人类羊水细胞形态功能与皮质细胞缝隙连接

文摘

干细胞的使用是一种很有前途的战略受损组织的修复受伤的大脑。最近,羊水细胞(AF)得到了很多的关注作为替代的干细胞来源细胞疗法。然而,这种方法的成功很大程度上依赖正确的组织移植和宿主之间的相互作用。特别是,脑功能网络的重建需要形成的缝隙连接,提供足够的细胞间通讯作为一个关键的一步。在这项研究中,我们表明,房颤细胞表达高水平的CX43 (GJA1)和能够与皮质文化建立功能性缝隙连接。此外,我们报告一个感应Cx43表达在星形胶质细胞损伤后鼠标运动皮层和首次演示Cx43表达之间的接口AF植入细胞和宿主的大脑细胞。这些发现表明,CX43-mediated AF细胞之间的细胞间通讯和皮质星形胶质细胞可能导致重建受损组织的中介调节,自我平衡的,在大脑受伤的保护性因素,因此需要进一步调查。

1。介绍

最近的再生医学的进步推动努力探索干细胞修复受损组织的治疗潜力在受伤的大脑(综述[1- - - - - -4])。特别是,胚胎干细胞的移植5),胎儿神经干细胞或祖细胞(6- - - - - -8),或从骨髓干细胞9,10到受伤的大脑已经被广泛研究。然而,人类胚胎干细胞(ES)细胞和胎儿神经干细胞受到伦理考量和肿瘤发展的风险,而成人神经干细胞增殖能力有限和血统限制。因此,其他干细胞来源,如人类羊水(AF) [11- - - - - -13),被认为是治疗应用。有证据表明,房颤含有干细胞亚群(s) (14孤立的基于c - kit (CD117-the干细胞因子受体(15])表达,分享一些胚胎和成体干细胞的特点14]。例如,一些报告表明,房颤细胞可以分化的脂肪形成的和成骨的16- - - - - -18),肌原性的19,20.)和内皮21通路。此外,房颤细胞也被证明港口潜在的神经源性分化,使用不同的感应协议[14,18,22- - - - - -25];然而,证明这些细胞可以分化成神经元功能仍然是难以捉摸的26,27]。

尽管如此,AF-derived细胞的多功能性治疗应用程序一直在研究各种动物损伤模型在中枢和周围神经系统(14,28- - - - - -32]。虽然已经表明AF-derived细胞对缺血性脑在一定程度上起到有益作用比得上胚胎神经祖细胞的神经保护作用[32),还有待确定这些细胞是否能够融入大脑和开发功能连通性与宿主组织来支持neuroregenerative和防护能力。这一战略的成功取决于快速和高效的形成细胞间嫁接AF细胞和宿主组织之间的通信功能网络的重建。事实上,最近的一份报告Jaderstad et al。33)清楚地表明,一个重要的步骤在移植胚胎干细胞的功能集成,即使在成熟的电化学突触沟通,通过缝隙连接和信息耦合。这种集成至少部分是依赖差距的形成交叉的细胞间通讯(GJIC),它被认为是一个不可或缺的信息传播机制中细胞在中枢神经系统。缝隙连接是由两个并列,膜结合联接蛋白hemichannels;每六个联接蛋白亚基组成,加入桥两个邻近细胞的细胞质(34,35]。这种整合允许转让离子和小分子,营养,代谢产物,第二信使,最近microrna [34,36]。因此,细胞间移植物与宿主细胞之间的沟通构成许多早期的细胞相互作用和中起着重要的作用破坏宿主细胞在脑损伤后的救援33]。预计在细胞间的缝隙连接形成会导致主机和移植细胞间的信息交流,因此提高移植成功率以及治疗药物的转移。更具体地说,connexin-associated缝隙连接形成和功能已被证明是至关重要的,以确保宿主细胞健康和调停潜在的神经保护作用33]。事实上,NSC-mediated救援时主机受损神经元没有缝隙连接形成被药理和/或抑制RNA-inhibition策略(33]。

之前虽然房颤细胞移植到几个组织,包括大脑,目前没有信息在这些细胞缝隙连接和他们是否形成与宿主组织细胞间沟通的一种手段。因此,更好地了解房颤的互动过程细胞整合到宿主神经组织可以提供洞察供体和受体之间的相互作用。在这项研究中,我们检查连接素的表达在房颤细胞RNA和蛋白质的水平,使用在体外和在活的有机体内技术。此外,我们判断房颤细胞可以形成功能与其他AF细胞缝隙连接以及皮质细胞。

2。方法

2.1。细胞培养

人类羊水(AF)细胞从渥太华医院,获得一般校园(渥太华,加拿大),羊膜穿刺术后在15到35周的妊娠妇女(AF15-AF35)。这项研究是由渥太华医院和全国委员会批准加拿大研究伦理委员会,并从每个捐赠者获得书面知情同意。房颤在杜尔贝科的修改鹰培养基培养细胞(DMEM,英杰公司)补充20%胎牛血清(的边后卫,Hyclone)和维持在37°C和5%的公司₂(如[37])。房颤细胞通道在70% confluency每2 - 3天,用0.05%胰蛋白酶/ EDTA(表达载体)1:3分流比。

生成AF-derived单细胞克隆(37),单个细胞悬液是由温柔的胰蛋白酶化,和个人AF细胞沉积一个细胞每口井的96孔板,包含100 uL的DMEM + 20%的边后卫,使用MoFlo细胞分选仪(贝克曼库尔特)。一旦文化成为70%汇合的,克隆亚文化第一次进24-well盘子,其次是6-well板块(Nunc),并最终成10厘米文化板块(康宁),使用上述条件。净化c-kit-positive AF细胞AF文化,分离单个AF细胞被沾染了C - kit抗体(圣克鲁斯,sc - 5535) 30分钟在4°C,如前所述[14]。潜伏期后,细胞被洗两次冷2%的边后卫在PBS和孵化30分钟与次要藻红蛋白- 4°C (PE)共轭抗体。细胞随后被洗,resuspended在寒冷2毫升2%的边后卫在PBS,透过70μm滤波器,分析了使用MoFlo细胞分选仪(贝克曼库尔特)。克隆(AF-F5)此后c-kit-positive AF细胞扩大连续分流比为1:3和含有20%的边后卫在DMEM培养建立AF-F5 single-cell-derived克隆,c-kit-positive AF的细胞群。

老鼠大脑皮层祖细胞从E13心室分离区,镀上PLL-coated盖玻片(9×10⁵活细胞在DMEM /毫升)+ 10%的边后卫,镀后24小时内检查,如前所述[38]。大脑皮层神经元产生神经祖细胞通过减少血清浓度(即。,0.5% FBS) during the first 24 hrs, followed by treatment with DMEM + N2 supplement to limit the generation of glial cells. Medium was replenished every 48 hrs for 7 days. Astroglial cultures were generated from E13 neural progenitors (0.5–5 × 10⁵活细胞在DMEM /毫升)培养+ 10%的边后卫。媒介是补充每48小时3周,细胞通过几次消除神经元的文化(38]。生成混合文化的皮层神经元和星形胶质细胞,E13神经祖细胞在DMEM维护+ 10%的边后卫没有使了两周。

NT2-D1祖细胞(写明ATCC)在DMEM培养(表达载体)媒体补充10%的边后卫(Hyclone)。纯粹的文化NT2-derived神经元(NT2-N)准备如前所述39]。HaCaT细胞被慷慨的礼物从图博士Turksen (Sprott干细胞研究中心,渥太华,加拿大)和在DMEM培养(表达载体)补充10%的边后卫(Hyclone)和分裂每2天。

2.2。RNA提取和rt - pcr

从细胞总RNA提取,使用TriReagent(分子研究中心),如前所述[37]。总RNA与NanoDrop量化(热费希尔科学),和1μg是反向转录使用Quantitect逆转录酶(试剂盒)。rt - pcr扩增进行使用智商Supermix (Bio-Rad) 20μL卷包含5μM和反义引物(表1),15 ng的互补。PCR程序由一个变性步骤3分钟在94°C,其次是30秒94°C, 30秒55-58°C,在72°C和30秒40周期。最后PCR伸展期5分钟在72°C。PCR产品和1 kb梯(表达载体)分离溴化乙锭2%琼脂糖凝胶,和图像捕获FluorChem 8900成像仪(αInnotech)。证实了扩增子的大小与梯子(表达载体)。预期扩增子大小如表所示1。B-ACTIN(ACTB)被用作基因正常化。NT2 / D1、HaCaT NT2-neurons (NT2-N)作为积极的控制。

2.3。抗体

以下抗体被用于这项研究:β肌动蛋白(WB 1: 5000年,σ),Cx43(1: 500年,国际商会;世行1:4000年,国际商会,σ),Cx26(1: 100年,病菌),GFAP(1: 200年,国际商会,NeoMarkers), GFAP(1: 200年,国际商会,DAKO) golgin - 97(1: 200年,国际商会、分子探针),MAP2(1: 200年,国际商会,σ),人类的核抗原(1:100年,国际商会,antibodies-online),人类线粒体标记(MTCO2) (1: 50, ICC Abcam), c - kit抗体(流式细胞仪1:100年,圣克鲁斯sc - 5535),和fluorescence-conjugated二级抗体(Alexa萤石488 anti-rabbit或鼠标,罗丹明anti-mouse和Alexa 647 anti-mouse, 1: 500年,分子探针)。赫斯特(1:1000年,σ)是用来染细胞核。

2.4。西方墨点法

细胞被洗冷TBS和细胞溶解在培养板中直接使用冰冷的裂解缓冲(25毫米Tris-HCL, pH值7.6,150毫米氯化钠,Triton-X 1%, 1%钠脱氧胆酸盐),含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏)。细胞溶解产物在冰上孵化了30分钟,由离心澄清在4°C 000×20 g 20分钟。蛋白质样品(40 ug)和分子量的彩虹标志(Amersham)在10%的钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和转移到硝酸纤维素(Amersham),使用湿传输装置(Bio-Rad)在20 V一夜之间在4°C。细胞膜在TBS孵化包含5%脱脂乳0.1% Tween-20(σ)1小时在室温下阻止非特异性结合,然后孵化在初级抗体在一夜之间在4°C。膜被洗了三次10分钟TBS含有0.1% Tween-20和孵化peroxidase-conjugated二级抗体室温1小时。免疫反应性是可视化,使用化学发光底物(新英格兰核)和被FluorChem 8900(αInnotech)。

2.5。免疫细胞化学

细胞生长在盖玻片,用PBS,包含0.15 M氯化钠和65%乙醇固定20分钟(37]。染色与人类核抗原,细胞与3%多聚甲醛固定5分钟,用PBS洗两次,20分钟的permeabilized Triton-X 0.2% PBS (pH值7.0)。固定后,盖玻片被封锁与serum-free-protein块(Dako) 30分钟,1小时在室温下的孵化主要抗体。每三个后续洗(5分钟)在PBS,盖玻片是孵化fluorescence-conjugated二级抗体为1小时,洗,counter-stained赫斯特(σ)。盖玻片上,使用Vectashield安装介质(向量实验室),和免疫反应性Axiovert 200荧光显微镜下检查(蔡司)和共焦显微镜(奥林巴斯)。

GFAP、Cx43和赫斯特染色部分包含AF-DsRed植入细胞,Alexa 488年和647年Alexa被用作二次抗体可视化Cx43、GFAP分别。此外,不同的过滤器集用于赫斯特(励磁365,420年发射)和AF-DsRed细胞(励磁546年发射575)。一个单独的图像获得荧光团(赫斯特,Alexa 488,安全域和Alexa 647),用激光扫描共焦显微镜(奥林巴斯FluoView BX61显微镜),和四个图像叠加,使用Adobe Photoshop。

房颤顺序四染色的细胞与Cx43、GFAP、人类的核抗原(hNuc)和赫斯特,细胞首先沾Cx43 hNuc抗体,洗,preincubated鼠标Ig阻塞试剂(矢量实验室)减少不受欢迎的绑定之后的抗体为检测GFAP染色。与赫斯特被复染色的细胞。

2.6。染料耦合

染料耦合实验来评估个体AF细胞间的缝隙连接的功能和其他文化或房颤细胞小鼠神经祖细胞,神经元,星形胶质细胞,如前所述[39,42]。简言之,房颤细胞被加载了两种染料:0.1% 1 - 1′-dioctadecyl-3, 3, 3, 3-tetramethylindocarbocyanine percholate (DiI英杰公司)和0.1% calcein-acetoxymethyl酯(钙黄绿素点,表达载体)20分钟在37°C。DiI亲脂性的染料,与细胞膜结合,而不是转移到相邻的细胞,用于标签供者细胞。钙黄绿素是在membrane-permeant形式被供者细胞和水解钙黄绿素细胞酯酶(MW = 623)。裂后,钙黄绿素容易转移到相邻的接收细胞通过缝隙连接通道。DiI和calcein-loaded细胞用等渗葡萄糖溶液洗净去除过多的染料和分离成单个细胞悬液,在trypsin-EDTA孵化后(表达载体)2分钟。加载单AF细胞被镀上文化房颤或鼠标皮质神经祖细胞,神经元,星形胶质细胞,染料耦合评估后4小时。耦合的水平是由计算calcein-positive, DiI-negative细胞耦合calcein-positive, DiI-positive细胞,数据提出了均值±SEM。

2.7。刮伤伤

如前所述(接受刮伤手术治疗43]。短暂,刮伤损伤应用于汇合的皮质盖玻片上的培养,使用21^1/2G针(0.8毫米直径)来创建一个伤口。培养基的细胞被洗了三次,固定ETOH 65% + 0.15 M氯化钠没有损伤,或15分钟,24小时、48小时、72小时后受伤。在某些实验中,房颤细胞被镀上皮层文化受伤之后,和cocultures固定在上述时间点。AF细胞执行与EGFP的标签,如前所述[37]。

2.8。运动皮层脑损伤

脑损伤研究动物保健委员会批准加拿大国家研究委员会。简单,流行黑色C57小鼠(C57Bl / 6,查尔斯河)重约25克与异氟烷麻醉(Aerrane,巴克斯特)和放置分成相等的组:与细胞注射或植入损伤或无损伤。在受伤之前,老鼠放在一个立体定位框架,和一个中线切口皮肤暴露头骨。骨头上覆牙钻的运动皮层被映射后,使用特定的立体定位坐标(从“美联社−−1.0毫米0.25毫米,Lat + 0.7毫米”,到“AP + 1.25毫米到3.0毫米,Lat + 2.4毫米”)对前囱(0毫米),(如前所述44]。受伤向左运动皮层进行使用无菌针去除神经组织毕业1毫米的深度。受伤的网站是用骨蜡封起来的,覆盖着局部麻醉(0.50% marcaine bupivacaine盐酸,σ),和皮肤缝合。

房颤细胞移植研究设计来表达域由慢病毒感染巨细胞病毒启动子驱动(Tet07-CMV-DsRed)注入三个站点内的运动皮层(100000细胞2μ每注射L (PBS),使用10μL汉密尔顿注射器,由输液泵控制在一个恒定的速度(0.5μL / min) / 4分钟。注射器在地方举行了5分钟,然后逐渐撤回。术后,骨蜡用于密封注射部位皮肤缝合。

动物们在笼子里被允许恢复,牺牲了2周后。大脑被移除和加工,如下所述。动物牺牲后12天,大脑灌注,并与4%多聚甲醛固定在PB一夜之间,洗两次PB和转移到30%的蔗糖PB 2天。大脑被冻结在O.C.T.化合物,分为8μ1950片(徕卡厘米)。在染色之前,部分是在室温下解冻了15分钟,洗了三次(每5分钟)在PBS,和应用,如前所述。注入AF细胞被确定基于安全域表达式(AF-DsRed)。

3所示。结果

3.1。房颤细胞主要表达联接蛋白43 (CX43)

建立联接蛋白表达在房颤的细胞,我们进行rt - pcr检查连接素的表达通常表示在大脑中(CX26、CX30 CX32, CX36、CX37 CX40 CX43,CX45)。我们的结果表明,房颤细胞广泛表达CX43(GJA1),CX45(GJA7)在妊娠期检查(AF15-AF35)(图1(A))。的表达CX30,CX32,CX36,CX37,或CX40没有检测到任何的妊娠期检查(数据未显示),而CX26(GJB2)RNA表达在大多数妊娠期(图1(一))和CX26蛋白质只存在于一小部分AF细胞文化(图1(C), (g) - (h))。连接素的表达,CX43 AF细胞中最丰富的蛋白质,是由免疫印迹和免疫细胞化学(图1(B)和1(C),(一)- (f))。类似于其他连接素,CX43组装成连接素的反式高尔基网络和运输同细胞的细胞膜,相邻hemichannels码头斑块形成缝隙连接(45]。事实上,我们发现了一个细胞内池CX43的细胞核周围的高尔基体,证实了反式高尔基体膜蛋白网络golgin在AF - 97阳性染色细胞(图1(C), (a) (b))。随后,CX43从高尔基体转移到细胞膜(图1(C), (C) - (d))和动态过程中会形成离散的相邻细胞间的缝隙连接,根据不同的点状的染色观察个体之间的信息边界AF细胞(图1(C)、(e) - (f))。这一特点没有观察到CX26在房颤细胞蛋白表达仅限于细胞核周围的区域(图1(C), (g) - (h))。

为了研究缝隙连接的功能,我们预加载个人AF细胞有两个染料(DiI和钙黄绿素)(39,42)和镀到AF细胞的融合性的文化。染料耦合,符合功能性缝隙连接的存在,是由钙黄绿素标记AF细胞转移到得分4小时after-plating接受者AF细胞。耦合在平均SEM calcein-positive受体细胞耦合到一个DiI-positive标记细胞(图1(D) (f))。

3.2。CX43表达c-kit-Positive和Single-Cell-Derived克隆AF细胞群

鉴于AF细胞的异质性(37),我们使用了两种建立协议生成一个基于单细胞克隆更多同质细胞群(37)和c - kit表达(14),如前所报道。因此,我们生成single-cell-derived克隆AF (AF-F5)和c-kit-positive AF (AF-c-kit,图2(一))细胞群,发现类似的RNA表达谱CX43和CX45(图2(B))和蛋白质为CX43表达(图2(模拟),(C))。染料转移实验进一步证实了缝隙连接的功能形成AF-c-kit(图2(D) (a - c)和AF-F5(图)2(D)、(d-f))文化相似程度上面观察(数据没有显示)。因此,AF-F5细胞用于所有后续实验。

3.3。房颤细胞之间的细胞间通讯和皮质文化

CX43表达被认为是最无所不在地联接蛋白家族的成员在哺乳动物的大脑,在大脑发育尤其是神经祖细胞和星形胶质细胞46]。因此,我们试图确定AF细胞保留CX43表达和功能与皮层细胞缝隙连接在cocultures,特别是与已知皮质祖细胞和星形胶质细胞表达高水平的CX43 [46)(图3(一)-3和(b))3(c) -3(f),职责)。实际上,当AF细胞被播种在皮质文化,CX43检测房颤细胞之间的信息边界和GFAP-positive皮质星形胶质细胞(数据4(一)-4(c)),箭头)。并行cocultures, AF细胞区别于老鼠大脑皮层细胞,使用人类特定的核抗原(hNuc)(数据4(d) -4(我))或在某些情况下人类线粒体抗原(见图6)。四染色证实,皮层细胞,这与房颤细胞缝隙连接形成,GFAP-positive星形胶质细胞(数字4(g) -4(我))。有趣的是,AF细胞单独培养时,CX43表达主要是细胞质和细胞核周围的(图1(C)、(模拟));然而,房颤与皮质细胞cocultured文化显示出更多膜结合CX43邻皮质星形胶质细胞(图之间的染色4(c),4(f)4(我),箭头)。即使在皮质神经元的存在,绝大多数CX43表达观察AF细胞之间的边界和GFAP-positive星形胶质细胞(数据5(一)-5(b)),箭头);而微不足道的Cx43蛋白质观察AF细胞和神经元之间的接口和神经突AF细胞膜(数字5(一)-5(b)),箭头)。虽然染色结果表明,房颤细胞保留CX43表达调解与靶细胞缝隙连接形成,我们进行染料转移实验(正如前面列出的)确认功能AF细胞间的缝隙连接形成和细胞间连接和皮质文化。在平均耦合观察SEM calcein-positive受体细胞耦合到一个calcein-positive, DiI-positive捐赠者AF细胞(图4小时后5(c) -5(e))。值得注意的是,在早期皮质文化(2天在体外),房颤细胞能够建立与不成熟的大脑皮层神经元功能沟通表达更低水平的CX43(数据未显示);然而,功能之间的沟通主要是观察AF细胞和皮质星形胶质细胞在以后的文化(数字5(c) -5(e))。支持这一观点,Cx43蛋白表达后已经大幅减少神经元分化(39,47]。

3.4。Cx43表达在受伤

反应脑损伤,星形胶质细胞增殖并渗透到受损区域,以保护神经组织和限制炎症(48]。由于Cx43星形胶质细胞和房颤的主要蛋白质表达细胞,导致功能差距交界细胞间的沟通,我们对房颤细胞与宿主细胞之间的相互作用在体外和在活的有机体内脑损伤模型。更具体地说,我们使用了一个在体外刮伤模型使用皮质文化,良好的模型探讨病患对机械损伤(49),以及一个在活的有机体内手术引起的脑损伤模型针对初级运动皮层(50]。

皮质星形胶质细胞Cx43表达丰富的水平(数字6(一)和6(b))。尽管星形胶质细胞保持Cx43表达scratch-induced受伤后,他们没有展示能力修复伤口在第一个24小时(数字6(c)和6(d))。事实上,神经胶质过程已被证明与星形胶质细胞伸出到受伤的区域填充受伤后(约72小时的差距51]。相比之下,房颤细胞播种到受伤的皮质文化15分钟后抓能够坚持剥蚀区和促进修复在24小时(数字6(e) -6(f)),箭头)。为了确认播种房颤与皮质星形胶质细胞细胞能够重新建立连接,通过Cx43-mediated缝隙连接形成,我们标记AF细胞与人类线粒体抗体(hMito)和检查CX43表达房颤和皮质细胞(数据之间的关系6(g) -6(k))。CX43表达是容易AF细胞之间的边界和皮质星形胶质细胞(图6(k))。补充这些实验中,我们进行了现场试验,通过培养GFP-tagged AF细胞损伤和确认后房颤细胞容易充满了受伤的网站,导致伤口关闭(数字6(l) -6(n))。

使用小鼠模型的脑损伤,运动皮层受伤,如前所述44,50),导致腔形成的组织损伤和细胞死亡,随后在受伤后(数字7(b),7(d)7(f))相比,假(受伤)的大脑(数字7(一),7(c)7(e))。相比,神经元和星形胶质细胞在大脑控制的组织架构(图7(e)),受损皮层神经元的损失重大(大约从350000年共有210000个神经元细胞),混乱的神经突扩展和星形胶质细胞的一个重要渗透到受伤部位(图7(f))。自从星形胶质细胞表现出高度的耦合通过缝隙连接,主要由Cx43 [52),我们检查Cx43的免疫组织化学分布在大脑受伤。的确,相比大脑受伤(数据8(一)和8(c)),丰富的检测到了Cx43含量在损伤部位的周长(数字8(b)和8(d))。半定量的免疫组织化学证实Cx43增加(40%)和GFAP表达(65%)在受损的运动皮层(数字8(f) -8(g)),而虚假的大脑中相应的区域(图8(E))。地区强烈的Cx43 puncta特别观察星形胶质细胞在靠近受伤站点(数字8(f) -8(g))。Cx43的upregulation提高了细胞间的沟通在大脑深处,促进有益因素的交付受伤的大脑。

确定缝隙连接形成房颤和皮层细胞之间在活的有机体内因此保持平移相关性,我们植入AF细胞贴上安全域(AF-DsRed)受伤的运动皮层(数字9(一)-9(b))。Immunohistological分析显示丰富Cx43表达在植入区,由安全域和Cx43(数字9(c) -9(d)),而没有发现AF-DsRed细胞在侧端没有收到受伤/植入的细胞(图9(a))。在植入后12天,大多数AF-DsRed细胞位于损伤注射部位和针跟踪(图9(c)),伴随着CX43表达周围的注射部位。事实上,Cx43表达观察AF-DsRed交界处和邻近的细胞,在较高放大(图9(d))。虽然房颤的长期结果细胞植入到运动皮质损伤模型尚未检查,皮质星形胶质细胞和房颤细胞之间丰富的Cx43表达表明细胞间通讯和潜在重建AF细胞移植后神经回路。

4所示。讨论

中枢神经系统中的功能移植的发展受到的潜在缺乏细胞间移植供体细胞和宿主组织之间的沟通。因此,预计提高connexin-mediated细胞间缝隙连接形成会导致改善主机和移植细胞间的信息交流,提高移植成功率。因为房颤细胞吸引了大量的关注作为一种替代的供体细胞来源的细胞疗法,我们检查了他们的潜力,形成缝隙连接,发现房颤细胞CX43表达丰富水平。使用行之有效的方法来隔离同质c - kit和single-cell-derived AF细胞克隆,我们证明了CX43可能扮演重要的角色在细胞间这些细胞之间的沟通。这些结果符合CX43的表达在胚胎干细胞(53)和其他细胞系具有干细胞特征如NT2 / D1 (42]和P19 [54)细胞。这并不奇怪,结果几个实验室建立了CX43是最普遍的联接蛋白蛋白质在脊椎动物(见[55]审查)。Cx43表达至少34组织和46个细胞类型(56,57),它也扮演着关键的角色在协调组织功能和细胞内稳态。

在大脑中,Cx43高度发展中皮层表达和维护它的表达在皮质星形胶质细胞在成年期(55,58,59]。活跃在星形胶质细胞缝隙连接的存在允许葡萄糖和氧气的规定交付神经元活力和代谢需求(60,61年]。例如,Cx43介导转移乳酸星形胶质细胞和神经元作为能源基质,促进突触活动的合成神经递质(61年,62年]。同样,血液中的葡萄糖和氧气的输送到大脑是通过一个星形网络监管,证明这是依赖Cx43淘汰赛实验(61年]。因此,无处不在的CX43表达AF细胞也使这些细胞适合作为平台提供有益的因素与大脑细胞通过直接沟通。房颤细胞可以帮助调节炎症信号和缓冲病理刺激后的大脑损伤以及其他神经系统疾病。CX43的快速亚细胞易位从细胞核周围的隔间AF细胞和星形胶质细胞之间的膜边界可能提高稳态状态的重建后的大脑损伤。有趣的是,CX43也被观察到的边界AF和心脏的细胞,移植到心脏(后63年),进一步支持的应用AF细胞再生医学通过缝隙连接功能的形成。

变化在两个时空CX43蛋白表达后看到各种类型的中枢神经系统疾病如缺血、神经退行性疾病和创伤性损伤(64年]。在脑损伤的渗透Cx43-positive反应性星形胶质细胞很容易观察到在受伤的核心65年]。CX43表达的诱导是实质因素astroglial反应和强化通过缝隙连接细胞间信号转导后损伤(33,65年]。符合这些观察,我们发现Cx43表达在星形胶质细胞的损伤。受伤后,CX43表达的增加在星形胶质细胞的数量,因此缝隙连接斑块形成于相邻细胞之间的接口可能促进与移植细胞的缝隙连接的形成植入靠近受伤的网站。因此,通过引入AF细胞,CX43的表达通过移植物与宿主细胞之间形成缝隙连接,将援助建立AF和中枢神经系统细胞之间的交流提供有益的因素和药物。GJIC之间移植神经干细胞(NS)细胞和脑细胞33)似乎是一个不可或缺的参与者与NS相关的神经保护效应细胞移植,特别是在connexin-associated缝隙连接接口。利用NS细胞移植到一个体外纹状体组织模型系统,Jaderstad et al。66年]发现CX43表达了短暂在宿主细胞达到顶峰后创伤性刺激,建议一个机会之窗NS细胞与宿主建立缝隙连接组织和救援受损的细胞。因为房颤细胞表达高水平的CX43并形成功能性缝隙连接,他们有能力模拟类似connexin-mediated救援在这个关键的时间框架。事实上,防止受损的细胞死亡已成为细胞移植(可能的好处之一1,2,25]。此外,信息耦合一直被视为一种早期的沟通之前,作为一个模板来建立电化学突触后(33]。在这种情况下,植入AF细胞CX43表达可能形成gap-junctional耦合与星形胶质细胞可能在受伤部位保护神经元。支持这一观点,星形胶质细胞在神经保护的早期阶段的作用是获得更多的认可,和初始AF-astrocyte交互可能发挥重要作用在早期阶段graft-host互动(33]。这个概念被发现进一步证实在体外,这证实星形Cx43缝隙连接和hemichannels可能损伤和保持功能开放在活的有机体内工作,这表明显著变化在两个时空Cx43表达各种型号后中枢神经系统损伤了(67年])。

还有待阐明星形缝隙连接是如何导致神经保护在再生医学的背景下。因此,进一步研究细胞间房颤与宿主细胞之间的沟通可能会促进这些细胞用于治疗目的的使用。

确认

作者要感谢朱莉Haukenfrers,艾米Aylsworth,玛丽亚Ribecco,布兰登·史密斯和约翰·Bechberger技术援助。答:Jezierski加拿大卫生研究院资助的研究(CIHR)和安大略研究生奖学金(og)。

引用

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