生长因子释放明胶水凝胶微球在成年小鼠的大脑增加新的神经元

文摘

最近的研究表明,新的神经元不断产生的内源性神经干细胞subventricular区(SVZ)的成年哺乳动物的大脑。这些新的神经元迁移到受伤的大脑组织和分化成成熟的神经元,表明这种新的神经元可以取代神经元丢失退行性疾病或损伤和改善或修复神经赤字。在这里,我们测试是否提供生长因子通过明胶水凝胶微球将支持SVZ神经发生。胰岛素样生长因子- 1 (igf - 1)含有微球SVZ的新神经元的数量增加。肝细胞生长因子(HGF)含有微球的数量增加新的神经元迁移的SVZ向受伤的中风模型小鼠纹状体。这些结果表明,使用明胶水凝胶微球的策略来实现持续释放的生长因子的前景的临床再生受损脑组织内源性神经干细胞在成人SVZ。

1。介绍

神经干细胞(nsc)驻留在成年动物的大脑,包括人类[1- - - - - -6]。nsc驻留在subventricular区(SVZ)的侧墙侧脑室和subgranular区(SGZ)海马齿状回的产生新的神经元和神经胶质细胞在成年哺乳动物(7- - - - - -11]。SVZ的nsc有可能再生受损神经元和神经胶质在应对各种病理条件12- - - - - -17]。Neuroregenerative疗法使用内源性nsc SVZ的备受期待的新兴战略治疗人类大脑疾病的风险,因为它避免了免疫不相容和收获人类细胞中固有的道德问题,而且可能降低tumorigenesis-which的风险都与移植干细胞相关问题(18,19]。然而,自发再生,发生在大脑受伤的不足为其结构或功能恢复(12,17]。为未来的临床应用,能够调节神经再生中的每一个步骤,包括产生、迁移、分化、生存和功能成熟的新神经元,促进高效再生将发展小说以及可靠的神经细胞自我修复策略的关键(9,20.- - - - - -23]。

不同的蛋白质,包括神经营养因子和旁分泌信号分子,据报道,增强SVZ神经发生的(24]。然而,使用这些因素的一个限制治疗脑部疾病是缺乏适当的运载系统。很难工程师系统管理蛋白质穿过血脑屏障,这样蛋白质在高浓度可引起全身性毒性(25,26]。另一方面,一个当地注入液体药物进入大脑实质可能不会有效地提高神经再生,考虑到有限的体积和持久性物质管理。因此,临床应用安全有效的方法,持续交付neurogenesis-enhancing因素SVZ神经组织必须开发或受伤。

在这里,我们报告,生长因子释放可生物降解的明胶水凝胶微球在成年小鼠的大脑增加新的神经元。明胶水凝胶的凝胶聚合物,可以电与生长因子(27,28]。他们一直使用临床提供生长因子治疗患者的疾病,包括突然的感音神经性听力损失,面神经麻痹和外周动脉疾病(29日- - - - - -32]。在本文中,我们测试了胰岛素样生长因子(IGF)的影响33,34和肝细胞生长因子(HGF) [35- - - - - -37)由明胶水凝胶微球在SVZ神经发生在正常的大脑,然后招聘SVZ-derived新的神经元的大脑受伤的卒中后在一个小鼠模型。

2。材料和方法

2.1。明胶水凝胶的制备

明胶水凝胶微球(MedGel P15;MedGel,大阪,日本),直径在30μm是准备像前面描述的那样27,28]。微球是孵化与磷酸缓冲盐(PBS)(控制)或PBS含有重组人类igf - 1(美国落基山PeproTech;0.25μg)或重组人类胶质瘤(美国落基山PeproTech;0.5μg)在室温下1小时。

2.2。动物

成人(8周)雄性ICR小鼠从SLC(日本静冈县)购买和维护与无限的12小时光/暗周期获得食物和水。要解决过程都是通过实验动物保健和使用委员会名古屋城市大学。

2.3。注入明胶水凝胶

完整的老鼠,3μL明胶水凝胶的暂停或2μL的解决方案没有明胶水凝胶stereotaxically注射使用毛细管微量吸液管(美国德拉蒙德科学公司Broomall PA)的纹状体麻醉8-week-old ICR小鼠在以下位置相对于前囱:前1.0毫米,1.5毫米侧,和3.2毫米深(和3动物没有明胶水凝胶,组织处理和职责)。在MCAO模型中,MCAO后11天,5μL(明胶水凝胶暂停或2μL的解决方案没有明胶水凝胶stereotaxically使用毛细管微量吸液管注入麻醉的纹状体8-week-old ICR小鼠在以下位置相对于前囱:前1.0毫米,2.0毫米侧,和3.2毫米深(和4动物没有明胶水凝胶,组织处理和职责)。手术后,动物被留在一个加热垫,不断监控,直到复苏。7天之后,老鼠被杀,他们的大脑被准备免疫组织化学。

2.4。大脑中动脉闭塞

大脑中动脉闭塞(MCAO)完成使用前面介绍的管腔内的纤维技术(17,38,39]。激光多普勒流量计探头(模型ALF21;进步,日本东京)附着在表面的头骨监控区域脑血流量。涂硅8丝是通过一个切口插入颈内动脉的颈外动脉,然后先进挡住了大脑中动脉(MCA)。MCA闭塞的观察证实了激光多普勒的价值的减少flowmetry约为30%。灯丝被撤回50 - 60分钟后,再灌注证实了激光多普勒flowmetry,切口是随后关闭。明胶水凝胶微球注入MCAO后11天。注射后七天,小鼠死亡,他们的大脑被准备免疫组织化学。

2.5。免疫组织化学和量化

大脑被perfusion-fixed 4%多聚甲醛,后缀相同的固定剂一夜之间,和50μ米部分被切Vibratome切片系统(VT1200S;徕卡,德国海德堡)如前所述17,38,39]。在PBS冲洗三次,部分被孵化了40分钟在屏蔽解决方案(PBS驴血清含10%和0.2% Triton x - 100),然后一夜之间在4°C主要抗体,稀释在相同的解决方案。第二天,部分被孵化2小时在室温下与生物素化的二次抗体(1:500)(美国杰克逊,西树林,PA)或Alexa Fluor-conjugated二级抗体(1:500)(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA),除非另有注明。生物素化的抗体使用Vectastain精英ABC可视化工具包(美国向量实验室,伯林盖姆,CA)和轻拍(diaminobenzidine tetrahydrochloride)。

主要的抗体(最终稀释和源)用于本研究山羊anti-doublecortin (anti-DCX) (1: 100;圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国),兔子anti-Ki67 (1: 200;Novocastra、纽卡斯尔、英国),和鼠标anti-NeuN (1: 100;美国默克密理博,Billerica的)。

激光扫描显微镜,我们使用了一个LSM700显微镜(卡尔蔡司、从、德国)。immunolabeled细胞的量化,彩色细胞图像,使用荧光显微镜,BX51(奥林巴斯、东京、日本),和一个CCD相机,DP71(奥林巴斯)。克莱斯勒的实际数量+细胞数在三个部分:包含注射部位,两个部分的一个600年μ米和1200μm,分别前注射部位。MCAO后大脑的分析,部分包括注射部位和一个额外的5(克莱斯勒)和2 (Ki67)前部分的300μm分开使用。总细胞数估计,计算细胞之和乘以12和6,分别。

2.6。梗死体积评价

大脑部分准备MCAO后(厚度、50μ米)应用了NeuN和民建联使用一个标准的过程可视化。部分包括注射部位的图像和两个额外的前部分的600μm分开使用荧光显微镜被抓获,BX51(奥林巴斯、东京、日本),和一个CCD相机,DP71(奥林巴斯)。

对于这一分析,我们只用小鼠纹状体的观察梗死(NeuN负区)在1毫米SVZ的至少一个部分。的领域缺乏NeuN免疫反应性(梗塞区)和同侧半球的三个部分测量使用Photoshop CS 8.0.1(美国奥多比系统,圣何塞,CA)图像软件。梗塞面积的百分比是由梗塞面积除以每侧半球的鼠标和用于分析梗死体积。

2.7。统计数据

所有数据提出了均值±SEM。对比实验双尾学生的组织进行了分析以及,被视为统计上显著的差异。

3所示。结果与讨论

3.1。研究设计

在这项研究中,我们集中在两个生长因子,igf - 1和HGF,纳入明胶水凝胶,可以缓慢释放蛋白质植入到体内后(27,28];igf - 1和HGF被批准临床应用治疗各种疾病(29日- - - - - -32,40- - - - - -42]。明胶水凝胶微球注入大脑纹状体的正常或接近受伤组织的中风模型(图1)。注射后七天,大脑被固定和克莱斯勒+新神经元的数量比较。

3.2。IGF

igf - 1能促进神经干细胞或祖细胞的增殖以及神经元分化和生存43- - - - - -46]。它有一个中风动物模型的神经保护作用[47]。IGF-1-containing明胶水凝胶微球已在临床试验中用于glucocorticoid-resistant突然的感音神经性听力损失患者的治疗(29日]。然而,它是未知的igf - 1的控释是否使用明胶水凝胶是有用的刺激SVZ神经发生。

我们测试了明胶水凝胶的影响包含igf - 1的数量完整的成年大鼠SVZ新的神经元。首先,我们注入PBS包含igf - 1 (0.25μg)没有水凝胶到纹状体接近SVZ(图2(一个))。七天后,没有显著差异在克莱斯勒+新神经元的数量之间的SVZ IGF-1-injected和PBS-injected控制大脑(图2 (c)PBS:细胞,igf - 1:细胞,每组动物),表明igf - 1注射没有明胶水凝胶没有有效地刺激神经发生在这些实验条件。然后注入PBS gelatin-hydrogel悬挂,有或没有相同数量的igf - 1,纹状体(图2 (b))。七天后,显著增加数量的克莱斯勒+新神经元观察大脑接受IGF-1-containing SVZ的明胶水凝胶相比,对照组(数字2 (b)和2 (c)PBS:细胞,igf - 1:细胞,每组动物)。这些结果表明,明胶水凝胶适用的车辆交付SVZ的igf - 1。此外,这些结果是一致的igf - 1的持续释放明胶水凝胶有效促进igf - 1的行动在神经干细胞或祖细胞的增殖和分化(43- - - - - -46),导致增加SVZ的新神经元的数量。

3.3。HGF

先前的研究表明胶质瘤刺激神经干细胞或祖细胞的增殖在成年人的SVZ,以及新的神经元的迁移和分化48- - - - - -52]。急性成人注射HGF对纹状体神经保护作用,促进神经恢复在中风的小鼠模型53]。局部应用HGF-containing凝胶表面的大脑皮层的数量增加的新纹状体神经元迁移MCAO模型(54]。HGF-containing明胶水凝胶已被用于治疗多种疾病的动物模型包括噪音性听力丧失(55)和胶原诱导关节炎(56]。这些研究强烈建议HGF-containing明胶水凝胶可能有用加强卒中后神经再生。

我们首先测试HGF在PBS的影响,有或没有明胶水凝胶,注入到纹状体,新神经元的数量SVZ的正常成年人的大脑。注射后,七天没有显著差异克莱斯勒+细胞数量的HGF和PBS-control组之间无论使用明胶水凝胶:与明胶水凝胶,动物对待PBS新细胞,这些HGF生成细胞(每组动物);没有明胶水凝胶,动物对待PBS细胞;这些治疗胶质瘤生成细胞(每组动物,以及)。

接下来,我们测试的影响注入相同的物质在MCAO中风诱导的小鼠模型。在这个模型中,SVZ-derived可以找到新的神经元迁移向受伤的纹状体诱导缺血(2 - 3周后17]。因此,我们注射HGF在PBS,有或没有明胶水凝胶,在纹状体MCAO后11天(数字3(一个)和3 (b))。MCAO后18天,我们量化梗死体积和数量的新纹状体神经元。HGF政府并没有影响到梗塞体积,无论使用明胶水凝胶微球:明胶水凝胶,PBS的梗塞体积%,这些治疗胶质瘤的梗塞体积% (每组动物);没有明胶水凝胶,动物对待PBS显示梗塞体积%和那些接受HGF的梗塞体积% (动物,以及)。

HGF没有明胶水凝胶的政府也并不影响克莱斯勒+细胞的数量在纹状体(数字3 (c)和3 (d))。然而,HGF-containing明胶水凝胶的数量显著增加克莱斯勒+细胞迁移在MCAO后纹状体(数字3 (c)和3 (d))。有趣的是,大多数克莱斯勒+细胞扩展一个长期领先的过程向注入明胶水凝胶,这表明这些细胞迁移是横向。因为HGF报道刺激SVZ祖细胞的增殖48),我们还研究了HGF对细胞增殖的影响SVZ MCAO后。没有显著差异的数量Ki67 +增殖细胞HGF和PBS-control组之间,无论使用明胶水凝胶(与明胶水凝胶,PBS:胶质瘤细胞:细胞,分别和5动物;没有明胶水凝胶,PBS:胶质瘤细胞:细胞,每组动物,以及)。这些结果表明,新的神经元数量的增加与胶质瘤治疗引起的受伤的纹状体与明胶水凝胶是由于增加了新的神经元的迁移效率而不是生产在SVZ(图3 (e))。

自HGF的受体,c-Met,表示在成人克莱斯勒+神经元迁移(49)以及GFAP +星形胶质细胞(50),有可能是克莱斯勒+细胞HGF-releasing明胶水凝胶所吸引。也有可能,HGF-induced克莱斯勒+细胞的数量增加纹状体是由血管生成活性(54),因为新的神经元使用血管进行迁移(17,38]。

4所示。结论

使用明胶水凝胶微球的好处这里报道提供生长因子模拟SVZ神经发生的证明明胶水凝胶是一种很有前途的汽车为当地和持续释放药物在大脑中。先前的研究表明,促红细胞生成素的epicortical交付(57]和HGF [54)加强在SVZ神经发生中风的小鼠模型。然而,考虑到大脑表面之间的距离更长,SVZ在人类的大脑,直接注入大脑内部实质需要有效地刺激神经发生从SVZ神经干细胞。当地的交付使用水凝胶的药物会导致较低的总剂量的药物,因此更少的副作用。此外,这种技术应该适用于任何指控蛋白质,可以提高神经再生(58]。还需要进一步的研究来改善明胶水凝胶的注入能力,这将导致一个微创手术。最后,新生成的神经元是如何产生的这种治疗有助于改善神经需要阐明。

作者的贡献

k Nakaguchi和h Jinnou贡献同样这项工作。

确认

作者感谢Hiroshi Funakoshi(旭川市医科大学)和Sawamoto实验室成员的讨论。m·泽田师傅的研究员日本促进社会科学。这项工作是支持的项目实现再生医学(教育部、文化、体育、科技、日本)和资金计划为下一代世界领先的研究人员(日本促进社会科学)。

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