文摘
再生疗法持有一种很有前途的和令人兴奋的未来的治疗无法治愈的疾病,和间充质干细胞在这种方法的前沿。然而,相对有效性和不同类型的间充质干细胞的作用机制仍不完全清楚。我们旨在评估的影响人类脂肪——(hASC)和(hBMSCs)和脂肪干细胞从骨髓干细胞的媒体(ACM)在一个cardiomyoblasts的可行性在体外缺血再灌注(ir)模型。流仪可行性分析显示,两个细胞治疗导致同样的活细胞比例的增加,而与ACM的治疗并不(ir模型:%;hASC:%;hBMSC:%;ACM:%)。代谢活动测量(ir模型:;hASC:;hBMSC:;ACM:;任意单位)和乳酸脱氢酶测定(ir模型:;hASC:;hBMSC:;ACM:;任意单位)证实了流量仪结果同时也表明轻微的ACM产生的有利影响。我们的结果强调,间充质干细胞具有相同的功效,当直接使用在缺血后细胞,并在临床前和临床调查发现它们之间的差异,而与其他可能的原因,如免疫调节或血管生成属性。
1。介绍
再生疗法代表一个相对较新的可能性治疗疾病的功能组织在哪里迷路了。这种方法旨在恢复器官功能通过提高居民干细胞群与添加或替换受损组织细胞。各种细胞类型(胚胎诱导多功能和成人干细胞细胞用于这一目标各有各自的伦理、肿瘤、免疫(优缺点1- - - - - -4从临床试验),但数据大多可以从成人干细胞,即从骨髓干细胞(bmsc)和脂肪中提取干细胞(对asc) [5]。脂肪干细胞最近成为一个有吸引力的自体成人干细胞池,因为相对容易收获的病人通过微创吸脂(6,7]。这些细胞的使用展示出了有前景的结果,有时成功在不同的情况下,比如在关节软骨再生(8),肌肉骨骼组织修复(9- - - - - -11),和治疗慢性,无法愈合的伤口12]。考虑心血管应用,一些报告显示一致的和显著受益于细胞移植后心肌梗死在活的有机体内动物模型(13- - - - - -19]。不过,临床试验使用成人干细胞疗法在急性心肌梗塞显示重大但只有适度的改进(20.- - - - - -22],相对有效性的不同类型的间充质干细胞仍不完全理解(23,24]。等人发现,在这方面,梅佐慢性梗塞的脂肪细胞的移植提供了一个更好的左心室心脏功能,减少纤维化,血管生成增加相比,从骨髓干细胞(25]。最近,拉斯穆森等人证实这些数据使用hypoxically预先处理这些脂肪,从骨髓干细胞从同一个病人26]。因此,看起来脂肪干细胞是优于其他间充质干细胞来源。然而,没有提供任何信息在这些论文这些细胞在缺血后细胞的直接影响。此外,这些细胞的确切的作用机制还不清楚。初步研究强调细胞融合和分化的作用最重要的潜在机制的行动(27,28),但后来的研究质疑它们的重要性在有利影响29日,30.]。兴趣,因此,向旁分泌因子涉及proangiogenic切换,凋亡和抗炎通路(31日- - - - - -34]。不同的旁分泌作用的重要性还强调了改进实验模型中发现了这一事实,尽管非常有限的生存供者细胞受损组织的敌对环境(35,36]。因此,在本研究旨在评估直接影响人类的脂肪,从骨髓干细胞在缺血再灌注的一个简化的模型。此外,我们想研究间充质干细胞是否有直接对缺血后细胞旁分泌作用。
2。方法
2.1。细胞系和条件媒体
H9c2鼠cardiomyoblast细胞株是购自写明ATCC (Wesel,德国)。细胞培养在high-glucose (4.5 g / L)包含10%胎牛血清的DMEM, 4毫米谷酰胺,100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司2。细胞培养媒体每周更换2次,和细胞融合通道一旦他们达到70 - 80%。
人类脂肪干细胞(hASCs)从抽脂分离样品的健康女性捐赠者22-50岁(年,知情同意后)进行选择性整容抽脂。隔离的hASCs抽脂样品根据既定协议执行37,38]。短暂,lipoaspirates洗广泛与磷酸缓冲盐(PBS)然后孵化0.075%胶原酶在37°C 30分钟。酶活性中和使用杜尔贝科的修改鹰的介质(DMEM;Gibco /表达载体,卡尔斯巴德、钙、美国)补充heat-inactivated 10%胎牛血清(FCS), 100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素(所有Gibco /表达载体),和100 U /毫升制霉菌素(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。样本在1500转离心10分钟,和由此产生的细胞颗粒镀在75厘米2文化的玻璃瓶(Sarstedt Inc .)、牛顿、数控、美国)。细胞培养在37°C湿润有限公司5%2的气氛。不依从细胞24小时后删除。细胞生长在抗真菌的培养基为7天,培养基是改变每2到3天。那个时期后,hASCs培养在血糖过低(1.0 g / L)包含10%胎牛血清的DMEM, 4毫米谷酰胺,100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司2。细胞培养媒体每周更换2次,和细胞融合通道一旦他们达到70 - 80%。低温贮藏进行hASCs实验前,和复苏的细胞用于实验。通道1细胞使胰蛋白酶化和离心10分钟的1500 rpm。细胞颗粒在CryoSafe resuspended介质(德国)C . C . pro GmbH·诺,整除,cryotubes (Nalge Nunc,鲁开德那样,丹麦)为1毫升样品和存储40分钟25°C,然后转移到−−80°C 24小时之后,最后在液氮冷冻保存。人类脂肪干细胞具有间充质(CD90、CD105和干细胞抗原1(本来)CD59同系物)和造血(CD34、CD45)标记流式细胞术,以证实他们的血统。
人类从骨髓干细胞(hBMSCs)隔绝来自年轻患者的样本(2 - 20岁)在标准整形外科手术病人的知情同意或他们的父母通过伦理委员会设定的道德指导原则匈牙利医学研究委员会。所有程序都是Semmelweis大学的伦理委员会批准。只有这样组织使用,否则会被丢弃。骨髓冲进T75烧瓶和稀释血压得到较好的控制血糖过低(1.0 g / L) DMEM培养基含有10% FCS, 100 U /毫升青霉素,100μ谷酰胺g / mL链霉素和4毫米。烧瓶孵化在37°C完全湿润大气中5%的股份有限公司2和95%的空气3天。潜伏期后,hBMSCs坚持烧瓶和其余组件的表面与PBS骨髓都被洗涤。使用hBMSCs hASCs在相同条件下培养。人类从骨髓干细胞具有间充质(CD73, CD90、CD105和存在)和造血(CD34、CD45)标记流式细胞术,以证实他们的血统。描述进行细胞培养标准培养条件下,生长层,而显示常数细胞增殖率在整个文化时期。
准备的媒体(ACM)脂肪中提取干细胞被使用,因为他们的扩散能力远比hBMSCs可能可以帮助实现最高浓度的旁分泌分子在中在给定的时间内(39]。对asc人类被播种在10.000细胞/厘米2在100毫米培养皿使用8毫升血糖过低(1.0 g / L) DMEM培养基含有10% FCS, 100 U /毫升青霉素,100μ谷酰胺g / mL链霉素和4毫米。菜是孵化在37°C完全湿润大气中5%的股份有限公司2和95%的空气和颗粒收集上层的进一步实验使用48小时后。
2.2。在体外缺血再灌注模型
模拟缺血再灌注在体外通过氧气和葡萄糖剥夺我们早些时候出版物(如前所述40- - - - - -42]。短暂,30.000 / H9c2细胞12-well盘子被孵化glucose-free DMEM O的氛围中0.5%2和99.5% N2为160分钟。这个过程是建立孵化系统上执行(PeCon, Erbach-Bach,德国)。孵化后,细胞reoxygenated和葡萄糖是由媒体用新鲜的直接替代high-glucose DMEM,和细胞保存在标准的细胞培养条件直到进一步的实验操作。代表荧光显微镜照片被送往遵循细胞生存能力在模型使用蔡司LSM 510元(卡尔蔡司,耶拿,德国)。我们使用calcein-AM(例/ em: 494/517 nm,表达载体,卡尔斯巴德,CA,美国)和ethidium homodimer-2(例/ em: 536/624 nm,表达载体,卡尔斯巴德,CA,美国)标签标记生活/死细胞。增加了间充质干细胞与Vybrant做染色(例/ em: 644/665 nm,表达载体,卡尔斯巴德,CA,美国)(图1(一))。
(一)
(b)
(c)
2.3。试验协议
四个实验组,每组调查中缺血后细胞收到:(1)正常培养基(I-R-model);(2)hASC条件培养液(ACM);(3)hASCs;和(4)一组收到hBMSCs。Cell-treated组被给予20.000细胞复氧后30分钟,和增加的细胞被贴上Vybrant膜荧光染料,使缺血后的分化细胞(图1 (b))。细胞cocultivated 24小时在标准细胞培养条件。年底的ACM组模拟缺血,glucose-free介质改为同样体积的hASC游离的媒体(图1 (c))。
2.4。细胞生存能力与流式细胞仪测量
24小时后再氧化,细胞被胰蛋白酶化,并在500年resuspended收获μ包含5 L PBS calcein-AM和350 nM ethidium-homodimer-2流仪分析(43]。控制准备如下:现场控制细胞培养在标准条件;死控制细胞接受100毫米H2O21小时前胰蛋白酶化。测量,FACSCalibur流式细胞分析仪(美国新泽西州,正欲富兰克林湖)使用和黄鼠狼的数据分析程序(沃尔特和伊莱扎大厅研究所,Parkville,维克,澳大利亚)。使用流式细胞仪,我们可以区分治疗细胞缺血后细胞的基础上做标记,而这些细胞被封闭的或适合进一步分析。
2.5。代谢活动测量
评估组织的代谢活动,我们使用了PrestoBlue细胞生存能力试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA),根据制造商的指示。由于相对较低的细胞实验中使用的数字,我们选择了一个24小时的孵化时间37°C和测量吸光度指示。
hASC和hBMSC团体排除了干细胞的影响新陈代谢,我们减去20.000干细胞的代谢活动价值的测量值。结果比较的代谢活动30.000 H9c2细胞培养标准细胞培养条件(控制)。
2.6。乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性试验
测量使用LDH进行细胞毒性工具包II (PromoCell、海德堡、德国)根据制造商的指示,30分钟的潜伏期和吸光度测量在490海里。LDH的测量,前面描述的实验组织缺血再灌注24小时后使用。LDH酶水平决定的上层清液30.000 H9c2细胞培养在标准条件(控制)。的吸光度结果归一化总细胞数在每个样本。
2.7。统计数据
统计分析的数据进行了单向方差分析与Newman-Keuls多重比较事后测试或未配对以及适当的。所有的数据表示为。一个< 0.05被认为是具有统计学意义的价值。
3所示。结果
3.1。描述hASCs hBMSCs
通过流式细胞仪分析细胞表面标记表明hASCs(图2(一个))积极为间充质基质细胞(干细胞)标记CD90、CD105以及干细胞抗原1(本来)CD59同系物- lymphohaematopoetic CD34、CD45标记。流式细胞术分析培养从骨髓干细胞(图2 (b))表现出缺乏造血(CD34标记−、CD45−),但揭示了间充质干细胞谱系特定的细胞表面标记(CD73+,CD90+CD105,+,存在+)。对细胞表面标记表达式,我们的研究发现与先前的报道是一致的44,45]。
(一)
(b)
3.2。流仪可行性分析
我们的实验结果对缺血后细胞显示,没有任何活细胞达到治疗% 24小时后。然而,生活的百分比cardiomyoblasts 24小时后与hASC既显著增加(%)和hBMSC (%)治疗但不是的ACM (%)。cell-treated组之间没有显著差异。Cell-treatments导致显著增加的活细胞比例与ACM治疗(图3(一个))。
(一)
(b)
(c)
(d)
死细胞的百分比的ir模型组%,而这是小得多的hASC和hBMSC治疗组(hASC:%;hBMSC:%),但是没有统计学上不同的ACM治疗组(ACM:%)。hASC之间没有显著差异,hBMSC-treated组(图3 (b))。
将添加细胞方面考虑,我们发现大部分的干细胞还活着在hASC-treated集团(%)和hBMSC-treated集团(%),两组之间没有统计上的显著差异(图3 (c))。此外,没有发现差异考虑到死亡的细胞群(hASC:%,hBMSC:%;图3 (d))。
3.3。代谢活动测量
使用PrestoBlue比色测定,我们加强了早些时候的发现与流动仪分析。细胞的减少能力反映了他们的生存能力明显高于治疗后与hASCs (盟,任意单位)和hBMSCs (AU)相比,ir模型(非盟)。此外,ACM治疗也能增加缺血后细胞的代谢活动(非盟)。没有区别是观察之间的有利影响的两种不同的干细胞系(图4(一))。
(一)
(b)
3.4。乳酸脱氢酶细胞毒性试验
表达的细胞坏死LDH释放相比显著降低ir模型(AU)在缺血后细胞接受hASC和hBMSC (hASC:非盟;hBMSC:非盟)。的媒体只能略微减少LDH水平(非盟)。在hASC和hBMSC治疗的情况下,坏死与控制(图没有明显不同4 (b))。
4所示。讨论
我们报告在这里人类脂肪,从骨髓细胞直接改善缺血后cardiomyoblasts的生存在体外简化的模型。代谢活动测量和评估坏死细胞治疗的有益作用加强。重要的是,在这些没有差别直接影响脂肪之间,从骨髓干细胞。
此外,生活间充质干细胞后24小时的比例是一样的,所以他们的生存属性也可能是相似的。这些现象很重要,因为许多出版物和脂肪中提取干细胞显示一个更好的结果,但是行动的潜在机制还不清楚,而且,据我们所知,这是第一次报告的比较的直接影响成人干细胞的实质细胞受损组织,在一个标准化的情况下生存。拉斯穆森等人表明,脂肪中提取干细胞保存心肌梗死后心脏功能在动物模型,从骨髓干细胞从同一来源没有26]。他们报告说,这两种类型的细胞诱导血管生成。因此,根据最近的一份报告(39),他们认为,它们之间的电位差的差异可以解释衰老细胞的属性。其他人在调查显示脊髓损伤,增加血管生成脂肪细胞比其他细胞间充质来源和大量的VEGF表达,从骨髓干细胞具有相似的迁移特性(46]。脂肪干细胞也发现更有效的对皮肤的伤口移植成纤维细胞迁移和增殖47]。然而,这可能是问题的心肌再生由于增加疤痕形成的可能性。最后,比较研究表明对asc是一个更有前途的来源,因为它更有利的免疫调节作用[48]。
我们已经从我们的数据得出几个结论可能机制的行动,。首先,细胞治疗后LDH水平下降控制水平。这意味着几乎被添加细胞坏死,坏死细胞表明在我们的研究中凋亡细胞。这是有益的凋亡细胞被证明是免疫调节,和一些研究人员认为,当前的主要效应cytotherapy非特异性的,这个凋亡的结果池(36]。然而,它必须意识到这种可能性并不能解释我们的结果对细胞生存能力作为我们的模型是完全还原论者,不包含免疫细胞。第二,条件培养液略有增加代谢活动和减少LDH水平;因此,它有一个antinecrotic效果。这意味着从间充质干细胞旁分泌鸡尾酒释放包含直接对境况不佳的缺血后细胞作用的物质。增强代谢活动可能与略好存活细胞的功能而降低LDH-levels表明缺血后细胞直接从坏死凋亡细胞死亡,因为ACM没有影响细胞的生存能力的流仪测量是按照我们之前的工作是使用了从骨髓中萃取出来的细胞在细胞培养中插入(40]。
在我们的研究中,干细胞的无能的媒体与干细胞治疗增加活细胞数量意味着信息联系尤为重要的直接益处或旁分泌分子的浓度达到不够高的效果。信息接触的重要性的行为治疗增加了细胞在早期研究的突出机理与细胞间的管状细胞之间的连接可能会导致线粒体交换(40,49]。细胞融合是另一个可以coculture研究中观察到的现象,并在某些情况下,它也被观察到在活的有机体内动物研究干细胞移植(30.,50,51]。细胞融合的可能性在我们的模型是解决在我们第一次出版及其频率被发现极低(40]。然而,必须指出的是,细胞融合的程度显示了极高的不同文化之间的差异和检测技术,它不能排除大量的细胞融合是一个在体外工件(28,52,53]。不过,最近的研究表明,尽管低频细胞融合可能产生相关影响干细胞编程或重组在心脏54]。鉴于最近的文学,更有可能的是,通过旁分泌机制介导因素,但干细胞诱导的微环境或接触受伤细胞释放这些有益的必要因素。也有可能在生产条件的媒体的媒体的旁分泌因子的浓度没有达到所需的水平是有效的。难怪,后期的研究开始集中精力实现更高浓度的条件培养基,发现有前景的结果(55]。我们的方法提出了一种可能性,分泌分子有效只有在靠近影响细胞,当地的浓度可以达到一个很高的水平。极有可能,只有直接细胞间接触可以提供必要的距离。有趣的是,这种“microparacrine”机制存在于骨髓干细胞的关系,形成所谓的“骨内膜niche-stem-cell突触”(56]。最后,额外的担忧可能是条件媒体主要作用在血管生成;因此,它在我们的简化的模型应该是无效的(26]。
直接观察到的相对作用机制在活的有机体内设置是难以衡量,但它可能是相当强劲,如果我们认为我们观察到活细胞的数量增加一倍。然而,必须意识到,在我们的实验模型的大多数治疗增加干细胞与幸存下来在活的有机体内情况的大多数注射细胞死亡后不久移植(36]。因此,添加细胞长时间发挥他们的作用。
在这一点上,它可能是有用的考虑一些实验分在我们的研究中。我们的实验模型设计调查急性治疗性干细胞对严重受损细胞的影响给干细胞的潜在影响。出于这个原因,我们模拟缺血的长度设置为一个级别,只有5 - 20%的细胞存活没有任何治疗,它反映了现场条件发现损伤的心肌梗死后的心脏。我们证明了该模型的适用性检测含量严重超标后的氧化应激和细胞坏死模拟缺血再灌注的早期出版(42]。影响在24小时内进行分析,因为我们想要排除潜在的干细胞,分化较长时间发生。
一些限制必须占在考虑我们的研究。在我们的实验中,我们使用H9c2细胞是来自大鼠胚胎心脏组织。显然,这些细胞和人类成年心肌细胞之间有差异,但H9c2细胞经常用于处理再灌注损伤的研究,我们有足够的经验在我们的模型中这些细胞(57- - - - - -59]。此外,我们的目的是分析细胞或媒体对缺血后细胞的直接影响,使用H9c2文化而不是成人心肌细胞细胞培养我们可以避免炎症细胞的可能性将污染的文化和影响结果。不过,记住我们人类细胞用于治疗,但没有参与我们的模型免疫功能这一事实必须没有任何重大影响我们的结果,和人类治疗性细胞广泛用于动物疾病模型的文献[60- - - - - -62年]。同时,在我们的实验中我们使用了一个在体外方法更复杂问题的干细胞治疗心肌梗死模型等所有的缺点和优点。一个在体外细胞培养系统中移植模型无法模拟的三维组织细胞间连接是不同的,它不能反映复杂(如免疫)事件期间和之后发生心肌梗塞。然而,的一个限制在活的有机体内模型在细胞治疗研究是缺乏分离直接影响治疗之间的实质细胞和环境的改变造成的间接影响(例如,失活或减少白细胞的迁移,血管生成,等等)。我们相信,我们的模型是适合我们的研究范围,因为它可以专注于增加的直接影响细胞在缺血后细胞。类似的好处与hASC加强hASCs可以替代治疗中最常用的hBMSCs细胞疗法的新兴领域。皮下脂肪组织是一个有吸引力的来源获取自体间充质干细胞,因为它可以通过抽脂收获轻松执行通常在每年成千上万的人。干细胞的产量每克脂肪组织报道是优于骨髓可以达到每毫升(63年,脂肪组织可以在更高安全收获量。这是重要的干细胞只占一小部分细胞在骨髓和他们的数量和分化能力随着年龄增长负相关(64年]。同样hBMSCs, hASCs被证明能够向成骨的区分,脂肪形成的,肌原性的,chondrogenic血统6,37,64年)和分泌大量的旁分泌因子可以增加血管生成和作为凋亡信号(18,31日]。作为直接影响至少一样好hBMSCs的影响,我们的研究结果加强假设他们构成一个更好、更实用的来源使用成人干细胞疗法。到目前为止,没有证据表明是可用的,但是最近两个第一阶段临床试验已经完成测试的安全性和可行性脂肪间充质干细胞治疗心肌梗死和慢性心肌缺血(阿波罗,NCT00442806;精确,NCT00426868) [65年]。
5。结论
我们的研究结果强调脂肪和从骨髓干细胞治疗可以直接保存受损cardiomyoblasts同样的功效。这些细胞的生存有毒,氧化环境也是相似的。这些结果可能表明如果这些细胞到达损伤部位产生的直接影响将是相似的心肌细胞中观察到的疗效差异在活的有机体内实验和临床试验中可能会涉及到不同的属性在归航,诱导血管生成,纤维母细胞的规定,或免疫调节。
作者的贡献
莫妮卡问题和Zsolt Benkő同样这项工作。
确认
这个工作是由TET-SIN, TAMOP 4.2.2-08/1 / kmr - 2008 - 0004, 09/1 / kmr TAMOP-4.2.1 / B - 2010 - 0001, OTKA 83803, Bolyai奖学金。作者感谢凯碧Vacz她帮助人类从骨髓干细胞的隔离和安娜·Tutino Eleni构,阿伦法卡斯的协助维护细胞系。