发展血管构造使用脂肪干细胞去除掉烧伤皮肤

文摘

大量面积烧伤治疗重大挑战。临床上,烧伤损伤的程度和深度可以授权使用同种异体移植物进行临时伤口覆盖在自体连续收获来自同一地区。烧伤患者缺乏捐赠站点涉及大的表面积也强调了需要改善皮肤替代品可以实现早期和完全覆盖,保持正常的皮肤耐久性以最小的捐赠者的要求。我们有孤立的自体干细胞手术去除掉烧伤皮肤的脂肪层(dsASCs),使用一个医疗点干细胞隔离装置。这些细胞在collagen-polyethylene乙二醇fibrin-based双层水凝胶,分化成一个上皮细胞层,血管浸润皮肤层和皮下的层。All-trans-retinoic酸和非诺贝特被用来区分dsASCs成epithelial-like细胞。采用免疫分析显示一个矩阵——和时间变化的表达基质,血管,和上皮细胞标记。这些结果表明,干细胞分离去除掉皮肤可以用作一个自体血管细胞来源发展的皮肤构造没有文化扩张或外源性生长因子的补充。这种技术可以提供另一种方法广泛烧伤后皮肤覆盖。

1。介绍

燃烧是一个重要的问题在战斗中伤亡保健和严重的热损伤占大约5%的所有战斗伤亡(1,2]。2011年,美国燃烧协会估计,有450000人遭受烧伤需要医疗,自1995年以来增长了340% (3,4]。其中,45000需要住院,只有55%(24750招生)将进入一个125医院专门烧保健中心3,4]。从临床的角度来看,整个身体表面积(回溯)影响,深度烧,身体位置,和燃烧伤害的性质决定了需要tissue-grafting,组织替代品,所有这些直接影响产生的发病率和死亡率。特别是,随着回溯的增加,死亡率增加比例的结果无法达到皮肤关闭(5,6]。目前,large-body-surface-area烧伤构成显著的治疗的挑战与影响血流动力学不稳定和脓毒症早期,以及后来的并发症疤痕、挛缩,和长期残疾。患者一般从烧伤外科医生包括escharotomy获得明确的照顾,escharectomy,清创术、嫁接,和重建7- - - - - -9]。从临床的角度来看,烧伤损伤的程度和严重程度决定了需要tissue-grafting或组织替代品。虽然自体仍然切除烧伤创面的治疗选择,这个选项可能严重限制广泛烧伤患者因为有限的捐助网站可用性(10- - - - - -12]。此外,重复相同收获厚皮肤移植的供体区域会导致发病率,失去皮肤厚度、过度的疤痕,和增加疼痛。

当一个燃烧的程度超过执行单级自体的能力,许多燃烧中心采用同种异体移植物的使用作为一种顺应措施时等待进一步的可用性(自体10- - - - - -12]。虽然开发了各种各样的皮肤替代品(13- - - - - -15),所需的时间为血管再生和细胞扩张的临床效用这个选项有限。目前,可用皮肤替代品可以分为那些代替表皮或真皮(15,16]。表皮替代物,如动物上皮自体只有几个细胞层厚和缺乏正常的皮肤组织,因此容易频繁故障和感染,甚至年后。真皮替代时,(例如,Integra Alloderm)他们使用有限公司所需的时间和血管再生,因此增加他们感染倾向,干燥,最终贪污损失(17]。添加细胞元素真皮支架了优势对血管再生,但缺乏一个可用的和方便的自体的细胞来源严重烧伤病人没有实用。

理想的替代品的需求包括最小施主能级发病率、可用性和能力重建肌肤的不同功能和层次。产品基于自体培养keratinocyctes和皮肤成纤维细胞更容易导致实际返还(18- - - - - -20.]。不过,挑战涉及这些产品都是需要文化扩张和粗放耕作时间。此外,这些产品需要捐赠正常皮肤活检获得必要的细胞类型在正常组织的可访问性比例减少了回溯(比例增加16]。

另外,开发一个使用干细胞组织工程皮肤替代是一个潜在的选择再生皮肤广泛烧伤患者的治疗(21]。特别是,脂肪干细胞(对asc)已被证明具有巨大的潜在再生皮肤因为他们的巨大可塑性分化成多种细胞细胞系(22]。不幸的是,严重烧伤后,脂肪组织源(s)是有限的,因为可用性的可行的组织和从皮下脂的恐惧导致额外的发病率。因为切向清创术的皮肤经常导致清创术的一些可行的组织,我们已经表明,干细胞可以隔离在足够的数量从废弃的烧伤皮肤的脂肪层(dsASCs)。此外,这些细胞能够集成在无胸腺的老鼠的切除创面(21]。不像其他细胞类型,如成纤维细胞、keratinocyctes,和内皮细胞,明确需要文化扩张,dsASCs可以从患者隔离在比例大量燃烧越来越百分比的回溯。我们曾表明dsASCs拥有multilineage分化能力。在这项研究中,我们证明dsASCs可以隔绝丢弃烧伤皮肤获得清创后使用“良好生产规范”级处理技术。这些干细胞可以使用胶原蛋白和fibrin-based支架开发上皮,dermal-vascular,皮下的层,可以用来开发一个完整的全层皮肤等效。

2。材料和方法

2.1。烧伤病人、手术和同种异体移植物的使用

在一个批准的协议(# h - 11 - 003),燃烧注册在美国陆军外科研究所(USAISR)查询来确定数量的现役军人持续烧伤,包括回溯在伊拉克自由行动和持久自由行动。医院的电子病历系统是用来获取信息的操作和使用冷冻保存同种异体移植物(CPA)的皮肤。

2.2。丢弃的燃烧组织和患者人群

受伤的皮肤烧伤病人烧伤伤口清创后被丢弃USAISR燃烧中心获得。组织样本收集按照协议进行审核和批准由美国陆军医疗研究和装备司令部机构审查委员会(没有。HSC20080290N)。丢弃的皮肤样品后立即被带到实验室清创术和5毫米打孔切片样本和中性缓冲福尔马林固定在10% (NBF)组织学分析或被使用蔗糖梯度低温贮藏技术(冻存23]。简单,组织切片用4%多聚甲醛(PFA, EMS,哈特菲尔德,PA,美国)20分钟,洗和汉克的平衡盐溶液(美国哈佛商学院,表达载体,卡尔斯巴德,CA)和治疗连续随着蔗糖浓度(5%和20%),然后用20%蔗糖孵化过夜(美国圣路易斯Sigma-Aldrich)。sucrose-treated活检是嵌入在Sucrose-Histoprep混合物(2:1)20%(费舍尔,匹兹堡,美国)。嵌入的样本被沉浸在异戊烷,由液态氮冷却和储存在−80°C进行免疫组织化学分析。

2.3。从废弃的皮肤组织干细胞隔离

去除掉皮肤样本清洗与哈佛商学院的三至四倍,去除附着血栓。皮下的层(10到12 g)解剖,转移到培养皿中,并与无菌剪刀或手动lipoaspirate切碎。干细胞分离使用即时转置RTSystem (InGeneron, Inc .,休斯顿,德克萨斯州,美国)根据制造商的指示。短暂,切碎的脂肪组织转移到50毫升锥形管包含20毫升乳酸林格液(LR)的解决方案。这种混合物,2.5毫升Matrase酶(InGeneron)添加和管倒几次剁碎组织和酶溶液充分混合。管被放置在转置RTsystem处理单元(图3(e))和组织受到酶的分离。45分钟后,过滤和水洗分离组织,细胞在转置RTsystem颗粒状。细胞颗粒洗两次磷酸盐和由此产生的间质血管分数(SVF)恢复。SVF细胞颗粒在生长介质resuspended (MesenPRO RS基础培养基),补充补充MesenPRO RS增长,antibiotic-antimycotic (100 U /毫升的青霉素G, 100μ硫酸链霉素的g / mL, 0.25μ克/毫升的两性霉素B), 2毫米的谷酰胺(表达载体)。细胞(1.5到2.0×10⁶)被播种在T75组织培养瓶血压得到较好的控制(美国新泽西州BD猎鹰)和保持湿润有5%的二氧化碳(孵化器有限公司₂在37°C)。4小时后在文化、生长介质代替烧瓶中删除任何漂浮的碎片。剩余的细胞被指定为dsASCs相连。

2.4。组织学方法

组织学分析进行10%的缓冲formalin-fixed丢弃皮肤活检。固定样本石蜡包埋,5 - 7μ米部分被削减,沾着马森的三色的染色(MTS)和/或苏木精和伊红())。“蒙蔽”训练有素的病理学家分析了MTS和/或圆)的彩色部分废弃人类皮肤活检评估组织可行性和烧伤深度。

2.5。免疫组织化学和采用免疫分析

冻结部分(~ 8到10μ米)的废弃皮肤活检,胶原蛋白凝胶keratinocyctes dsASCs分化,和聚乙二醇(PEG) -fibrin-collagen-dsASCs双层凝胶被削减,冷冻切片机(徕卡微系统、胡桃胡同GmbH)和解除到玻片上。部分被洗一旦与哈佛商学院和固定4% PFA在室温下20分钟。非特异性Fc受体介导网站被孵化2小时的部分1%牛血清白蛋白(BSA)或5%驴血清在哈佛商学院。丢弃的部分组织,胶原蛋白凝胶keratinocyctes dsASCs分化,和双分子层凝胶dsASCs一夜之间被在4°C的环境与反人类的主antibodies-platelet-derived生长因子β(PDGFR单克隆β,10μg / mL, BD生物科学,圣何塞,CA,美国),锅细胞角蛋白(5μg / mL, Abcam,剑桥,妈,美国),10μ克/毫升的神经元胶质抗原2(喜欢的《忍者外传2》)(美国Billerica的),和STRO-1 (10μg / mL,研发系统,明尼阿波利斯,美国)。非结合的主要标记部分是洗两次(5分钟)和哈佛商学院和孵化5μ488克/毫升Alexafluor或594 Alexafluor标记二次抗体相应的搞笑同形像45分钟在4°C。细胞核是沾染了赫斯特33342年10的浓度μ克/毫升20分钟在室温下(表达载体,生活技术,大岛屿,纽约,美国)。非特异性荧光是由使用各自的组织部分孵化fluorophore-labeled二级抗体。

免疫细胞化学进行P1 dsASCs,培养在两口井有房间的幻灯片(20000细胞/)(耐尔根Nunc, LabTek室幻灯片,Noperville,美国)48小时维护有限公司5%₂湿润孵化器在37°C。哈佛商学院的细胞被洗两次,固定为4% PFA在室温下20分钟。细胞在一夜之间被孵化与10 4°Cμ反人类的PDGFR g / mL的老鼠β主要单克隆抗体(BD生物科学)。细胞被孵化与二次抗体与荧光标记IgG1 Alexafluor 594标记的第二抗体,赫斯特33342如上所述。

2.6。流式细胞术

通道1 dsASCs与哈佛商学院洗两次,使胰蛋白酶化和resuspended荧光激活细胞分类(流式细胞仪)细胞染色缓冲区(Biolegend、圣地亚哥、钙、美国)的最终浓度5×10⁵细胞/ 100μl细胞被标记主要应用反人类的PDGFR老鼠β体育(10μg / mL, BD生物科学,圣何塞美国CA) 45分钟。孵化后,细胞被洗了两次,然后在500年resuspendedμL细胞染色的缓冲区。流式细胞仪分析使用流式细胞仪咏叹调流式细胞分析仪(Becton, Dickinson和公司、山景、钙、美国)。分析之前,向前散射通道(FSC)和侧散射通道(SSC)属性确定为每个示例使用适当的清白的细胞消除死细胞和细胞碎片。自发荧光信号消除由指定的渠道,调整信号输出和灵敏度是一个封闭的细胞调整收集。总比例的细胞染色阳性个体标记从封闭的人口决定。结果量化由流式细胞仪天后软件(BD生物科学,山景、钙、美国)。积极的干细胞在封闭的人口比例进行了分析通过收集20000个事件。

2.7。上皮分化

1型胶原蛋白从鼠尾肌腱(5毫克/毫升)是获得Travigen(盖瑟斯堡,医学博士,美国),按照制造商的指示有原纤维的通过调整pH值6.8 - -7.0使用100年μL杜尔贝科的磷酸缓冲盐(DPBS Sigma-Aldrich)和23个μL 1 n氢氧化钠(氢氧化钠)每毫升的胶原蛋白的解决方案。有原纤维组织的胶原蛋白添加到培养板插入了一个8 m孔径膜(six-well格式,BD猎鹰)和孵化30到40分钟37°C。完整的胶原蛋白凝胶矩阵后,通道2 (P2) dsASCs(75000个细胞/凝胶)被播种在个人胶原凝胶和孵化36小时MesenPRO RS与MesenPRO RS增长基础培养基补充补充,antibiotic-antimycotic、谷酰胺(表达载体)有限公司5%₂湿润孵化器在37°C。这种文化时期后,凝胶转向低葡萄糖杜尔贝科修改基本的媒体(L-DMEM,英杰公司)含5%胎牛血清(的边后卫,英杰公司)补充all-trans-retinoic酸(ATRA 1μ米/毫升,Sigma-Aldrich)。四天后ATRA治疗,非诺贝特(75μ米/毫升,亚历克西斯,圣地亚哥,美国)添加;24小时后,凝胶是暴露在空气中(空气升)通过消除媒体的内腔内细胞培养插入。通道2 dsASCs培养/胶原凝胶在类似条件下没有任何抗病诱导剂被用作治疗控制。胶原蛋白凝胶观察了12天,光和显微照片拍摄在天4和12奥林巴斯IX71倒置显微镜(奥林巴斯美国中心山谷,PA,美国)。

2.8。Dermal-Vascular分化

开发包含皮肤层,collagen-PEGylated-fibrin凝胶结构是根据我们之前描述开发过程(24用细微的修改。简而言之,P2 dsASCs(50000个细胞/毫升的凝胶混合物)是使胰蛋白酶化和混合1型胶原蛋白(5毫克/毫升;美国Trevigen,马里兰州)和有原纤维的如上所述。collagen-dsASCs混合物加入six-well文化30分钟的插入和孵化有限公司5%₂湿润孵化器在37°C到完整的凝胶。准备PEGylated-fibrin-dsASCs层,PEG-fibrinogen溶液混合物是孵化20分钟37°C。孵化后,dsASCs细胞(50000 /毫升的凝胶混合物),凝血酶被添加到PEG-fibrinogen,仔细混合的解决方案是转移collagen-dsASCs凝胶的顶部。整个凝胶制备10分钟5%孵化有限公司₂湿润孵化器在37°C获得collagen-PEGylated-fibrin-dsASCs双层水凝胶结构。双分子层凝胶是孵化与α基本媒体补充10%的边后卫,antibiotic-antimycotic (100 U /毫升的青霉素G, 100μ0.25 g / mL硫酸链霉素,μg / mL两性霉素B), 2毫米谷酰胺(表达载体)和维护有限公司5%₂湿润孵化器在37°C。凝胶内的干细胞观察了12天,光和显微照片拍摄在天6 - 12与奥林巴斯IX71倒置显微镜。

2.9。脂肪形成的分化

Collagen-dsASCs(50000个细胞/毫升的凝胶混合物)凝胶是如上所述。细胞与脂肪形成的诱导分化培养基组成的DMEM和10%的边后卫,2毫米谷酰胺,和antibiotic-antimycotic(表达载体),补充了1μ地塞米松,200μ吲哚美辛米,10μ0.5 M的胰岛素μM isobutylmethylxanthine (IBMX) (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),并保持在5%的股份有限公司₂湿润孵化器在37°C和观察14天(25]。观察染色的中性脂质分化细胞,胶原凝胶和哈佛商学院冲洗,固定与4% PFA,沾油红o .未分化dsASCs胶原基质作为控制。光显微照片拍摄在天7和14奥林巴斯IX71倒置显微镜。

3所示。结果

3.1。烧伤伤口清创术和严重性

军人治疗USAISR烧伤中心被确定通过燃烧注册表。操作的数量,回溯,并使用临时注册会计师的伤口覆盖844军事病人在一段时间内的10年进行了分析。伯恩斯在这个人口的年龄分布已经先前描述(26)和图1(一)代表他们的关系注册会计师使用的回溯和可能的发生率。最消耗招生集中向低回溯范围(< 30%),注册会计师使用的多数是当回溯大于40%,凸显了需要临时和永久性皮肤替代物当供体稀缺的网站。手术负担大大增加回溯燃烧增加(图1 (b)),这不可避免地需要escharotomy坏死和不能存活的组织和使用自体皮肤移植,移植,和皮肤替代品,标准临床烧伤创面治疗的一部分。

烧伤创面清创后丢弃的皮肤组织也包含一些可行的伤口床,包括真皮,进行进一步的分析。在目前的研究中,共有75个废弃的皮肤样本收集病人不同年龄从16到90(图2(一个)),平均年龄为45岁。丢弃的燃烧组织(图2 (b))区域坏死和可行的脂肪组织。组织学活检样本分析沾)(图2 (c)显示完整的坏死表皮和真皮炎症细胞的浸润和血管通畅(嵌入)的损失。MTS的部分去除掉燃烧皮肤样品(图2 (d))改变形态的真皮胶原束广泛透明样变化。部分完好无损(星号,插图)和倒塌的组织层(箭头)和细粒度的细胞质和显著的损失明显液泡中观察到脂肪组织。

3.2。干细胞隔离过程

丢弃的组织(图3(a)),这是受细胞隔离的过程,首先是对干细胞的存在原位。去除掉组织PDGFR呈阳性β(图3(b),染绿了Alexafluor 488),表明居民存在的干细胞群内皮下的脂肪组织层。图3(c)显示总细胞核染色(赫斯特)在这个地区,和图3(d)显示PDGFR的叠加β和核。

可行的脂肪组织的细胞隔离使用转置RTtissue处理系统(图3(e))产生了一个异构的细胞,SVF由单核细胞的混合物,和CD45⁺有与血液相关的细胞。隔离后,SVF镀,附着的细胞群孤立和特征。SVF, resuspended和镀在细胞培养板一夜之间,产生了≈7 - 9×10⁵贴壁细胞/ 10通用的脂肪组织处理(数据没有显示)。流式细胞仪分析通道1 (P1) dsASCs显示,超过80%的人口粘附细胞(5×10⁵dsASCs) PDGFRβ⁺。此外,P1 dsASCs生长在室幻灯片PDGFR呈阳性24至48小时β(图3(g),染红了Alexafluor 594),证明细胞分离的脂肪层去除掉组织最初是相同的干细胞群原位(图3(c))。图3与赫斯特(h)显示细胞核染色,和图3(我)显示了细胞核的叠加和PDGFRβ。

3.3。开发使用dsASCs皮肤层的替代品

图4描述了采用的战略发展皮肤替代品。在这个过程中,dsASCs结合胶原水凝胶被用来开发一个上皮和皮下的层。同时,重建血管浸润皮肤层,collagen-PEGylated-fibrin双层水凝胶结构实现。

3.4。上皮结构

开发上皮构造,dsASCs最初被播种的胶原蛋白水凝胶和与ATRA诱导。dsASCs播种在胶原基质开始对齐成鳞状细胞样的形态到了第四天(图5(一个)),气体提升和非诺贝特归纳后,能够分化成epithelial-like立方形的细胞形态学白天12(图5 (b))。采用冷冻切片的分析上皮分化dsASCs锅的胶原凝胶显示阳性染色细胞角蛋白(红、图5 (c);核是蓝色的)。这些结果表明,dsASCs可以分化成epithelial-like表型不使用生长因子在胶原基质。

3.5。血管真皮构建

血管浸润皮肤构造是由内播种dsASCs collagen-PEGylated-fibrin双层水凝胶。这个策略允许同时,双向分化中的dsASCs双层结构。胶原蛋白层内的dsASCs呈形态学展出白天6(图5 (d));白天12、dsASCs仍然呈激增和填充整个凝胶(图5 (e))。相比之下,PEGylated-fibrin层内的双层凝胶,dsASCs形成独特的管状网络白天6(图5 (g)),最终形成密集的网络白天12(图5 (h))。应用部分的12个双层凝胶显示存在α平滑肌肉阳性细胞(图5 (f))在基质的胶原层表明维护dsASCs表型。管状网络PEGylated-fibrin层内NG2成为呈阳性,表明PEGylated-fibrin凝胶支持dsASCs向外膜细胞谱系分化(图5(我))。这些结果表明,双层水凝胶可以作为血管内dsASCs真皮等价的。

3.6。皮下的构造

皮下的构造是由微分dsASCs胶原蛋白凝胶内使用去媒体。在诱导分化初期,dsASCs胶原蛋白凝胶内扩散;但只有少数细胞表现出油囊泡的存在白天7(图5 (j))。然而,到了14天,dsASCs显示脂滴(图的重要积累5 (k))。脂质积累的分化dsASCs胶原基质在14天内与积极与油红o染色显示(图5(左))确认的承诺dsASCs形成成熟的脂肪细胞在胶原基质。

4所示。讨论

在这项研究中,我们已经表明,干细胞分离废弃组织可以作为一个可行的上皮细胞来源,间质、血管、脂肪细胞自体皮肤等效的发展。这些细胞类型组合允许调整的任何或全部个人层切除皮肤,包括表皮、血管浸润真皮,真皮。使用厚皮移植是今天的标准escharectomies后急性烧伤创面的覆盖。它提供了可靠的大型表面覆盖与捐助发病率相对有限。然而,当回溯大于40%,捐助网站成为限制因素和排除单级覆盖自体移植物。在这种情况下,一个同种异体移植物用于临时覆盖而捐助网站允许reepithelialize重复之前收获是可能的。这种技术,虽然标准,增加了一个近似2周的治疗时间。

能够使用切除脂肪细胞来源,结合各层的细胞外基质支架再生皮肤,有一个固有的优势,实现覆盖没有捐助网站可用性的限制。虽然我们目前的方法使用同种异体移植物可能导致成功的报道,而操作的增加以及在重症监护室增加了住院的总长度。此外,使用厚的自体移植物并不会取代所有的失踪真皮或任何的真皮。这直接导致脆弱,nonpliable移植病人的皮肤。重建的能力的所有层切除皮肤坚持原则,声音形式和功能是密不可分的。

我们组曾表明,丢弃烧伤皮肤包含表皮和真皮和皮下的脂肪组织的一部分因为坏死脉管系统被认为是不能存活的。然而,这个废弃的组织还包含可行的血管周的结构。我们先前已经表明这血管周的利基包含可行PDGFR人口β⁺细胞(21]。越来越多的证据表明,对asc占领血管周的地区(27,28),可以隔离和扩大的富裕人口多功能干细胞(29日- - - - - -31日]。健康的捐赠者对asc一般都隔绝lipoaspirates [32,33];然而,在广泛烧伤病人的情况下,抽脂会增加感染性并发症的创伤和免疫受损病人。因此,隔离的干细胞从脂肪组织层去除掉烧伤的皮肤是一个可行的方法来获得一个足够数量的干细胞重建应用程序。本研究中使用的转置RTsystem孤立dsASCs是一家专业设备,提供了一个“良好生产规范”级酶组织处理协议,它可以用于手术室。超过80%的附着dsASCs PDGFRβ⁺,展示获得干细胞的可行性通过转置RTprocessing系统。

使用dsASCs重建肌肤的三层,我们利用三维矩阵的内在线索微环境由胶原蛋白和PEGylated-fibrin-based水凝胶矩阵。这时,表皮替代物通常由文化扩张正常人类keratinocyctes从皮肤活检开发细胞表16,34- - - - - -36)或细胞喷雾剂(37,38]。然而,这些方法的主要缺点是所需的时间(≈3 - 4周)文化扩张,需要使用特殊的文化媒体和生长因子。在现有的方法中,美国食品和药物管理局批准的化学诱导物(非诺贝特和ATRA)是用来区分dsASCs在胶原蛋白水凝胶在12天内成epithelial-like细胞。潘细胞角蛋白表达的细胞分化和分层为表皮角蛋白标记特定keratinocyctes(未公开的数据)。使用同样的方法,dsASCs也可以使用与其他可用collagen-based矩阵开发一个上皮替代。

失败的主要原因之一,现有的皮肤或皮肤等价物是无法在短时间内成为将近当应用于伤口床(39- - - - - -41]。最近的研究表明对asc endothelialized真皮等效使用的发展(42),但这种方法涉及对asc分化的内皮细胞之前他们纳入矩阵,其中包括使用生长因子和增加了整体时间表生成真皮替代。我们当前的方法再生皮肤包括epithelialized的同步发展,血管浸润皮肤替代品,主要是由于固有的能力从周边biomatrix ASC以提示。完成这个过程,我们利用collagen-PEGylated-fibrin-based双层水凝胶。这双层水凝胶的目的是克服需要predifferentiate细胞之前纳入bioscaffold,预计将为宿主细胞提供一个可行的环境,导致更好的伤口再生。纤维蛋白和胶原蛋白已被用于各种生物医学和伤口愈合应用程序(41,43]。Fibrinogen-based产品通常用于临床,因为他们促进伤口愈合进行早期的细胞和分子事件必不可少的组织联系和血管生成43,44]。使用纤维蛋白在构建皮肤层利用其固有的能力提供一个三维的临时矩阵dsASCs促进血管生成,当应用于创面。PEGylated-fibrin凝胶促进dsASCs分化成管状网络表达喜欢的《忍者外传2》,展示其承诺开发血管表型血统,类似于我们之前的观察与对asc鼠(24]。胶原蛋白层内的水凝胶构造,dsASCs保持纤维母细胞表型,形态,表达α平滑肌肌动蛋白(αSMA)。之前的研究已经证实αSMA微丝束的存在(周围的周45和定位由内皮细胞CD31表达28,46]。此外,dsASCs也表达了STRO-1(数据没有显示),确认在胶原蛋白水凝胶基质细胞表型的承诺。在这项研究中,我们表明,dsASCs表型可以由基质微环境的dsASCs维持他们在胶原蛋白和间质表型分化成血管表型聚乙二醇纤维蛋白。因此,双层矩阵可以直接干细胞表型,以及作为一个模板创建的血管浸润皮肤替代品。

最后,真皮也可以使用与胶原蛋白水凝胶结合dsASCs重组。传统上,这层皮肤被忽视,因为它不仅仅是通过嫁接的分裂或全层皮肤所取代。目前可用的皮肤替代品也仅针对代替表皮和/或真皮,而很少注意到真皮的39,41]。然而,一些研究已经证明了脂肪组织的有利影响与软组织重建(47,48]。在全层深烧伤的情况下,更换补充大量的真皮具有明显的优势并减少轮廓不规则。它也可能有潜在的改善皮肤肤质,改善体温调节的好处。当dsASCs胶原基质诱导与脂肪形成的媒体,他们可以分化成脂肪细胞,显示积极与油红o染色在胶原基质内,油滴dsASCs显示一个三维的模式,这一现象直接影响周围的微环境。胶原蛋白凝胶是一种典型的皮下的替代品;我们推测dsASCs,当结合目前非细胞胶原蛋白矩阵(41,49- - - - - -51),可能同样有区别原位使用创建的皮下的脂肪形成的诱发者皮肤替代品。

皮肤替代发达国家在这项研究中,使用不同的天然生物材料和自体干细胞,目的是用于广泛的烧伤创面再生。在最近的研究中,1×10⁵dsASCs足以覆盖伤口总表面积≈2厘米²,因此使用1×10⁶dsASCs将允许更大的覆盖范围,可达20厘米²表面积,伤口。此外,我们collagen-PEGylated-fibrin-based双层水凝胶改善血管再生可以应用与FDA批准的皮肤替代物改善血管化、集成和重构矩阵替代的主机来治愈伤口床。我们最近还开发了一种PEGylated-fibrin凝胶结构,嵌入式与磺胺嘧啶银盐加载微球具有抗菌和血管生成属性(52]。我们还设想开发一个工程皮肤替代品,具有抗菌性,因为当前的产品不能放在感染伤口由于他们缺乏感染控制。

5。结论

更换所有的理论优势三个失踪的皮肤的解剖层是长期提高移植皮肤的质量,减少了需要手术修正。虽然还需要更多的研究来证明这种方法的可行性,我们已经证明可行的干细胞可以从切除燃烧焦痂,当暴露在适当的刺激,他们就会分化成不同的间充质细胞类型,对应于三层皮肤。当与适当的支架和诱导物混合,这个来源的干细胞可以用于直接伤口覆盖不需要细胞扩张。此外,这种方法将使整个程序执行在手术室后立即燃烧焦痂切除对永久的伤口覆盖。此外,自体的细胞可以存储用于二次修正的过程。通过引入额外的复杂性为烧伤创面的覆盖,自然失败的风险增加。然而,实现更好的长期成果结合的潜在好处少操作所需的早期报道或二次修改很容易超过风险。我们的双层collagen-PEGylated-fibrin水凝胶诱导健壮的血管化的优势,促进公司,因此也可能降低感染的风险。进一步演示这种方法在临床前模型正在进行。

免责声明

本文所包含的观点和主张的私人观点是作者和不被理解为国防部的官员或反映的意见或部门的军队。作者是美国政府的雇员,这工作是准备作为自己的职责的一部分。这项研究是由美国陆军医学研究和装备司令部。这个研究是在一个协议进行审查和批准的美国陆军医学研究和装备司令部机构审查委员会和依照批准的协议。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者要感谢CPT劳拉McGhee和托马斯先生加尔萨去除掉组织的集合,桑德拉女士为她一步技术支持,提供技术支持和卡拉蒙女士在细胞排序。流式细胞仪数据生成核心flowcytometryfacility,支持的是圣安东尼奥德克萨斯大学健康科学中心andNIH-NCI P30 CA054174(癌症治疗和研究中心)。美国支持Natesan匹兹堡组织工程计划(PTEI)。d . o .萨莫拉支持日内瓦基金会授予的。

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