严重缺氧的影响骨髓间充质干细胞分化的潜能

文摘

背景。间充质干细胞(msc)的利益和他们的应用程序在细胞疗法导致更好的理解这些细胞的基本生物学。最近缺氧被表示为完整的软骨形成的关键。我们旨在分析骨髓msc (BM-MSCs)分化能力在常氧和严重的低氧培养条件。方法。msc是流式细胞术和向脂肪细胞分化,在常氧或严重缺氧条件下成骨细胞和软骨细胞。求同存异是证实比较每个处理点与控制点的细胞在DMEM和胎牛血清的边后卫。结果。BM-MSCs从捐赠者显示只有少数表型差异表面抗原表达。分析标记基因表达水平的细胞治疗相比,他们的每个血统控制点显示良好的分化在常氧条件下,这种分化能力的缺失严重缺氧的文化。结论。在我们的实验条件,严重缺氧的影响在体外分化BM-MSCs的潜力。脂肪形成的、成骨的chondrogenic分化缺席在严重缺氧条件。我们的工作表明,严重缺氧减缓了细胞分化的分子机制以来的表达减少脂肪细胞,成骨细胞,观察和chondrocyte-specific基因。

1。介绍

间充质干细胞(msc)是多功能细胞,可以扩大体外和诱导在体外或在活的有机体内,晚期分化成多个血统1- - - - - -5]。这些细胞位于骨髓(BM),血管周围脂肪,皮肤,肌肉,和其他组织,他们的存在导致这些组织的修复能力。不同组织来源的msc可以有生物的区别。这样,来自骨髓msc显示更高的成骨分化潜力(6),而msc滑膜起源更倾向chondrogenic分化(7]。此外,在相同的文化条件下的分化,msc孤立于滑膜显示更多chondrogenic潜力比来源于骨髓,骨膜、骨骼肌、脂肪组织(8]。

最近使用自体或同种异体的干细胞被认为是另一种治疗方法治疗软骨缺损的9),这些细胞代表一个有前途的资源为不同的组织工程和细胞治疗(10]。利益在msc及其可能的应用程序在细胞疗法导致更好的理解这些细胞的基本生物学。成骨不全症等疾病的临床试验阶段,移植物抗宿主病、心肌梗死已初见成效,演示的安全使用同种异体和自体的细胞(11- - - - - -13]。特别是,在过去几年,研究人员专注于氧张力在msc和分化的影响。BM是为数不多的器官,维持体内缺氧状态(14]。缺氧在开发过程中起着重要的作用,细胞分化15]。低氧培养条件的影响进行了分析,以提高msc产量和减少细胞扩张时间比标准协议(16]。缺氧条件下促进chondrogenic软骨分化,提高蛋白质合成的upregulation Sox9、II型胶原蛋白,aggrecan [17,18]。关于骨生成和脂肪生成,可能有争议的研究,由于不同的细胞缺氧时间曝光。都有所改善(19和减少20.)的分化能力对这些血统的报告。

在这项研究中,我们证实了细胞用于实验msc基于组合的三个最小的细胞治疗标准国际社会提出的2006年(21]。此外,我们分析了脂肪形成的、成骨的chondrogenic分化引起的商业媒体在常氧和严重的低氧环境。分化经组织学、免疫组织化学和定量实时PCR技术(qPCR)。

2。材料和方法

2.1。隔离和msc的文化

大英博物馆样本用于分离msc (BM-MSCs)从三个患者(平均年龄:64年,范围:55 - 82岁)接受全髋关节置换术。捐赠者没有选择;样品到达实验室时提交处理。本研究机构审查委员会批准和知情同意是获得所有科目的学习。

孤立的BM标准培养条件下细胞培养(湿大气有限公司为5%₂),在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM), 20%的胎牛血清(的边后卫),和1%的青霉素和链霉素(P / S)(所有从Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),直到90%汇合的。Preplating 15分钟前两章节消除文化中的任何剩余成纤维细胞(22]。

细胞培养和扩大,直到开始分化实验。在这一点上,当细胞达到90%的融合,他们使胰蛋白酶化,水洗,并提交分化表型分析和实验。

2.2。使用流式细胞仪表型特征

在第三段,文化扩张后,细胞使胰蛋白酶化,水洗,并通过流式细胞术分析。短暂,人类BM-derived细胞被胰蛋白酶化收获,洗,离心机在300 g 8分钟。细胞流式细胞术之前,计算和总计被转移到fluorescence-activated细胞排序(流式细胞仪)聚丙烯管(NUNC VWR国际、丹麦)。补充表1中列出的抗体被用于这些实验网上(见补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2013/232896)。确定最优数量的单克隆抗体(mab)并将其添加到每个管40分钟在4°C的黑暗。大多数抗体是共轭与异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)和特征的标记与间质和造血相关的血统。必要时,细胞被孵化30分钟在4°C在黑暗中一个次要FITC-conjugated抗体允许绑定主要抗体。控制管的色原使用含有等量的同形像的标准。最少25000每测定细胞事件被收购FACsCalibur流式细胞分析仪(BD生物科学,马德里,西班牙)。数据分析使用CellQuest软件(BD生物科学),结果被表示为积极的百分比。

2.3。Multipotential表征

流式细胞术的时候,向三个不同的细胞分化谱系(脂肪细胞,成骨细胞和软骨细胞)。分化实验在常氧和严重的低氧条件下进行。“常氧条件”一词是用来表示标准文化条件对应于湿润大气O为21%₂。“严重缺氧条件”一词是用来表示文化条件对应于一个大气的1%₂。每个分化诱导的培养条件中描述下面的段落。

2.4。脂肪形成的分化

在第三段BM-MSCs分离使用trypsin-EDTA (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),播种细胞/厘米²在室幻灯片(BD猎鹰、法国),并在生长培养基培养,直到融合。脂肪生成被诱导培养3周在hMSC商业脂肪形成的分化培养基(Lonza, Biowhittaker,比利时),遵循制造商的指示。每个分化点与控制点对应于细胞在DMEM培养同一段时间20%的边后卫。证实了分化染色技术和基因表达定量使用实时PCR (qPCR)。

2.5。成骨分化

使用trypsin-EDTA BM-MSCs在第三通道分离,播种细胞/厘米²室滑动,直到融合生长培养基中培养。骨是由文化三个星期在hMSC商业成骨分化培养基(Lonza, Biowhittaker,比利时)。这种培养基是改变每3 - 4天。每个分化点与控制点与细胞培养为同一段时间DMEM和20%的边后卫。分化是通过组织学和qPCR技术评估。

2.6。Chondrogenic分化

软骨形成评估使用研究形成((细胞)技术23),做了一些调整。BM-derived细胞第三通道分离使用trypsin-EDTA和离心机在300克10分钟。由此产生的颗粒是在hMSC商业Chondrogenic分化培养基培养(Lonza, Biowhittaker,比利时)2周。培养基是改变每3 - 4天。每个分化点与细胞培养为同一段时间DMEM和20%的边后卫。14天后,细胞聚集是嵌入在10月Tissue-Tek化合物(樱花Finetek)和冻结。透明的存在cartilage-characteristic分子,如II型胶原和蛋白聚糖,由组织学检测,免疫组织化学和qPCR技术如下所述。

2.7。组织学分析

脂肪形成评价,证实了分化检测胞质脂滴油红O染色后细胞固定在4%多聚甲醛。

骨生成评价,分析了分化茜素红染色后细胞固定在4%多聚甲醛,评估钙沉积的存在。

对软骨形成评价,4μ米冻结的部分骨料被苏木精和伊红染色(他),马森的三色的(MT)、甲苯胺蓝(TB),阿尔新蓝(AB),和红色染料O (SaO)蛋白聚糖和胶原蛋白。

2.8。免疫组织化学分析

对软骨形成评价,4μ米厚的冰冻切片与初级孵化抗体检测的存在类型I (Abcam,剑桥,英国)和II (Neomarker,巴塞罗那,西班牙)胶原蛋白,与多克隆抗体检测aggrecan C-20(圣克鲁斯生物技术、海德堡、德国)(补充表2)。过氧化物酶/民建联ChemMate DAKO设想检测设备(DAKO,巴塞罗那,西班牙)是用来确定抗原抗体相互作用。负染法控制通过省略主单克隆抗体。使用光学显微镜样本可视化。

2.9。RNA提取

隔离的总RNA在细胞培养使用试剂盒完成试剂(表达载体,巴塞罗那,西班牙),遵循制造商的协议。RNA是评估数量在260 nm使用NanoDrop分光光度计(热科学,马德里,西班牙)。A260 / A280比率计算评估质量和纯度。对于每一个样本,1μg总RNA的rt - pcr进一步加工或储存在−80°C到使用。

2.10。互补脱氧核糖核酸的合成

逆转录之前,总RNA进行了DNase消化(Fermentas、西班牙)完全删除的DNA污染。随后,从1执行反转录反应μ使用上标第一链g总RNA的合成系统rt - pcr(表达载体、西班牙),遵循制造商的指示。简单地说,1μ0.5 g的总RNAμg益生元d (T)混合核苷酸的0.5毫米,3μL DEPC-treated水变性在65°C 5分钟和冷冻冰至少1分钟。然后,2μL 10 x RT缓冲区,MgCl 5毫米₂0.01米,德勤,40 U RNaseOUT重组核糖核酸酶抑制剂喜忧参半,通过离心收集,孵化42°C 2分钟。孵化后,50 U(上标RT添加和孵化42°C 50分钟和15分钟的70°C Thermocycler (Amp基因PCR系统9700、应用生物系统公司、西班牙)。最后,样本在冰上冷却和孵化2 U的核糖核酸酶H 20分钟37°C在继续下一步之前。

样本储存在−前20°C的放大目标的互补。积极的和消极的控制被包含在每一个实验。RNA提取,一分析设置和postreverse一产品分析进行了预防crosscontamination在单独的专用房间。

2.11。定量实时一结论分析(存在)

实时PCR分析使用引物见表1LightCycler 480仪器(罗氏,曼海姆,德国)。

由10个PCR反应μ0.25 L的主混合2 x集中,μ每个正向和反向引物的M,互补dna模板,PCR-grade水最后20卷μ96 L 480多井LightCycler板。多井板装载480年LightCycler仪器直到PCR程序开始。

最初的酶激活在95°C 10分钟之后,50周期目标放大由三个连续的步骤:95°C 10秒钟(s), 5 s的61°C, 72°C 7 s。放大后,融化曲线分析和最终冷却步骤是应用于20年代40°C。

单一放大和预期的大小每个PCR产品验证。用2%琼脂糖凝胶电泳、染色SYBR安全DNA凝胶染色(表达载体),所有PCR产品显示一个乐队single-amplified对应的产品预测的PCR融化曲线分析。

PCR引物的位置跨越exon-intron边界,减少检测基因组DNA的风险。引物是购买的罗氏公司(德国曼海姆)。TATA框结合蛋白基因(真沸点)被用来作为内部控制看家基因规范化的目标的互补。

数据分析是使用LightCycler执行480年相对量化软件(罗氏)。表达式计算的相对水平方法(24]。每个试验完成至少一式三份,包括marker-positive和marker-negative控制和控制试剂没有模板。每个数据对管家基因规范化并与相应的控制点的细胞在DMEM 20%的边后卫。对于每一个基因的表达,我们分配值1的最低水平的表达,和其他值测量的相对表达水平(REL)。

2.12。DNA测序分析

至少一个PCR产品来自每个实时PCR实验被用来作为模板DNA,以验证放大的特异性扩增子。PCR产品是由一个酶的纯化方法(ExoSAP-IT、Amersham生物科学、西班牙)。DNA测序进行ABI 3130 xl(应用生物系统公司、西班牙)音序器使用BigDye结束符(应用生物系统公司、西班牙)。正向和反向使用特定的引物是相同的(表用于qPCR实验1)。

2.13。其他的程序

用于操作程序中描述的核酸是那些分子克隆:实验室手册由Sambrook et al。25]。

2.14。统计分析

每个实验至少重复三次。平均值之间的差异的统计显著性是决定使用双尾以及;被认为是显著的。结果表示为平均值±标准偏差(平均数±标准差)。

3所示。结果

3.1。隔离BM-MSCs人口

纺锤状双极细胞附着在瓶第一媒介在48小时内观察到的文化。我们扩大,分化,并分析细胞的表面抗原表达和multipotentiality孤立的从三个捐助者。

3.2。文化表征BM-MSCs扩大

3.2.1之上。表型分析

在第三段的开始分化实验,使用流式细胞仪的细胞特征。选择描述BM-MSCs人口使用的抗体。简单地说,我们用CD34、CD45标记的造血干/祖细胞;SSEA-4 Stro-1,胚胎干细胞的标记;CD90、CD73 CD105、CD29、CD44、CD106, CD166标记间充质干细胞/基质细胞。

图1显示表面标记表达式的一个捐助者。三个捐赠者的细胞表面标记的显示非常相似的表情。每一个抗原表达值表示为积极的百分比。这样,CD73和CD44抗原coexpressed为94%。CD105表达仅在61%和coexpressed CD106为24%。另一方面,存在表达为92%。的百分比CD90、CD29 SSEA-4表达式分别为95%,94%,和83%,分别。三个捐赠者的细胞为阴性Stro-1, CD45和CD34的表达。

3.2.2。脂肪形成的分化

经过21天的文化与适当的分化培养基或20%的边后卫控制点,细胞被沾油红O脂滴评估脂肪形成的分化(图2(一个))。所有的控制结果为阴性染色,显示缺乏脂滴。细胞在分化培养基生长在常氧条件下积极染色,表明分化,而细胞生长分化培养基中严重缺氧条件没有染色,表明显著降低分化。

来证实这些结果,我们从细胞中提取总RNA以同样的方式对待,retrotranscribed 1μg的总RNA,它通过qPCR(图分析2 (b))。我们测量了LPL的表达水平,FABP4, APM1标记基因脂肪形成的分化。在每次实验中,每个基因表达水平的细胞治疗分化培养基相比,细胞在DMEM培养20%的边后卫(控制点)。在常氧条件下,细胞表现出更高水平的LPL治疗,FABP4, APM1表达式与控制点(972.13、48934.74和1247.03倍,分别地)和统计学意义()。在严重低氧条件下,治疗的细胞分化中没能诱导分化,LPL和基因表达水平,FABP4, APM1分别为1.92,0.14和3.64倍的控制点。这些结果证实了组织学染色。

3.2.3。成骨分化

经过21天的文化与分化培养基或控制20%的边后卫,钙沉积的细胞与茜素红染色(图3(一个))。控制染色呈阴性。细胞在分化培养基生长在常氧条件下积极染色,显示钙沉积和差异化的存在,而细胞生长分化培养基中严重缺氧条件没有染色,表明显著降低分化。

来证实这些结果,我们从细胞中提取总RNA分化在相同条件下,retrotranscribed 1μg的总RNA,它通过qPCR(图分析3 (b))。在每次实验中,每个基因表达水平的细胞治疗与适当的分化培养基相比,细胞在DMEM培养的边后卫(控制点)为20%。我们测量了高山和OP成骨分化的基因的表达水平。三个人口能够表现出成骨细胞分化的特定基因。在常氧条件下,高山和OP表达水平,分别为19.14倍和12.13倍的控制点,差异具有统计学意义(),而在严重缺氧条件下高山和OP的表达水平,分别控制的1.73和1.13倍。

3.2.4。Chondrogenic分化

经过14天的文化与分化培养基或20%的边后卫控制,分析了聚合物通过组织化学使用苏木精伊红(他),马森的三色的(MT)、甲苯胺蓝(TB),阿尔新蓝(AB),和红色染料O (SaO)染色和免疫组织化学aggrecan I型和II型胶原蛋白。这些技术证实chondrogenic在常氧条件和缺乏差异化严重缺氧条件。如图4可以看到,胶原和蛋白聚糖的存在只有在常氧气氛。免疫组织化学结果aggrecan (gg)和Col1 -(数据未显示)。

来证实这些结果,我们从细胞中提取总RNA分化在相同条件下,retrotranscribed 1μg的总RNA,它通过qPCR(图分析5)。我们测量了Sox9的表达水平,gg, Col1A1, Col2A1 chondrogenic分化标记基因。在每次实验中,每个细胞的基因表达水平处理的分化培养基相比,细胞在DMEM培养的边后卫(控制点)为20%。在常氧条件下(图5),治疗细胞表现出更高水平的Sox9, gg, Col1A1表达式与控制点(6.87、25.58和17.47倍,分别地)和统计学意义()。在严重低氧条件(图5),的表达Sox9, gg和Col1A1基因分别为0.65,3.31和5.36倍的控制点。Col2A1基因在常氧条件下只发现在细胞治疗Cp值31(媒体的三个捐助者)。这些结果也证实了染色。

4所示。讨论

干细胞组织工程和修缮的医学代表一个有吸引力的来源(13]。很少是关于具备干细胞调节的机制,自我更新,msc的成熟。组织环境因素的重要性,如氧张力,在诱导MSC分化之前研究[26- - - - - -28]。此外,该研究从西蒙和基思29日)显示,氧气是干细胞生物学的监管者。

传统的在体外细胞培养往往环境氧浓度下进行相应的21%(定义为“常氧”)。然而,生理氧气压力较低,不同组织组织在1%和13%之间(30.]。因此21%的氧张力作为常氧条件超过氧气的分压在大多数哺乳动物组织,表明氧浓度在标准在体外主要的文化人类细胞通常是不适应在活的有机体内情况(31日]。骨髓干细胞一般培养O的21%₂,但阿宝₂在骨髓是低得多,在1%和7%之间(32]。这表明骨骨髓来源的细胞缺氧的使用在体外像他们的自然生理环境条件。阿宝的数学模型₂人类骨髓表明梯度分布在相对氧化鼻窦的骨髓,而缺氧骨内膜的地区(33]。众所周知,高pO₂可能有毒,导致氧化应激,由于一代的活性氧(ROS)可以破坏DNA,蛋白质和脂质(34]。因此电子转移到氧气过剩导致的有害氧化邻分子(35]。因此缺氧可能会降低细胞内活性氧的生产和积累导致增加代谢效率(34]。这样,培养的msc在缺氧条件下模拟这些细胞的自然微环境,是一个重要的先决条件来研究细胞增殖、分化、衰老、代谢平衡,和其他生理过程(34]。此外,研究BM-MSCs分化的事实的存在低氧浓度可能理解的缺乏相关修复过程发生严重缺氧等情况严重的血管缺血,发生在动脉粥样硬化和糖尿病患者和患者的炎性疾病如关节炎。

参加低啊₂紧张的BM在活的有机体内,我们研究的能力BM-MSCs向脂肪细胞分化,成骨细胞和软骨细胞比较严重缺氧和常氧条件。来驱动他们的分化,我们从三个不同的细胞治疗孤立捐助者与商业媒介。在所有的实验中,在常氧条件下细胞向脂肪形成的三个捐助者能够区分,chondrogenic和成骨的血统。然而,当分化疗法进行了在严重缺氧条件下,相同的细胞从捐赠者无法区分。严重的缺氧环境抑制完全BM-MSCs three-lineage分化潜能。缺乏分化能力在缺氧被认为与组织学和免疫组织化学分析。此外,qPCR每个血统的标记基因分析证实了这些结果。时我们看到的upregulation基因分析分型进行了normoxia和损失的感应下严重缺氧。严重缺氧的方式减缓了细胞分化的分子机制;实际上我们看到的表达减少脂肪细胞,成骨细胞和chondrocyte-specific基因。 Moreover, our MSCs were isolated from osteoarthritic (OA) patients. Therefore, this inhibition of cell differentiation may explain the lack of repair processes that occur with severe hypoxia in patients with inflammatory conditions such as osteoarthritis. Moreover, it is possible that MSCs from OA donors show different在体外分化潜力比脱离正常的捐助者。通过这种方式,不仅不同氧气紧张局势的影响,也孤立BM-MSCs起源的可能影响在体外分化能力。

在过去的几年,一些论文集中在缺氧的影响不同组织和不同物种的干细胞分离(36- - - - - -38]。低氧浓度对细胞生长的影响也被研究等几个作者不同的细胞模型鼠骨髓来源间充质干细胞、小鼠成纤维细胞,分别为(39,40]。在这方面,D 'Ippolito et al。41)表明,低氧浓度(1、3、5,10% O₂)增加细胞增殖,细胞中获得最大的区别啊,保持在3%₂。此外,低阿宝₂抑制成骨细胞的分化,表明低氧张力(pO₂)似乎是一个关键的细胞培养条件维持msc分化状态。他们显示lineage-specific分化的干细胞可能会增强,当这些细胞暴露于更高的阿宝₂,表明氧浓度调节msc的自我更新和分化之间的平衡。在其他作品中,Holzwarth et al。31日评估,减少氧张力O(1到3%₂)严重受损脂肪形成的人类msc和成骨分化重组。此外,Malladi et al。42]表明,骨和软骨形成的脂肪间充质细胞被抑制了在体外2%低氧培养条件(O₂)。所有这些数据都同意斯科菲尔德提出的“利基”模式(43],干细胞或更多的原始细胞发育在大英博物馆坐落在一个特定区域的特点是一个独特的微环境,低pO₂,有助于维持干细胞自我更新的无限的潜力,也就是说,没有分化增殖。相同的低pO的积极影响₂具备干细胞维持也被证明在其他类型的干细胞(44,45]。

相比之下,其他团体报道积极减少氧气紧张对msc可塑性的影响(20.,46]。例如,列侬et al。39)报道,大鼠骨髓基质细胞显示增加细胞外矿化文化保持在低pO₂与常氧条件。同时,在一些在体外研究,已发现低氧浓度来刺激分化过程,诱导细胞向成骨、脂肪形成的,或chondrogenic血统(47,48]。在这方面,王et al。49)报道,脂肪间充质细胞培养在5% O₂海藻酸和悬浮在珠子显示增长和减少chondrogenic分化的增加。此外,知更鸟et al。27阿宝]表明,低₂能促进chondrocytic间充质干细胞分化。这些互相矛盾的数据可以解释,涉及各种各样的物种类型的文化设计(这将改变氧梯度的类型的细胞接触),不同的培养条件(如生长因子补充媒体),分化的方法应用,阿宝₂选择,时间点进行了研究。通过这种方式,格雷森等。19]报道增加脂肪形成的文化和成骨分化在长期3 d骨骨髓来源间充质干细胞在缺氧。与我们的工作和我们的结果相比,在格雷森的实验19]细胞从骨髓中分离都是扩大和分化在缺氧条件下三维体系结构。在我们的工作,我们应用严重缺氧条件只在分化实验,和3 d文化系统只应用在chondrogenic分化。

从文献已知,几个分子途径参与细胞代谢改变下缺氧(50]。msc具有新陈代谢的灵活性和缺氧条件下能够存活34,51]。缺氧稳定低氧诱导因子- 1α(HIF-1α)。HIF-1α是一种转录因子,激活40多个基因和扮演着重要的角色在各种细胞和系统稳态响应缺氧(50]。这种转录因子会使线粒体耗氧量(52)和移植的关键标记干细胞像Oct-4 Rex-1, SSEA4 [41]。我们假设HIF-1之间的关系α、细胞增殖和干细胞标记可以解释我们的结果并没有严重的缺氧条件下的分化。此外,一些论文支持这一假设[16,53,54]。在这方面,Carrancio et al。16)报道,低氧培养条件与标准协议显示改善msc产量和减少细胞扩张时间。同时,吴建et al。54]分析了老鼠的基因表达BM-MSCs缺氧和观察到的基因的upregulation发展,细胞增殖和细胞生存。最后,多斯桑托斯et al。53)报道,缺氧促进细胞增殖和扩张。在扩散过程中,大多数的细胞进行细胞分裂,无法开始分化过程中的细胞机制。因此低pO的使用₂水平增加在体外生存或自我更新人类的间充质干细胞是干细胞研究的一个重要的改进,可以获得大量的关键细胞治疗的目的。

总之,我们已经表明,严重缺氧条件下能够废除BM-MSCs在应用时的分化能力在体外定向分化。我们的工作表明,严重缺氧减缓了细胞分化的分子机制以来的表达减少脂肪细胞,成骨细胞,观察和chondrocyte-specific基因。

信息披露

作者宣称没有利益冲突的存在。

作者的贡献

所有作者都参与这项研究提出和批准最终的论文。

确认

本研究支持由Servizo Galego de Saude Xunta德加利西亚(PS07/84) Catedra Bioiberica de la大学da和西班牙后防线de Salud卡洛斯三世cib BBN cb06 - 01 - 0040, Ministerio Ciencia e Innovacion ple2009 - 0144和洋底Investigacion Sanitaria-PI 08/2028的资金参与菲德尔(欧洲共同体);塔玛拉Hermida-Gomez合同的受益人从洋底de Investigacion疗养地(2008),西班牙。艾玛Muinos-Lopez风湿病学西班牙语的基础上,支持西班牙。作者要感谢p Filgueira和m·j·桑切斯的技术援助。

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