI模型以挪士^−−/老鼠,以挪士不足导致前面提到的废除毛细管形成和HIF-1 PDE5抑制剂的影响α蛋白表达(34]。这些作者建议以挪士/不必不可少的cGMP-induced血管生成和upregulation缺氧缺血组织的信号。第二个机制以挪士,没有加强HIF-1活动在于防止HIF-1的退化α亚基通过抑制prolyl羟化酶(博士),HIF-1的标记αpolyubiquitination和随后的蛋白酶体降解,这一过程发生在常氧条件下迅速(35]。第三,两个博士抑制(36)和PI3 K / AKT信号途径的激活(37)已报告刺激NF的活动κB信号。NFκB已被证明是一个关键的转录激活HIF-1α(38),表示高度的相声和炎症之间的重叠和低氧诱导的基因表达程序。

我们的研究显示数之间的正相关性以挪士,Hif1aWT,下游归航的表达因素条件。有趣的是,我们的数据没有证据的相关性Adipoq^−−/老鼠。此外,几个归航因子的基因表达和血管粘附分子表达下调Adipoq^−−/老鼠。这一发现很有趣因为脂联素也早些时候报道抑制ICAM1和VCAM1表达式在体外(39通过抑制肿瘤坏死因子)α全身的NFκB信号(17]。然而,这些研究没有调查的具体情况组织缺血但只有报道脂联素在肿瘤坏死因子的影响α全身的炎症在内皮细胞培养。定在缺氧条件下脂联素对内皮细胞的影响还有待进一步研究确定。

总之,我们报告一个毛细血管密度下降Adipoq^−−/老鼠WT老鼠相比,恰逢减少BM-residing和循环血管生成细胞的数量在归航的表达差别和对这些因素。针对脂联素代谢可以临床相关提高缺氧信号和CAC的缺血性条件。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是支持的研究Foundation-Flanders (FWO),批准号G014906。b . Everaert支持研究的博士奖学金Foundation-Flanders (FWO)。作者要感谢的努力d Vindevogel在编辑文章。

补充材料

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