“诱导多能性”细胞的潜在Synucleinopathy研究

文摘

α-核蛋白是一种蛋白质参与几个所谓synucleinopathies包括帕金森病的发病机制。各种各样的模型到目前为止评估。人类诱导多能干细胞提供一个病人——和特定疾病模型在体外研究,pharmacotoxicological屏幕,希望为未来的细胞疗法。最初的实验过程包括病人的收获材料重编程过程中,调查患者的遗传背景培养细胞,和disease-relevant因素的评价/蛋白质在不同细胞培养条件。

1。α-核蛋白和帕金森病

α-核蛋白是一种蛋白质,它被认为与突触前囊泡和参与多巴胺运输的规定,分泌,和再吸收1],可能通过与陷阱交互复杂[2]。此外,它被认为是额外的核和细胞质功能。然而它获得通过其作用突出的病理帕金森病(PD)和其他一些神经退行性疾病概括为synucleinopathies [3]。-核蛋白可以形成原纤维包含骨料-核蛋白,所谓的路易小体和路易树突PD神经病理学的主要特征。他们参与帕金森病发生和神经退化尚未最终瓦解。的发现-核蛋白overexpressing或点突变在某些PD患者,有更高的倾向形成原纤维,另外加强相信这种蛋白质的核心作用在PD (4]。几个在体外和在活的有机体内因此模型建立研究纤维的形成,路易小体和神经退化的机理(5]。有趣的是,高似乎倾向于形成原纤维特征的人类蛋白质。虽然老鼠overexpressing鼠标-核蛋白没有神经表型,老鼠overexpressing人类-核蛋白患有神经退化(6]。这表明,尽管蛋白质功能和交互以及病理机制可能是部分分析了动物和动物细胞培养,这些发现都要仔细检查在人类系统尽可能接近真实的疾病病理。此外,使用人类细胞甚至可以显示其他mechanistical发现啮齿动物无法模仿。

2。疾病模型Synucleopathies

基本上,疾病建模是在几个分支执行。简而言之,在活的有机体内主要研究包括病人的临床特征与疾病相关的形态学和进步7,8]。PD的临床研究包括的评价,例如,辐射变化(器官形态、发射机释放/吸收,退化的迹象如斑块或代谢障碍),症状评分,疾病,或pharmacotoxicological试验。其次,寻找疾病相关基因遗传调查abberations和熟悉cosegregation伟大的价值等的理解和治疗退行性综合症。此外,在活的有机体内建模包括几个动物模型从低等动物如蠕虫秀丽隐杆线虫,苍蝇d .腹或斑马鱼d .鱼类(9,10]。这些动物模型不仅提供系统的见解遗传疾病背景,而且还有助于阐明发病机制的途径。除此之外,他们允许相对容易处理模型在低成本。不过,帕金森病等疾病还包括研究使用高等动物模型模仿人类的生物,也就是说,猴子和猿类。当然,大多数高等动物模型包括小鼠模型在不同成分(5]。这些老鼠现在可以相对容易生成有价值的特性,比如遗传击倒甚至器官特定的和/或以诱导的方式。这些模型是用于各种研究。小鼠模型一般代表的调查,例如,pathomechanisms,疾病进展,基因功能,或pharmacotoxicological评估。另一方面,在体外研究经常利用手机设置。高利息的PD研究细胞培养来自不同来源的多巴胺神经元组成。直到最近,大多数的这些细胞模型从啮齿动物或其他动物。调查对这些模型进行广泛的优势获得详细的细胞机制。单个细胞的遗传调制另外提供洞察细胞过程如分化、迁移、函数或退化过程,如细胞凋亡或坏死。特别是用于干细胞研究的分化和成熟。在PD几种不同来源和类型的干细胞。以下存在的差异:(i)多能胚胎干细胞(ES)多巴胺神经元细胞是一个很好的来源,可用于未来细胞治疗方法和作为pharmacotoxicological化验的平台。不过,他们继承了道德和法律禁止和海港某些危险如畸胎瘤的形成在活的有机体内。(2)神经干细胞(成体干细胞)提供源甚至自体多巴胺能神经元和可用于特定的和特定疾病病原调查(11- - - - - -15]。然而,这些细胞是极其困难的收获,这是唯一可能的有害的外科手术。此外,(到目前为止)这些细胞不能通过长时间和失去潜在生成多巴胺能神经元。(3)间充质干细胞从骨髓中被认为是最容易收获个人干细胞来源。这些细胞也被认为是某个源为多巴胺能神经元和提供一个良好的希望未来的细胞治疗各种神经退行性疾病(16]。但是,多巴胺能分化的效率很低,研究仍远离细胞疗法。

3所示。诱导多能干细胞作为疾病模型

研究神经退行性疾病在人类细胞中当然是一项艰巨的任务。以来影响细胞中不能传播文化和主要材料的供应非常有限,他们不能被广泛使用作为一个模型系统。最后一段中所描绘的一样使用胚胎干细胞和随后分化为神经干细胞和神经元可能部分规避这一障碍。但是他们使用了非常有争议的是在多个国家由于道德问题。这个问题已经解决发现的诱导多能干细胞(iPS细胞)。“诱导多能性”细胞产生的体细胞可以重组成纤维细胞和角质细胞和某些转录因子的被迫过度(称为山中因素Oct4、Sox2 Klf4,原癌基因(OSKM))成一个强烈类似于胚胎干细胞的国家(17]。这些细胞随后可以被分化成几乎所有细胞的生物18当然)和神经分化(如部分中描述4详细)(图1(一)),特别是为多巴胺能神经元影响最大的PD (19]。这种方法可能是更有价值的使用从PD患者的细胞α-核蛋白突变评估和比较他们的“诱导多能性”细胞来源和健康的神经元。通过这些手段可以从动物细胞培养系统和其他验证结果在体外化验在人类细胞非常相似甚至相同的实际上是PD患者的影响。因此它是重要的建立一个不同的诱导多能干细胞捐赠者α-synuclein-related疾病。

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图1

生产“诱导多能性”细胞衍生的神经元遵循基本的发展步骤。(一)被迫过度角化细胞重新编程为“诱导多能性”细胞的实验因素(OSKM)。后分化成外胚层的细胞神经干细胞可以分离出神经花结形成的中心。随后这些神经干细胞可以分化成神经元,(b)扩散角化细胞文化,(c)“诱导多能性”细胞集落feeder-free文化,(d)神经玫瑰解剖和隔离神经干细胞前不久,(e)贴壁培养的神经干细胞,4周后神经元(f) iPS细胞衍生的文化。

4所示。生成和iPS细胞的分化

第一个问题当重编程体细胞到“诱导多能性”细胞重新编程的细胞类型。传统上,大多数组织使用打孔切片的纤维组织,因为他们相对容易获取和传播。然而,当计划生成特定的细胞系必须考虑到验收执行打孔切片不是很高,因为它仍然是一个侵入性和痛苦的过程。因此,我们赞成从摘头皮头发角质细胞的使用作为起始细胞(图源1 (b))。这些细胞可以通过非侵入性手段,此外,有一个更高的重编程效率相比皮肤成纤维细胞(18,20.]。最新发现表明redifferentiating iPS细胞支持细胞类型接近它们的起源在重组加强角质细胞的好处开始因为它们起源于外胚层的细胞和密切相关的神经元比成纤维细胞(21]。

交付的四个重组因子Oct4、Sox2 Klf4和原癌基因是最好通过慢病毒转染的多顺反子,可割取的构造。这个系统仍然港口效率最高(22,23]。虽然有几个其他方法描述,包括瞬时转染或蛋白质转导(24,25),这些效率很低,不能很好地用于生成特定的细胞系。修改rna转染的描述为非常有效的重组,但仍有待在更广泛的基础上评估(26]。慢病毒转染当然有负面影响的随机DNA整合到基因组。这部分可以减少通过使用cre-excisable慢病毒结构。然而,为了减少副作用造成的集成以及不同线路之间的区别是很重要的评价一定数量的行,最好是来自不同的捐赠者。

当生产iPS细胞重编程效率高是很重要的,因为病人材料是有限的。因此使用高质量的文化重新编程细胞以及馈线细胞重编程过程中使用是至关重要的。除了描述了几种选择方法来缓解隔离的iPS细胞(27,28]。“诱导多能性”细胞产生必须彻底确保他们真正的“诱导多能性”细胞的身份特征(图1 (c))。

“诱导多能性”细胞分化成神经元已经进行了广泛的研究与胚胎干细胞(29日,30.]。可用的协议,尽管大大不同的细节,分享一些通用的步骤。通常情况下,“诱导多能性”细胞的分化是FGF2的开始撤军。在悬浮培养这是用来形成拟胚体包含所有血统的前体细胞。分化成外胚层和neuroectodermal血统,但是,除了高度增强的BMP拮抗剂‘诺金’(以及小分子dorsomorphin)和更结合SB431542 TGFβ通路抑制剂(31日,32]。在一起这两种物质能引起强烈的神经分化甚至附着条件下和在线条与较低的神经分化的潜能。在附着条件下细胞开始形成神经花结(图1 (d))。他们由PAX6或Nestin-positive神经干细胞(nsc)和模拟神经管的发展在体外。排除未分化的细胞或细胞分化成不同命运的内部区域神经花结可以机械或保持酶的分离。这样可以确保高纯度和类似的nsc的分化阶段。nsc可以培养附着条件下或在暂停neurospheres(图1 (e))。然而,目前尚不清楚多长时间可以培养这些细胞没有减少或改变他们的分化潜能。nsc不同的文化条件,引起神经元已报告的某些神经元亚型的一代,像glutamatergic神经元,多巴胺能神经元,或运动神经元(图1 (f))[30.,33]。诱导细胞最终分化与混合神经营养因子治疗像glial-derived或脑源性神经营养因子(BDNF和GDNF)等不同的形态因子声波刺猬。高重现性细胞生存、文化素质和突触形成已经报道了cocultures与胶质细胞(34]。这些生成的鼠标或人类的起源,还可以自己从iPS细胞(35]。当然这可能是相关性尤其是疾病,神经胶质细胞引起或导致病理的影响。

5。在“诱导多能性”细胞Synucleinopathy研究视角

即将到来的“诱导多能性”细胞研究的目的是研究synucleinopathy-derived神经元的形态和电生理行为和比较健康的细胞。自-核蛋白尤其参与突触的隔间里,改变会有极大的兴趣(2]。它已经表明,人类神经元表达“诱导多能性”细胞来源-核蛋白(36]。第一个synuclein-related病人“诱导多能性”细胞line-derived神经元的三倍-核蛋白(SNCA)基因显示更高的量-核蛋白蛋白质相比,健康控制细胞(37]。除了已经公布的相对年轻的神经元,我们可以展示α-核蛋白在成熟的“诱导多能性”细胞衍生疣状神经元核以及水泡染色模式(图2(一个))。他们也表达基因以更高的速度比“诱导多能性”细胞或nsc(图2 (b))。有趣的是,基因LRRK2(富亮氨酸重复激酶2)也在分化调节神经元(图2 (c))。这PD-associated描述了基因增强的能力α-核蛋白形成聚合(38]。神经元来自病人体内基因LRRK2 iPS细胞的突变显示增强的应力敏感性和高架-核蛋白水平(39]。在亚细胞分离α-核蛋白存在于核分数(P1),但主要在P2分数包含膜相关蛋白和突触间(图2 (d))。另一个非常有趣的研究将是评估老龄化在这些iPS细胞来源的神经元。他们必须保持文化的时间太长,和/或另外强调引起plaque-like结构的形成在体外。这将是一个非常强大的工具,因为它将会概括PD患者中观察到的神经变化。如果培养细胞可以可靠地引起-核蛋白聚集和斑块他们也将是一个理想的读出系统的医药研究和评估潜在的PD药物。因为只是人类α-核蛋白及其突变形式似乎这么高的趋势形成斑块“诱导多能性”细胞衍生的使用人类神经元可以评估的关键pathomechanisms参与synucleinopathies的形成。最后一步是概括patient-derived细胞在健康细胞的表型观察到感兴趣的基因的人工修改。这种方法已经被证明了α-核蛋白点突变(40]。额外的使用这些与单一改变同基因的控制是很重要的,最终证明基因的单基因疾病的潜力α体内基因LRRK2 -核蛋白或并排除额外的但是未知突变。

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图2

α α α α SNCA LRRK2 hmb α “诱导多能性”细胞来源神经元表达-核蛋白。(一)免疫荧光染色法在TH -核蛋白(酪氨酸羟化酶)和TUBB3(微管蛋白beta-III) 5个月后积极的多巴胺能神经元分化显示核和水泡的本地化-核蛋白,(b)和(c) RNA的表达-核蛋白()和富亮氨酸重复激酶2 ()是“诱导多能性”细胞调节相比,神经元和神经干细胞(nsc)(归一化辅助基因),(d)“诱导多能性”细胞衍生的亚细胞分离神经元核(P1分数)和膜相关,可能突触本地化(P2分数)-核蛋白。

利益冲突

作者声明没有潜在的利益冲突。

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