综合特征的间充质干细胞从人类胎盘和胎膜及其应对Osteoactivin刺激

文摘

间充质干细胞(msc)是最有希望的种子细胞,细胞疗法,可以从各种来源分离成人组织如骨髓(BM-MSC)和脂肪组织。然而,从这些组织细胞必须通过侵入性程序。因此,我们msc孤立特征从新鲜胎盘(Pl-MSC)和胎膜(Mb-MSC)通过形态学和fluorescent-activated细胞分类(流式细胞仪)。MSC膜的频率高于胎盘(0.65±2.14%和15.67%±0.29%)。Pl / Mb-MSCs在体外扩张潜力明显高于BM-MSCs。我们证明MSC-specific标志之一是足够的MSC隔离和文化在特定媒体的最佳方式是选择同质MSC人口。这些msc可以分化为中胚层细胞表达细胞标记和细胞学的染色与成熟的成骨细胞和脂肪细胞一致。转录组分析和细胞因子数组显示广泛相似性胎盘,membrane-derived msc和只有离散差异与BM-MSCs浓缩的网络参与骨分化。Pl / Mb-MSCs显示成骨分化潜能高于BM-MSC osteoactivin当他们的反应是评估。Fetal-tissue-derived间充质细胞,因此,被认为是一个主要来源的msc达到临床规模银行特别是骨再生。

1。介绍

多能间充质干细胞(msc)能够危象中分化为中胚层的血统,比如脂肪形成的chondrogenic,成骨的,肌原性的,血管生成细胞1]。从骨髓msc最初孤立Haynesworth et al。2]。在骨髓中,它们提供支持造血作用[3]。他们还会分泌一些血管生成生长因子重要包括血管内皮生长因子(4]。因此,他们代表一个最有前途的细胞类型的细胞治疗和组织工程或创伤修复。事实上,不同的临床前实验使用msc执行演示的能力改善心肌缺血后或脑功能压力,或肝脏和关节损伤或手术外伤后5- - - - - -8]。他们也可能是最佳的细胞治疗诱导免疫耐受。事实上,他们甚至通常可以被移植在各地大型使远系繁殖动物主要组织相容性复合体(MHC)不需要免疫抑制障碍(9]。

骨髓是人类msc的传统来源,但他们已经从各种各样的成人孤立的组织如脂肪组织(10)、肺(11),和肝脏(12]。然而,细胞从这些组织必须通过侵入性程序,和个人间变异性很难控制。几项研究描述msc的分解动作从胎儿脐带血等组织13),胎盘(14- - - - - -16],羊膜[17,18),和羊水19),和他们所描述的msc特征。

Osteoactivin (OA)有能力调节细胞增殖、粘附、分化、细胞外基质的合成蛋白质在不同细胞类型(20.- - - - - -30.]。OA信使核糖核酸(mRNA)和蛋白质表达的人类和啮齿动物造骨细胞(29日,30.]。OA下调降低成骨细胞分化和功能(31日]。成骨细胞细胞蛋白质表达水平提高OA在分化。OA已经证明是必不可少的成骨细胞细胞的分化和功能(32]。我们之前证明OA诱发类似成骨细胞的分化比老鼠BMP2 MSC表明OA可能是小说有代理(29日,31日,32]。

在这项研究中,我们优化隔离的胎盘和羊膜MSC BM-MSCs和比较其增殖和分化潜力。我们通过不同的方法分离msc从胎盘和胎膜,和我们合格他们根据标准化协议国际社会的细胞治疗(ISCT) [33]。我们进一步研究和证明OA触发器在人类msc和成骨细胞的分化,分化是更重要的在胎儿msc BM-MSCs相比。我们说明,胎儿组织派生msc比BM-MSCs更容易分化成成骨细胞。

2。材料和方法

2.1。胎盘和胎膜收集

内部审查委员会批准后(HMC-IRB协议9109/09,在卡塔尔威尔康奈尔医学院),胎盘和胎膜从捐赠者在女人的医院收集哈马德医疗公司选择性剖腹产后立即到期没有劳动,早产膜破裂,绒毛膜羊膜炎,子痫前期,宫内生长迟缓,或染色体异常。标本被完全鉴定,认为是生物浪费。因此,没有从病人同意书。

2.2。间充质干细胞隔离

补充图1(可用http://dx.doi.org/10.1155/2012/658356)描述了本研究中使用的隔离程序。胎盘、蜕膜被收割前胎盘组织。胎盘胎膜的部分是免费的。胎膜,我们决定不单独羊膜和绒毛膜部分为msc隔离说明最直接的工作流。收获的组织在磷酸缓冲盐洗(PBS, PH值7.4),机械绞成碎片的约1毫米²,随后与dispase消化(1毫克/毫升,Hyclone)、胶原酶(300 U /毫升)(Hyclone) hyalluronidase (100 U / mL, Hyclone),我DNAse (80 U /毫升,罗氏)1 h在37°C下搅拌(150 rpm)。PBS的匀浆随后被清洗。细胞被过滤在100μm细胞过滤器。红细胞聚蔗糖梯度和骨料被取消。收集细胞等单核的分数进行进一步分析。

二百万个可行的细胞被直接镀在msc文化传媒(DMEM低葡萄糖20%的边后卫,2毫米L-Glutamin,和1%的青霉素、链霉素16])或整理SORP流式细胞仪咏叹调II (BD生物科学),然后镀MSC文化媒体在24孔板。文化是在湿润5%孵化有限公司₂孵化器和媒体是每三天更换一次。

不同捐赠者的骨髓msc (BM-MSCs)从干细胞购买公司(msc - 001 f,干细胞Inc .)和PromoCell(数量12974,PromoCell)和维护在同一培养条件,胎盘/ membrane-derived msc (Pl / Mb-MSCs)。第四章节我们执行分析以获得均匀的细胞群和足够数量的细胞执行所有并行分析。

2.3。疣状和Fluorescence-Activated细胞排序(流式细胞仪)分析

流分析的细胞表面抗原和细胞排序,msc彩色CD45的表达,CD34, CD73, CD105, CD90、并使用鼠标反CD29 CD45抗体(BD生物科学,339192号,克隆2 d1)加上Amcyan,鼠标反CD34 (BD生物科学,555821号,581年克隆)加上FITC,鼠标反CD105 (biolegend,数量323212,克隆43 a3)加上AF647,鼠标反CD73 (BD生物科学,550257号,克隆AD2)加上PE、鼠标反CD29 (biolegend,数量323212,克隆TS2/16)加上APC-Cy7,和鼠标反CD90 (BD生物科学,550402号,克隆5 e10汽油)加上AF700。

简单地说,1.10⁶细胞收获和特异性的网站被封锁在pbs - - - bsa的边后卫- 1% - 10% - 5%货代阻塞试剂(Myltenyi研究)30分钟在冰上。细胞悬液是孵化与特定的抗体在冰上45分钟。在PBS和过滤洗涤后45μm过滤器,细胞分析荧光激活细胞分类(流式细胞仪)SORP FACSAriaII (BD生物科学)作为描述。数据处理FACSDiva 6.3软件(BD生物科学)。对比已排除了FSC-W×FSC-H和SSC-W×SSC-H分析,single-stained通道用于补偿,和荧光团- 1 (FMO)控制用于控制,每样例(500 000事件被收购了34]。

2.4。免疫细胞化学

细胞在文化发展在8室幻灯片(BD猎鹰,编号为354102)和彩色如下。

使用的抗体是鼠标反CD29-FITC (biolegend,数量303016,克隆TS2/16), CD73-PE (BD生物科学,550257号,克隆AD2), CD90-AF568 (BD生物科学,550402号,克隆5 e10汽油),CD34-PE (BD生物科学,555822号,581年克隆),CD45-Amcyan (BD生物科学,339192号,克隆2 d1),非结合的,CD105 (BD生物科学,555690号,266年克隆)揭示了二次山羊抗小鼠IgG1抗体(表达载体,数量- 21121)。

简单、特异性的网站和Fc受体被封锁与PBS / 0.3%牛血清白蛋白/ 0.5% HS 30分钟和货代阻塞试剂(Miltenyi,编号120-000-442)。部分是孵化主要抗体(1小时30分钟),洗两次在PBS / 0.5%渐变20 (Sigma-Aldrich),如果需要孵化与二次抗体(1小时,AF488山羊anti-mouse IgG1为0.5μg / mL)。核与4 -复染色,6-diamidino-2-phenylindole(表达载体)。幻灯片是安装Fluoromount工具包(表达载体)。部分分析了蔡司激光扫描共焦显微镜显微镜710(卡尔蔡司)。图片进行了分析与禅宗2008 V5, 0, 0228软件(卡尔蔡司)。

2.5。中胚层的谱系分化

2.5.1。脂肪形成的血统

脂肪形成的分化诱导培养80%汇合的MSC DMEM-HG 3周,1μM地塞米松,5μ60克/毫升(σ),胰岛素μ吲哚美辛(σ;目录编号:17378 - 5 g), 0.5毫米3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX;σ;目录编号:I5879) [35]。去评估了井油红O染色细胞。

2.5.2。成骨的血统

成骨分化诱导培养90%汇合的MSC DMEM-LG 3周,10% FCS, 0.1μM地塞米松(σ;澳大利亚注册号码:16375;澳大利亚墨尔本维多利亚),50μM L-ascorbic acid-2-phosphate(σ;目录编号:A8960-5G;城堡山、新南威尔士、澳大利亚),10毫米β甘油磷酸二钠盐五水化物(σ;目录编号:50020),0.3毫米无机磷酸(钠)(σ)35,36]。成骨分化被染色茜素红S评估。

2.5.3。Osteoactivin刺激

镀三天后msc(50%融合),重组人类osteoactivin交付在一个剂量的100 ng / mL分化媒体DMEM-LG 10% FCS, 0.1μ50 M地塞米松,μM L-ascorbic acid-2-phosphate 10毫米β甘油磷酸二钠盐五水化物和0.3毫米无机磷酸(盐)。控制进行了常规细胞培养媒体上面描述。成骨分化然后评估在第七天,14日和21 OA治疗后通过染色茜素红s .治疗后,颜色相衬显微镜照片是在不同时间点获得。红色通道的分析进行了使用图像J (NIH)。归一化细胞数量是使用蓝色通道完成。

2.6。转录组分析

RNA是孤立使用试剂盒试剂后跟额外净化使用RNAeasy从试剂盒提取工具(试剂盒,号码74106)RNA收益率产生满意的微阵列数据。两个质量控制措施进行了:(1)和(2)光度分析大小分馏过程使用微流体设备(安捷伦科技)。200 ng的总RNA分析了Affymetrix GeneChip人类基因组U133 + 2.0数组。数据分析使用Parteck软件(V6.09.1110-6;Affimetrix)。类比较BM-MSCs和Pl / Mb-MSCs(三个生物复制)进行识别基因表达变化显著表达差异()和2倍增加或减少的表情。Parteck软件基因本体工具被用来确定浓缩(37]。

我们用智慧通路分析软件(智慧系统,红木市,CA)来识别和分析相关通路的基因列表比较后获得BM-MSC和Mb / Pl-MSC。网络是由基因在基因列表中覆盖到全球分子网络由信息创新路径中包含知识数据库使用关键字如器官形成和成骨细胞分化。网络的基因,或表达下调Pl / Mb-MSCs相比BM-MSCs然后算法来生成基于连通性。网络是一个图形表示的分子基因之间的关系。基因被表示为节点和生物两个节点之间的关系表示为一条直线。支持所有边缘的至少一个参考文献,从课本或规范的信息存储在数据库独创性通路的知识。值正则路径被浓缩的生成基于超几何分布和计算right-tailed费舍尔的确切t以及为2×2应急表。

2.7。Phospho-Kinase数组

msc在分化培养或控制媒体的存在与否OA 4 h。细胞收获和蛋白质提取的推荐和基于样品吸光度在280 nm的量化使用nanodrop设备(热电电子)。200年μg蛋白质是人类Phospho-kinase抗体阵列加载系统研发(研发系统、数字ARY003)根据制造商的指示。

数组显示使用辣根过氧化物酶(合)和西方SuperSignal Pico化学发光底物(热科学)。使用Geliance CCD摄像机采集到的数据(珀金埃尔默)和提取使用图像软件(NIH) J。短暂、数组的照片倒和背景减去。我们定义了一个直径120微米区域信号捕获。中值像素密度被用来评估信号。相比之下,独立数组值归一化的积极控制强度值。

2.8。细胞因子的数组

msc在无血清培养媒体72小时之前发表(38]。上层清液收集和蛋白质量化基于样品吸光度在280 nm使用nanodrop设备(热电电子)。200年μ克蛋白质是人类细胞因子抗体研发系统加载阵列面板(研发系统、数字ARY005)根据制造商的指示。分析了阵列如上所述。

2.9。统计分析

学生- - - - - -t,Fisher精确,或卡方测试进行。所有值双边有统计学意义在0.05 alpha级评估。所有统计分析使用数据分析插件完成运送到Excel 2008 Mac(微软)。我们首先计算两个配对的方差。均值±SEM图上所示。所有结果都是代表表示数量的独立实验。

3所示。结果

3.1。msc隔离方法

补充图1描述了工作流图表的酶促反应而引起人类术语胎盘/细胞壁的细胞隔离膜,通过直接的文化或单元排序,纤维母细胞的推导,我们认为多功能间充质干细胞(msc)。两种方法被用来分离msc。(我)选择特定的MSC媒体后直接文化组织消化后获得的细胞悬液,(ii) fluorescent-activated细胞排序根据表达式定义的特定的MSC标记国际社会细胞治疗(ISCT CD105阳性,CD73, CD90、CD29,和消极CD45和CD34) (39]。15个不同人羊膜和胎盘被用于这项研究。我们能够区分msc和所有这些标本,所有的分析都是代表三种不同的样品。

3.2。msc更丰富的比胎盘膜

我们量化的msc胎膜和胎盘使用polyvariate流式细胞术。CD45⁻,CD34⁻细胞被选为CD105的表达和分析,CD73, CD90、CD29。这四个标记定义的msc在膜更丰富,Mb-MSC比胎盘(±0.29%)15.67%,Pl-MSC 2.14%(±0.65%,图1(一))。

(一)

(b)

(c)

图1

⁻ ⁻ ⁺ ⁺ ⁺ ⁺ 更高比例的msc可以隔离膜和胎盘。胎儿组织派生msc增殖动力学显示大于骨髓msc。(一)定义为CD45 msc,CD34、CD29,CD90,CD73和CD105。比例计算在刚消化胎盘标本和胎膜形成三种不同的捐赠者。msc代表15.67%(±0.29%)和2.14%(±0.65%)的细胞分离膜和胎盘,分别(* *)。(b)第一天相衬显微镜直接从胎盘附着细胞和膜镀后组织消化在媒体msc。我们可以看到更多比胎盘附着膜细胞消化。(c) msc来源于胎盘和胎膜扩展到通过15没有变化的形态和增殖率。增殖率是评估细胞数在不同的段落。在胎盘和类似membrane-derived msc早期和晚期的段落没有区别。然而,增殖率明显高于从骨髓msc的增殖率。

同样的结果被发现在200万个细胞直接镀后组织消化。贴壁细胞的数量明显高于在第一天膜胎盘(图进行比较1 (b))。

3.3。胎盘或膜分离msc增殖能力大于骨髓msc

增长动能Mb-MSCs和Pl-MSCs BM-MSCs相比,在同一通道。Pl / m msc的增殖率明显高于BM-MSCs(图1 (c))。此外,Mb-MSCs和Pl-MSCs扩展到通过15没有修改他们的形态和增殖率中描述的其他研究然而BM-MSC停止增殖后段7到8 (14]。

3.4。分析基于CD90的亚种群和CD29表达式

我们首先定义我们的细胞群是为CD45和CD34阴性。在我们所有的独立体验,绝大多数(如果不是全部的话)CD73(85%对99%)⁺CD105,⁺细胞也表达CD90、CD29达到msc的规范定义(33,39]。然而,CD90的数量⁺、CD29⁺细胞阳性CD73 CD105是降低从65%到85%不等(图2)。因此,我们决定进一步分析人口特征是CD90 / CD29表达式。我们想知道我们能够从这些不同的细胞群获得msc。我们分类4亚种群基于标记的表达:CD90⁺CD29⁺;CD90⁻CD29⁺;CD90⁺CD29⁻;CD90⁻CD29⁻在胎盘和胎膜(图2和补充图2)。我们都执行经验3独立的捐助者。纯度的应用保证了纯度面具和控制的纯度不同的细胞数量排序。

图2

⁻ ⁻ ⁺ ⁺ ⁺ ⁺ ⁺ ⁺ ⁻ ⁺ ⁺ ⁻ ⁻ ⁻ 细胞分析策略允许隔离4种不同的细胞群。细胞染色用鼠标反人类CD45-Amcyan CD34-FITC, CD29-APC-CY7, CD90-AF700, CD73-PE CD105-AF647。后FSC-A / SSC-A选择,只有CD45和CD34细胞被认为是。CD73 CD105, CD90、CD29概况进行分析。CD73CD105细胞被超过85%到98%的阳性CD90、CD29(下图)。然而,CD90CD29代表人口更多的异构当看着CD73, CD105染色。我们定义不同的细胞群基于CD90 CD29族群:CD90CD29;CD90CD29;CD90CD29;CD90CD29(中间面板)。

没有一个CD90⁻CD29⁻细胞可以生长在msc媒体。的CD29⁻CD90⁻实际上是一个非常同质人口CD73主要含有⁻CD105⁻细胞(补充图2)。相比之下,我们能够获得间充质细胞3其他排序的亚种。这表明至少一个的表达这两个标记为msc隔离和资格是必不可少的。

4通道后,大多数的细胞分类CD90、CD29表示。(表1和补充图3)。在这个阶段,绝大多数显示CD73⁺CD105⁺概要文件。我们确认所有标记的表达,免疫荧光染色(补充图4)。


	CD90⁺	CD29⁺	CD105⁺	CD73⁺

骨髓	97.6%	90.9%	99.7%	98.7%
膜	87.6%	99.8%	96.7%	99.8%
膜CD29⁺CD90⁺	79.3%	99.7%	96.4%	99.5%
膜CD29⁺CD90⁻	91.8%	98%	98.1%	97.8%
膜CD29⁻CD90⁺	85.2%	99.9%	98.5%	99.4%
胎盘	91.1%	99.8%	99.2%	99.5%
胎盘CD29⁺CD90⁺	79.1%	99.9%	99.1%	99.9%
胎盘CD29⁻CD90⁺	84.7%	99.6%	99.8%	99.5%

3.5。分化分析胎盘和膜msc

特定的脂肪形成的诱导和成骨分化进行Mb / Pl msc排序基于CD29, CD90表达式或直接镀后隔离和BM-MSCs分化(图相比3(a))。

图3

差异化分析的Pl / Mb-MSCs相比BM-MSCs和细胞因子表达。(一)代表分化的Pl / Mb-MSCs通道4所示。细胞在诱导介质(分化)或控制标准介质(控制)。(模拟)BM-MSCs成骨和脂肪细胞的分化和控制。(f-h) Mb-MSCs成骨和脂肪细胞的分化和控制。(b)细胞因子的表达Mb-MSCs和BM-MSCs分析器使用蛋白质组。(c)量化细胞因子的光学密度。测量与图像获得J软件(NIH)。

所有不同的细胞的数量由胎盘或膜不管隔离协议相同可以分化成脂肪细胞和成骨细胞确认他们的表型和功能的相似性(数据未显示)。

3.6。细胞因子的分泌msc

细胞因子分泌概要文件非常类似的胎儿和BM-MSCs之间强烈的GRO分泌α(处于)、il - 6、引发(CXCL8) MCP-1 CCL2, MIF (GIF, DER6)和serpin E1 (PAI-1),见图3(b)和3(c),只有离散差异指出,GROα(处于)分泌的BM-MSCs高于胎儿msc的表达,而表达的il - 6和MCP-1 BM-MSCs相对低于胎儿msc。

3.7。胎儿和骨髓msc的转录组比较

我们首先分析了差异membrane-derived和placenta-derived msc。根据PCA分析证明,msc来源于膜或胎盘不能区分基于他们的转录组概要(图4(a))。然后,我们分析了不同的亚种CD90、CD29定义的表达式。他们也显示类似的转录组配置文件(数据4(b)和4(c))。

图4

⁺ ⁺ ⁻ ⁺ ⁻ ⁺ ⁺ ⁺ ⁻ ⁺ PCA表示Pl-MSCs转录组比较,Mb-MSCs BM-MSCs和聪明才智途径分析。(一)Mb-MSCs(红色)和Pl-MSCs(绿色)重叠显然不可能区分这些指示msc在转录水平。他们显然可以从骨髓msc分化(蓝色)。(b)膜的PCA排序子总体中每个细胞之间的重叠(CD29CD90红色;CD29CD90蓝色;CD90CD29绿色)或nonsorted细胞(Mb-MSCs紫色)表明不可能区分不同的msc族群在转录水平。(c)不同从胎盘(CD29 MSC群的PCACD90红色;CD29CD90蓝色)或直接孤立的细胞(Pl-MSCs蓝色)表示不可能歧视这些msc族群在转录水平。(d)独创性通路分析能够定义丰富通路与胚胎形态发生和器官发育胎儿msc BM-MSCs相比。(e)独创性使用器官形成和成骨细胞分化的分子网络路径分析显示了浓缩proosteogenic基因在胎儿比BM-MSCs msc。

BM-MSCs相比,145个基因显著调节和267个基因表达下调Mb-MSCs BM-MSCs相比(补充表1和图5补充)。同样,154个基因显著调节与Mb-MSCs调节基因重叠(133)和272个基因表达下调(238重叠Mb-MSCs表达下调基因)在Pl-MSCs BM-MSCs相比(补充表2和图5补充)。

独创性和大卫的分析,我们可以定义多个通路和基因参与胚胎形态发生和器官发育调节Pl和Mb-MSC BM-MSC相比(图4(d)和补充表3)。多个基因参与细胞外基质组织,骨骼系统发展和脉管系统发展调节BM-MSC而Pl和Mb-MSC(补充表4)。

然后我们进行独创性通路分析建立器官形成和成骨细胞分化的分子网络。我们发现14个基因调节在Pl / m MSC与成骨分化在文学如BMP、IGFBP4,白细胞介素6,HGF, PTGS2(图4(e))。

3.8。Osteoactivin-Derived成骨细胞分化

Amniotic-membrane-derived msc (Mb-MSCs)被用于这个研究的一部分,因为他们是类似于msc来源于胎盘和更丰富。在我们的细胞培养和分化的设置,显示的Mb / Pl msc向成骨细胞分化的能力没有差异比较BM-MSCs。OA治疗增加了分化Mb-MSC和BM-MSC在14 - 21天,茜素红染色,Mb-MSCs显示显著增加成骨分化(数字5(一)和5(b))。我们注意到的OA分化媒体加速成骨分化与积极茜素染色从7天Mb-MSC和第14天BM-MSC(数据没有显示)。

3.9。磷酸激酶数组分化细胞的分析

我们分析了一系列磷酸激酶的磷酸化模式4 h后OA刺激Pl-MSCs和BM-MSCs(数字6(一)和6(b))。两个细胞系,磷酸化相关兼容的增殖分化过程中减少。尽管BM-MSC被磷酸化分子,OA触发ERK1/2 Pl-MSCs磷酸化。ERK激活先前已经被Furochi et al。40通过办公自动化)激活。那些先前的发现与我们的数据让我们站在一起的OA激活成骨的作用通过ERK1/2通路激活在fetal-derived msc分化明显。

图6

磷酸激酶阵列分析4 h后osteoactivin刺激。4 h (OA)刺激后,细胞收获和蛋白质提取物分析人体磷酸激酶数组从研发系统。(一)磷酸激酶在Pl-MSCs分析器和BM-MSCs使用蛋白质组。(b)量化磷酸激酶光学密度。测量与图像获得J软件(NIH)。ERK2被激活在胎盘msc提交osteoactivin刺激。

4所示。讨论

msc被认为是未来的治疗因其自我更新能力和multilineage分化(4,41]。例如,他们支持造血,增强移植后的造血干细胞cotransplantation [3,42]。实验和临床数据证明BM-derived msc的免疫调节功能的减少可能导致造血干细胞移植后移植物抗宿主病(43,44]。此外,即使临床研究仍轶事,已报告BM-MSCs施加有利影响有限数量的患者的治疗骨不愈合(45- - - - - -50]。msc启动骨折修复过程形成的软骨模板(愈伤组织),然后被新骨取代,填补这些差距6]。限制在MSC和/或函数假设发病机制中发挥重要作用的骨折不愈合。

目前,认为骨髓msc的主要来源细胞疗法。然而,愿望BM涉及侵入性程序。的频率、分化和BM-MSCs下降明显与年龄的增长潜力51]。因此,寻找替代来源一致的msc具有十分重要的价值。事实上,当我们考虑治疗的应用程序,它将强制访问细胞银行显示各种各样的HLA类型。据报道,msc可以从各种孤立的组织(11,52]。在这些资源中,胎盘和膜可能是由于他们的可访问性的理想来源,无痛捐赠采购、承诺为自体来源细胞疗法,降低病毒污染的风险。这些组织将允许的可访问性构成临床相关银行项目。

在这项研究中,我们从胎盘和胎膜分离msc使用非常简单的隔离技术相同的伟大纯洁收益率(超过95%)比最初的流式细胞仪分选方法(53]。此外,没有发现区别不同msc族群的胎盘和膜之间考虑表型特征,增长动能,标记表达式,分化化验,转录组概要文件。这表明某些MSC标记的可塑性。我们的确说明用于msc细胞的表面标记排序有限兴趣胎儿间充质干细胞组织隔离。我们证明msc检索是6 - 8倍的收益率比胎盘胎膜优越。此外,其他人已经演示了通过细胞遗传学分析,placenta-derived msc为30 - 40通道保持正常核型在体外(54]。事实上,我们表明,Mb / Pl msc保留甚至在大量的段落明显比BM-MSCs更好的扩散能力。我们终于证明这些胎儿MSC与BM-MSC分享关闭转录组的概要文件。

目前,骨形成protein-2和7 (BMP-2和7)是唯一的生物修饰符,获得美国食品和药物管理局(US-FDA)批准在整形外科手术的临床应用。我国低生物活动证明了几十毫克的剂量商业BMP-2 7-containing产品,而每个浓度在活的有机体内大约有几微克每千克骨(55,56]。BMP治疗剂量在临床前和临床试验中不同因素100折,展示低一致性在骨修复57]。

间充质干细胞的特征值得注意,我们使用的标准ISCT [33]。我们想点一个限制强调可塑性的表型标记。首先,真正的具备干细胞能力(自我更新)的msc没有进一步证明,应该记录在研究单克隆细胞株。因此,当他们有一个真正的区分能力在不同的血统,很难说如果单个细胞确实可以区分不同的血统。此外,这种类型的细胞的作用在活的有机体内仍然还没有清晰地定义缺乏具体目标的间充质干细胞。

我们最近表明,OA徒BMP-2下游,和我们的研究结果表明,OA可能相似的论述影响BMP-2老鼠。

我们调查的反应胎儿msc OA BM-MSCs相比。我们证明OA可以诱导成骨的人类msc分化。更有趣的是,fetal-derived msc显示更好的响应比BM-MSCs OA。我们终于证明OA也可以用作osteogenic-induced补充与胎儿msc分化。最后,根据文献,我们文档的诱导成骨分化后OA刺激涉及ERK1/2途径激活。

考虑到msc在膜和胎盘相比,更加丰富我们,因此,站在胎膜可以用于构建msc银行计划以满足临床阈值在骨折修复。隔离Mb-MSCs通过选择性文化DMEM-low葡萄糖补充20%血清和抗生素似乎是最有效的过程。这个过程是非常适合自动化与大细胞银行程序兼容。

此外,应对成骨分化能力的增加在osteoactivin治疗提示我们研究胎膜的作用msc在实验的临床前模型骨再生。事实上,关键的动物实验是必要的,以确定msc是招募和生存骨折部位,其修复效果,并通过他们发挥他们的行动的机制。

资金

这项工作是由卡塔尔基金会NPRP 08-663-3-140和NPRP 08-663-3-140卡塔尔基金会的资助UREP拨款06-116-1-023,卡塔尔基金会,技术转让。

补充材料

图1:工作流msc隔离

图2:综合分析msc标记的新鲜羊膜的孤立的细胞。

图3:Pl / Mb-MSCs构成一个同质人口后4通道。

图4:免疫荧光染色的胎盘和膜派生msc。

图5:维恩分析基因调节上下在Pl / Mb-MSCs BM-MSCs相比。

表1:列表之间的基因差异表达骨髓msc和胎膜msc。

表2:列表之间的基因差异表达骨髓msc及胎盘msc。

表3:发育过程中的基因列表过度BM-MSC Mb-MSC比较。

表4:附着力和矩阵的基因列表交互过度Mb-MSC BM-MSC比较。

补充材料

引用

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干细胞国际

:羊膜干细胞再生医学的潜能

文摘