文摘
间充质干细胞(msc)蕴含着巨大的希望作为再生医学和自身免疫性疾病治疗药物,根据其分化能力和免疫抑制特性。然而,治疗应用程序带来的一系列问题对culture-expanded msc对人类安全的使用。本文总结了最近发现msc的安全问题,特别是他们在长期的遗传稳定性在体外扩张,其低温贮藏、银行业和血清制备的msc的角色。
1。介绍
它已经表明,间充质干细胞(msc)移植的可能是一种有效的治疗许多疾病包括血液疾病,急性呼吸窘迫综合征,脊髓损伤,肝损伤和严重肢体缺血症1- - - - - -4]。到目前为止,数以百计的临床试验使用msc在数据库中注册(http://www.clinicaltrials.gov/美国国立卫生研究院)。此外,许多nonregistered临床研究使用msc在许多国家被执行。
msc的惯例包括隔离各种组织(包括骨髓、脂肪组织、胎盘脐带,脐带血,外周血,和牙髓)和细胞扩张在体外文化条件。利用msc的并发症治疗工具在活的有机体内出现由于实验构件引入的不一致的细胞培养协议。事实上,大多数msc在研究实验室用于临床试验准备,缺乏足够的临床前研究和制造质量控制。此外,世界各地的实验室缺乏国际标准化实践在体外msc的扩张,导致异质细胞数量不一致的结果,在实验研究和临床试验。
此外,尽管msc已经使用自体和同种异体设置,大多数临床应用msc实际上是个性化治疗的病人接受政府提供的msc不同的捐赠和/或不同的准备。这需要建立标准化生产指南隔离,扩张,保存,和交付的msc显示最小的变化在他们的生产和承担大规模生产msc为“细胞药物”安全性评价和临床应用。
2。扩张和msc的遗传稳定性
主要的msc在人体组织极为罕见。msc的频率大约是成人骨髓中有核细胞有核细胞在脐带5]。msc的数量已经注意到随着年龄增长而减少。按十年分组时,明显降低在msc /骨髓有核细胞可以观察到,与10倍减少从出生到青少年和另一个10倍减少从青少年到老年6]。
尽管数量有限,msc可以扩展到高水平在长期的文化系统,它允许一个大规模生产的临床应用msc。通常,成人骨髓msc (BMMSCs)可以为6 - 10通道增长相同的文化,而胎盘脐带msc可以接受30到40的段落。众所周知,长期的文化人类胚胎干细胞(ESCs)会导致适应和收购染色体异常(7- - - - - -12]。诱导多能干细胞(万能)进行删除过程中肿瘤抑制基因的重组,而致癌基因引起了文化的复制(13]。尚不清楚的是,“culture-adapted msc在长期使进行自适应转换在体外。
从高分辨率的分析表明,先前获得的数据在体外扩大人类BMMSCs缺乏DNA拷贝数的畸变(14,15]。然而,在特定CpG senescence-associated修改网站一直在观察MSC在文化扩张。转换的关键证据基于DNA指纹图谱尚未提出的研究作者称,msc在栽培[接受恶性转变16- - - - - -25]。因此需要更多的数据来评估的基因组稳定性msc在长期的文化在体外。highresolution遗传分析包括平衡和不平衡的基因变化是一个重要的方法来确定msc转换的可能性。如果CNV或SNP检测到变化后长期的培养,这不仅是指发生突变的突变也提供一个生存(衰老或凋亡阻力)或生长优势或多或少。早期,即使没有区别late-passage msc在基因组,它并不意味着没有基因改造期间长期培养。变异的msc没有生存和生长优势将被稀释的过程中培养,成为长期培养后检测不到。相比之下,变异的msc与生长优势或抗衰老临床应用的更大的风险。
3所示。肿瘤形成
干细胞拥有一些癌细胞的特征包括长寿命,相对细胞凋亡抵抗,和长时间复制的能力。此外,类似的生长调节剂和控制机制参与癌症和干细胞维护。因此,干细胞可能发生恶变,往往被视为一个关键的阻碍干细胞为基础的医药产品的安全使用。
一些先前的研究描述了自发的msc的变换在体外。然而,几乎所有的他们没有提供坚实的评价正常同源的msc和转换。实际上,大部分的自发的恶性转化msc被HT1080 cross-contained,海拉或其他肿瘤细胞系(16,17,20.,21,23- - - - - -25]。没有足够的证据对msc的致瘤性扩大在体外。
为了解决安全问题,我们进行了数次GLP-compliant在活的有机体内毒性研究使用老鼠点头,NOD / SCID小鼠、豚鼠、兔和猴模型。UC-MSCs从主msc银行(通道2,P2)解冻和培养更多五个段落(P7)和十一个段落(P13)。第七页的末尾或P13 6×10的一个大概的数目9或5×1012UC-MSCs,分别收获、分配和低温贮藏直到使用。在肿瘤发生的研究中,UC-MSCs 1×10的剂量7/鼠标是皮下移植到老鼠和NOD / SCID小鼠点头。没有观察到两个月后肿瘤形成细胞移植在这些动物。当时移植UC-MSCs对肿瘤生长的影响研究使用以前的点头老鼠注射诱导白血病K562细胞肿瘤。两个注射(两周的间隔)不同剂量的UC-MSCs导致显著抑制小鼠轴承白血病K562肿瘤生长的肿瘤。这些在活的有机体内结果与我们的是一致的在体外结果显示一个强有力的抑制作用的UC-MSCs K562和HL-60细胞的增殖没有诱导细胞凋亡(26]。
为了评估的整体毒理学UC-MSCs,我们有一个执行在活的有机体内在猕猴身上接受重复政府UC-MSC学习。UC-MSC管理是由静脉注射一次每两周6周,与剂量的2×106或1×107细胞/公斤体重。所有的动物都活了下来,直到预定的安乐死。没有显著MSCs-related变化被发现在人体重量,临床症状,血液生化值、器官重量、或组织病理学结果。这毒性研究的结果表明,移植UC-MSC并不影响整体健康的猕猴(27]。
此外,绝大多数临床试验对msc在再生医学应用中没有报道主要健康问题。Centeno等人报告,两组患者(组1:;组2:)2006年至2010年治疗各种骨科条件culture-expanded,自体BMMSCs。在单层培养细胞培养瓶使用自体血小板溶解产物技术和注入的成周围关节或椎间盘与使用c臂透视。使用密集的轨迹MRI跟踪和监测并发症339例,未发现肿瘤并发症在任何干细胞再植术网站(28]。MSCs-based疗法也已经用于其他人类疾病设置,移植物抗宿主和心脏病等,初步报告显示良好的安全性。这些发现表明缺乏确凿的证据恶性转变在活的有机体内msc移植后临床使用。需要进一步的研究来确定msc可以帮助肿瘤形成及相关机制。尽管msc与染色体变化没有显示任何恶性转变的迹象在体外或在活的有机体内(29日),它仍不确定,获得的突变会引起细胞在长期的文化转换。存在的可能性,msc获得拷贝数变异在持续扩张。因此,有必要开展aCGH或SNP数组来评估临床应用前的基因组的完整性msc。
4所示。低温贮藏和银行业的msc
隔离并在大规模临床应用msc,生产标准化的制备过程和长期存储msc需要从不同来源分离未来临床应用(30.- - - - - -32]。
因为hla成人器官捐赠者并不总是可用,干细胞来源于几个birth-associated围产期tissues-including脐带血,胎盘和脐带cord-can倾斜,防止未来危及生命的条件。围产期msc的临床级生产和保护需要坚持cGMP(当前良好的生产实践)以确保交付的“细胞药物”不仅安全,而且可再生的和有效的。低温贮藏细胞允许网站之间的运输的细胞,以及完成安全测试和质量控制。综上所述,围产期msc的银行包括捐赠决心和样本收集、原代细胞隔离和微生物测试,主选择干细胞,细胞扩张,低温贮藏和银行,最终干细胞的细胞大规模扩张和准备产品。严格的标准使干细胞银行工作和管理是至关重要的。验证sop(标准操作规程)和质量保证程序msc的一个设计良好的银行的关键因素。维护的可行性、生物学特性和不育使倾斜msc安全和“准备使用”。
它已经表明,低温贮藏不会改变msc分化等生物学行为的增长,表面标记(33]。血清和二甲亚砜(DMSO)和冷冻保护剂用于研究实验室。冻结msc的主要挑战是冷冻保护剂的毒性在临床使用。DMSO溶液的毒性是高估了,因为它会削弱了稀释cyropreserved msc在临床使用。的边后卫(胎牛血清),BSA(牛血清白蛋白),或储蓄帐户(人血清白蛋白)不应替代cyroprotectant DMSO因为污染与人类或动物病毒的风险。
5。血清无血清培养系统和查看
在体外扩张msc的传统方法是在中包含的边后卫和增加了添加生长因子。然而,对于广泛的临床应用,msc与血清的接触必须最小化,因为它是一个假定的朊病毒或病毒传播。血清是最不确定的因素在临床级msc的扩张。考虑批次变异性和病毒污染的可能性,一些替代的边后卫如人类AB血清或抗血小板溶菌产物不能被认为是更好的选择,为临床使用生产msc (34]。Chemical-defined xeno-free,无血清培养基(SFM)可能征服所有的边后卫的问题。此外,比较serum-contained媒介,一些证据支持SFM提供一种佐剂对维持染色体稳定BMMSCs和脂肪msc (35]。另一项研究主要集中在小鼠胚胎成纤维细胞表明二倍体核型在血清培养即使在PD60维护。非整倍体核型是诱导的血清36]。血清中可能不受控制的促有丝分裂的刺激会导致强烈的遗传不稳定性。然而,SFM msc的扩张仍然是一个尚未解决的问题。SFM都有自己的缺点的准备临床级msc。附件的msc SFM需要纤连蛋白的涂层或其他基质包含组件的人类起源和批次变化,不能定义良好的化学。
事实上,SFM不是以及一些商业公司声称。基于我们自己的数据,UC-MSCs增殖缓慢在SFM FBS-contained媒体。有时,在SFM UC-MSCs不能扩展。大量的研究表明,msc可以扩展的边后卫包含中没有转换(14]。如果msc在SFM扩大,类似的安全性研究需要确定血清系统影响msc的遗传稳定性,导致肿瘤的形成。
总之,安全仍在细胞疗法的一个主要担忧。安全的电池产品的生产需要整个过程监督,确保细胞维持整体的表型,功能潜力,确保培养细胞保持untransformed和微生物污染。因此,msc银行业和细胞产品制造业和相应的质量管理体系程序必须申请保证最终的细胞产品的安全性和效率。此外,我们不能仅仅依靠生物学家来生产msc,满足临床应用的要求。细胞工程技术在翻译需要从扩大msc在实验室在细胞工厂大规模生产。
确认
本研究支持的863项目(批准号2011 aa020118)和中国973计划2011 CB964800(批准号2011 cb964802)中国的科学技术部。