文摘

Sirtuin蛋白1 (SIRT1)是一个可以调节各种生物过程通过脱乙酰酶转录镇压。其活动与神经祖细胞的分化,虽然不知道它的功能在视网膜的发展。所述研究进行评估SIRT1的表达及其固有的抑制剂,DBC1,视网膜组织和祖细胞。我们发现SIRT1和DBC1是广泛表达于小鼠和人类的视网膜,细微的差别在每个蛋白质的亚细胞分布。我们进一步证明nuclear-localized SIRT1只是在人为视网膜祖细胞而不是成人视网膜,这表明这个核本地化可能在视网膜的重要发展。此外,我们观察到细胞质DBC1子集的祖细胞以及成熟的神经节细胞,表明祖细胞子集,主要是由小的细胞,可能代表了一群神经节细胞的前体。总的来说,这项研究中给出的数据提供支持SIRT1和DBC1眼底视网膜生理发展和正常的监管机构。

1。介绍

Sirtuin蛋白1 (SIRT1)是哺乳动物直接同源的酵母Sir2基因,它已被证明在扩展中发挥作用的复制寿命通过镇压基因组不稳定性(1,2]。尽管其分类组蛋白脱乙酰酶,SIRT1有许多非组蛋白的底物,包括p53 [3),NF -B (4),PGC-1(5],FOXO [6]。广泛的研究已经表明,SIRT1在各种生物过程中起着至关重要的作用,包括细胞衰老(7),葡萄糖代谢5],antiapoptosis [3,神经保护8),胰岛素分泌(9),血管生成(10),和神经系统发育11]。

研究表明,SIRT1是高度表达在胚胎发生(12]。的研究Sirt1基因敲除小鼠显示大量的表型与野生型小鼠相比,差异包括心血管缺陷和异常视网膜结构(11]。鉴于SIRT1的目标包括主转录因子和细胞周期调控,也就不足为奇了Sirt1废除或删除会导致严重的表型的后果。尽管出版物SIRT1在视网膜发展支持作用,至少有一项研究报告了反面证据(13]。因此,SIRT1在视网膜发展的潜在作用目前是一个有争议的问题。

Hisahara最近和他的同事证明了SIRT1可能影响神经祖细胞的分化(npc) [14]。SIRT1发现航天飞机从细胞质到细胞核,添加differentiation-inducing刺激后,回到细胞质内6个小时。抑制SIRT1的比率降低neural-to-glial细胞分化后,而过度的SIRT1导致更高的收益率的成熟神经细胞。SIRT1既包含核本地化和核出口信号,其亚细胞分布可能由这些信号可以影响细胞类型,压力,和分子的相互作用15]。

虽然研究已经进行阐明SIRT1在中枢神经系统的作用,对它在视网膜中的作用。更深的理解是否SIRT1影响视网膜发育和分化的祖细胞可能提供有价值的洞察替代方法增加特定的视网膜细胞的收益率的亚种。优化某些亚型的收益率将会直接影响未来的视网膜退行性疾病的细胞替代策略。

删除在乳腺癌1 (DBC1),最初从纯合子地克隆删除地区p21(8)在乳腺癌中,被证明是一个天生的抑制剂SIRT1的两个独立的研究在2008年(16,17]。研究表明机制DBC1直接与SIRT1的相互作用和抑制其活性。因此,评估DBC1的表达与SIRT1可能提供额外的洞察SIRT1生物学。迄今为止,DBC1表达和定位没有调查的眼睛。

本研究的目的是评估SIRT1的表达式及其固有的抑制剂,DBC1,在人类和小鼠视网膜组织和细胞,以阐明这些蛋白质的可能角色管理视网膜的发展。

2。结果

2.1。SIRT1 DBC1表达在人类和老鼠的眼睛

评估SIRT1表达人类视网膜中,我们应用部分从人类各种年龄段的捐助者。此外,我们检查了先天SIRT1的表达抑制剂,DBC1,同样的标本。免疫组织化学结果表明,SIRT1在所有人类视网膜研究专门细胞质(数字1(一)- - - - - -1 (c))和DBC1专门核,除了神经节细胞层(GCL)核和细胞质(数据1 (d)- - - - - -1 (f))。重要的是,所有视网膜标本染色阳性SIRT1在GCL (IPL)内网状层,外网状层(OPL),和感光内在部分,尽管所有标本在GCL DBC1积极,内部核层(INL)和外核层(筒),GCL和INL显示更强的表达比在所有情况下辊筒。

接下来我们试图确定是否SIRT1和DBC1表示在老鼠的视网膜。因此,我们应用各种年龄段的眼睛从老鼠,看看人类视网膜染色模式是一样的。SIRT1,强大的胞质染色的IPL, OPL和感光内段的眼睛(数字2(一个)- - - - - -2 (f))。辊筒一直消极而稀疏的积极性被INL的眼睛()。GCL一直积极的在所有的目光和胞质,两只眼睛显示很弱核染色除了细胞质积极性。核本地化和年龄没有显著的相关性。值得注意的是,P1眼睛只细胞质染色(数字2(一个)- - - - - -2 (b))。

DBC1 GCL核和INL强烈表示,虽然适度表达了在辊筒在所有的眼睛。在所有的目光这种模式是一致的,包括P1老鼠的眼睛。值得注意的是,这也是同样的模式对DBC1人类的眼睛看到。总的来说,这些结果表明,SIRT1 DBC1表达在人类和小鼠视网膜的表达模式是相似的一些细微的差别。

2.2。SIRT1表达小鼠视网膜祖细胞(mrpc)

免疫组织化学老鼠的眼睛展示了广泛的表达SIRT1在所有年龄段的视网膜。因此,我们试图确定是否SIRT1是表示在未分化和分化老鼠视网膜祖细胞。共焦显微镜的应用cytospins mRPC透露无处不在的表达式SIRT1的mRPC neurospheres(数字3(一个)- - - - - -3 (b))。分化细胞文化7天后,SIRT1表达式被评估,主要是胞质(数字3 (c)- - - - - -3 (e))。

以前的在体外研究神经祖细胞观察SIRT1在分化的瞬态穿梭于细胞质细胞核,随后回细胞质(14]。因此,确定相同的瞬态发生在mrpc之间来回穿梭,我们评估SIRT1的亚细胞定位后不同时间点细胞移植到微分媒体。我们的研究结果显示,核穿梭SIRT1没有发生;在细胞质中表达只在所有时间点化验(数据没有显示)。这结果是一致的细胞通过17 9和通道,这表明穿梭中观察到神经祖细胞可能不会发生在老鼠的视网膜祖细胞来源。

2.3。SIRT1和DBC1亚细胞定位在人类视网膜祖细胞(hRPCs)

虽然没有核穿梭SIRT1 mrpc都发现了这一点,我们想进一步测试使用hRPCs这种可能性,尤其是一些差异在SIRT1和DBC1表达式被认为在老鼠和人类视网膜。

第一次观察到我们对这些细胞,他们是异类人群对细胞大小,类似于对mrpc看到。因此,在描述SIRT1疣状,我们也认为是细胞的大小。相对大小在所有情况下都被认为是而不是绝对规模。结果表明,SIRT1表达式可以检测到细胞核和细胞质的hRPCs人口(图4(一))。总结了染色的分布数据4 (c)- - - - - -4 (d)。

基于这样的观察:SIRT1在一些细胞的核本地化,我们选择对表达式求值的DBC1以同样的方式进一步澄清SIRT1在视网膜中的可能作用的发展。像SIRT1, DBC1也发现局部细胞核和细胞质在一些细胞(数字4 (b)- - - - - -4 (c),4 (e))。

3所示。讨论

SIRT1已经成为许多生理和病理过程的关键调节器。兴趣也生长在DBC1 SIRT1的消极监管机构,尤其在癌症文献[18,19]。到目前为止,对SIRT1的角色和DBC1视网膜生理。我们发现这两个蛋白是广泛表达在老鼠和人类视网膜在不同年龄段,包括在开发过程中。

在所有的目光研究,SIRT1是主要胞质,尽管一些核本地化也在小鼠视网膜的一个子集。虽然SIRT1在细胞核的功能描述许多细胞类型,其功能在细胞质中尚不明朗。核SIRT1是与脱乙酰作用相关的转录因子调节细胞周期、凋亡等过程。亚细胞定位的SIRT1可能在视网膜上是动态的,瞬态核本地化时发生视网膜经历压力或在开发过程中。高基准面的细胞质SIRT1允许核穿梭和快速SIRT1-mediated反应在细胞压力。认为压力和其他生理条件会影响到其他地区的SIRT1的亚细胞定位报告(15]。

Tanno等人评估SIRT1的表达在鼠标专门组织和发现它是细胞质,专门核或各组织(细胞质和核20.]。值得注意的是,一些子集的神经元主要表达了SIRT1在细胞质中,类似于我们的发现在视网膜上发现的。虽然没有做过这样的分析对人体组织,似乎SIRT1可能不同的亚细胞定位在组织类型甚至跨在一个特定的组织细胞类型。此外,我们的研究表明,可能存在细微的差别对亚细胞分布的跨物种SIRT1鉴于一些老鼠的眼睛表现出这种蛋白质的核表达进行了研究。然而,其他变量如不能排除环境压力导致的核本地化。

除了一些细胞质表达DBC1 GCL的人体标本,DBC1染色在老鼠和人类视网膜非常相似。一个独特的模式,GCL和INL染色比所有标本的辊筒是显而易见的。DBC1已知与许多蛋白质相互作用,包括SIRT1,雌激素受体α(ER),RAR,和其他21,22]。这也是一个感兴趣的蛋白质在某些癌症,其表达式已被证明是管制相比,控制组织(18,23]。此外,DBC1已被证明是一个关键的中介细胞凋亡和肿瘤坏死因子-信号(24]。到目前为止,DBC1在神经组织的作用主要是由于其功能作为SIRT1的抑制剂。DBC1的核本地化,我们观察到在人类视网膜可能是重要的抑制SIRT1-mediated脱乙酰作用的核蛋白质转录因子等。虽然SIRT1表达式是细胞质,环境因素可能会导致其核穿梭。DBC1是否仍在受到压力时主动和核或开发,从而抑制SIRT1的活动,还有待确定。DBC1一贯的强大表现观察GCL和INL相比,所有老鼠和人类视网膜的辊筒是一个特别有趣的观察。之前的一项研究发现,牛,鼠视网膜表达雌激素受体在更大程度上在GCL和INL与辊筒(25]。鉴于DBC1可以抑制雌激素受体,染色可能相似的意义,尽管DBC1函数的更全面的评价可以得出任何结论之前是必要的。

神经节细胞的细胞质表达DBC1也是值得注意的。大多数研究看着DBC1称为核蛋白质。Caspase-dependent乳沟DBC1可能导致其细胞质本地化的功能,促进细胞凋亡(24]。细胞质DBC1的角色不太可能在正常人类的神经节细胞是促进细胞凋亡,除非有其他介质保持这个活动。细胞质DBC1在这些细胞也可以调节细胞质SIRT1的功能;这个假设目前正在调查我们小组。

与神经祖细胞研究的证据表明,SIRT1可能重要的分化的细胞类型,其作用可能依赖于其易位可以脱去乙酰基的核转录因子,影响细胞命运的决心。因此,我们调查了SIRT1的表达和分布在小鼠视网膜祖细胞分化前后在不同的时间点。SIRT1广泛表达的时候,没有核的定位在每一个实验条件表明,要么穿梭的SIRT1并不发生在这个细胞类型或无法复制这个过程在体外以同样的方式,因为它是神经祖细胞。这可能是由于分化特异性或特定于协议的差异。

Hisahara和他的同事的研究表明,SIRT1穿梭于细胞核是至关重要的神经祖细胞的分化为成熟神经元(14]。因此,我们将看到一些核SIRT1胎儿视网膜细胞表达。核穿梭SIRT1可能导致retinogenesis但这穿梭于发生在妊娠早或晚时间点比评估在我们的研究中(大约10周)。这是可以想象的,这样的核穿梭在retinogenesis各点和发生在视网膜祖细胞的特定人群。在我们的分析中,我们看到了SIRT1在某些hRPCs核本地化。这些细胞来自14周胎儿,支持这个想法,SIRT1核穿梭晚于10周的妊娠发生。这也是确认核穿梭SIRT1在人类视网膜细胞出现在开发过程中考虑到SIRT1在成人视网膜只细胞质。进一步的工作需要完成一系列大的胎儿视网膜前胎龄和核之间的相关性可以建立SIRT1的穿梭。

核SIRT1的识别在某些hRPCs DBC1表达式求值的动力在这个细胞类型。正如所料,DBC1核为主,尽管coexpression细胞质中的某些细胞(图4)。有趣的是,有一个显著的差异分布剖面DBC1在小型和中型/大型细胞,胞质表达更频繁地出现在小细胞。这个观察的重要性在于细胞大小不同的血统是否具体,目前不清楚。然而,在成人眼里我们观察胞质本地化的DBC1 GCL,表明与细胞质hRPCs DBC1可能是神经节细胞前体,虽然之前需要广泛的分析可以证实这个假说。我们观察到DBC1-negative细胞表明DBC1表达式可能动态监管视网膜发育期间,它被发现广泛表达在GCL, INL,辊筒的成人视网膜。

我们发现SIRT1是广泛表达在视网膜祖细胞在视网膜发展表明,它可能是重要的。其核本地化在某些hRPCs进一步强调其亚细胞分布是动态的,可能导致特定的视网膜细胞亚型的起源。广泛的表达SIRT1在成人视网膜另外表明它可能有一个角色在正常视网膜生理,可能作为氧化还原传感器,航天飞机的原子核时环境压力,使细胞反应迅速。稀疏nuclear-localized SIRT1的INL和GCL一些老鼠的眼睛可能是一位身份不明的压力或可能的结果由于微妙的特有的差异。DBC1 SIRT1的有力负监管机构,被发现在老鼠和人类视网膜表达,而且只核除了coexpression人类神经节细胞的细胞质中。细胞质DBC1也看到hRPCs的子集,表明这个子集,包含主要的小细胞,可能代表了一群神经节细胞的前体。总的来说,SIRT1的数据提出了研究提供证据和DBC1表达在发展和成人视网膜。还需要进一步的功能分析来阐明明确角色发展中蛋白质和成人视网膜。

4所示。实验程序

4.1。组织收集

以下4.4.1。老鼠的眼睛

使用的所有老鼠的眼睛被迈克尔博士的实验室年轻慷慨地捐赠(Schepens眼科研究所,哈佛大学波士顿,MA)。共有24个老鼠的眼睛从C57bl6小鼠年龄在产后第一天(P1) P347。P1老鼠的眼睛是用于研究发展中视网膜像老鼠的视网膜不完全成熟在这个阶段(雷尔et al ., 2004)。所有的目光都放在10%福尔马林处理和石蜡包埋前48小时。

4.1.2。人类的眼睛

人类捐献的眼睛从眼睛获得加拿大央行(多伦多)和接收10%福尔马林和处理和嵌入式收到。总共九的眼睛从五个人类捐助者被用于免疫组织化学分析。所有眼睛满足入选标准建立了捐赠者控制眼睛,即没有眼部疾病在fundoscopic检查报道和死亡由于头部外伤或脓毒症。组织从3女性捐赠者(17岁,53岁,90年)和2男性捐赠者(58 - 87岁)。此外,部分来自两个人类胎儿的眼睛(大约10周的妊娠)被要求获得免疫组织化学研究。胎儿的眼睛没有受到成人的眼睛一样的入选标准,因为这些组织是未知的历史。

4.2。组织准备

人类和老鼠的眼睛都是福尔马林固定后进行处理。人眼在横向平面切割从角膜到视神经,确保减少黄斑。每个地球的两个独立的部分放入组织石蜡包埋的磁带和发送。老鼠的眼睛发送没有第一次解剖的石蜡包埋的眼睛是由于眼睛的大小和破坏自然的人工建筑的风险。石蜡包埋的眼睛Four-micrometer-thick部分被剪掉了,放在显微镜玻片。多个部分被从每个嵌入式眼免疫组织化学研究。

4.3。免疫组织化学

抗体SIRT1 (Abcam)和DBC1 (Abcam)被用来染色人类和小鼠组织。免疫组织化学是通过使用Ventana基准完全自动化的系统。barcode-labelled幻灯片的处理包括烘焙的幻灯片,无溶剂deparaffinization, CC1(三羟甲基氨基甲烷/ EDTA缓冲液pH值8.0)抗原检索。幻灯片孵化了SIRT1或DBC1抗体30分钟37°C,紧随其后的是应用生物素化的二次抗体(8分钟37°C)和一个avidin-alkaline磷酸酶共轭复杂(8分钟37°C)。最后,抗体快速检测到红色显色底物,用苏木精复染色。积极的控制,部分大脑和结肠癌被用于SIRT1 DBC1,分别。消极的控制主要抗体是省略了。所有人类和老鼠的眼睛检查的immunopositivity神经视网膜。

应用组织和细胞的图像被使用蔡司显微镜Axiophot配备了蔡司AxioCam数码相机。免疫荧光图像被使用一个奥林巴斯FluoView FV1000共焦显微镜。图像裁剪和组装成图像复合材料使用Adobe Photoshop CS5软件。

4.4。小鼠视网膜祖细胞(mrpc)

眼睛的视网膜祖细胞收获产后第一天GFP-transgenic老鼠迈克尔博士的实验室提供的慷慨地年轻。GFP表达并不是评估为任何目的在当前的研究中。细胞分离从P1老鼠的眼睛是培养在25厘米²烧瓶Neurobasal媒体包含2毫米谷酰胺,100毫克/毫升青霉素,链霉素20 ng / mL表皮生长因子(EGF)、1 ug /毫升二性霉素b, N2和B27神经补充剂(Invitrogen-Gibco)。细胞通道1:3每7 - 10天。研究涉及到mrpc的分化,增长factor-free媒体补充5%胎牛血清的边后卫。细胞培养7天用这个媒体诱导分化,媒体的一半是改变每48小时。

4.5。免疫荧光

免疫荧光研究小鼠视网膜祖细胞被播种在8-well室幻灯片(LabTech),免疫荧光染色前至少24小时。SIRT1的mrpc表达了未分化或分化为7天。Cy3二级抗体,并使用共焦显微镜分析和成像进行评估SIRT1表达和亚细胞分布。

4.6。mRPC分化:时间分析

通过9和17 mrpc被用来评估SIRT1蛋白质的亚细胞定位前和后立即将细胞移动到不同的媒体。简而言之,mrpc被播种在修改Neurobasal 12-well板媒体和留下过夜。第二天,在特定时间间隔的边后卫添加个别井最终体积浓度5%。下列条件设置:控制(差异),1,3,5个小时在区分媒体。同样的条件为9和通道设置17个细胞。细胞都收获的同时,立即用来制造cytospins,然后应用使用一个SIRT1抗体(Abcam)。免疫细胞化学进行了使用Ventana基准系统中描述的部分4所示。3。应用cytospins然后评价显微镜下辨别SIRT1的亚细胞定位在每个实验时间点。

4.7。人类视网膜祖细胞(hRPCs):文化和免疫细胞化学

人类视网膜祖细胞(hRPCs)迈克尔博士的实验室提供的慷慨地年轻。细胞是来源于人类胎儿(14周的胎龄),获得先进的生物科学资源(阿拉米达,CA)通过治疗终止怀孕。细胞通过3被用于我们的研究。

细胞培养在37°C和5%的公司₂Ultraculture媒体谷酰胺(Lonza)补充了2毫米,10 ng / mL表皮生长因子(EGF)、20 ng / mL碱性纤维母细胞生长因子(bFGF) penicillin-streptomycin(100毫克/毫升),和二性霉素b (1 ug /毫升)。细胞培养在25厘米²烧瓶和美联储每2 - 3天,其中包括把一半的媒体从烧瓶,代之以一个相同体积的新媒体。细胞增长到大约70 - 80% confluency此时他们要么收获实验或通道。

执行Cytospins hRPCs,和免疫细胞化学节中描述使用Ventana基准系统4所示。3。单独的幻灯片使用SIRT1染色和DBC1抗体。后续评估每个彩色标记的表达和亚细胞定位是实现通过10高功率场数(400 x) /滑下一个标准的光学显微镜。