克隆种群的羊膜细胞稀释和直接电镀:证据隐藏的多样性gydF4y2Ba

文摘gydF4y2Ba

胎儿细胞被广泛认为是一个优良的再生医学细胞来源;胎儿细胞显示更高的增殖能力和经历更少的重复的周期,可能产生自发突变。胎儿羊水细胞主要是第一批正常细胞体外培养,但羊水的定义组成为再生应用程序阻碍了进步。我们首先开发了一种高效的方法来产生克隆种群羊膜穿刺术的稀释样品在媒体和直接电镀没有干预制冷,离心,或者暴露在混合细胞培养细胞旁分泌作用。40多克隆种群恢复4羊膜穿刺术样品和代表克隆被流式细胞术的特点,常规化验分化潜力,免疫荧光成像,和记录分析。结果显示以前未报告的基质和上皮细胞类型之间的差异,确定独特的细胞类型,可能会丢失或未被发现的混合细胞群。羊膜细胞的分化潜能被证明是分道扬镳的表达明确的细胞表面或细胞质基质和上皮细胞的标记。证据基质之间的差异和上皮细胞在羊水熊解释应用于分子和羊膜细胞群的功能测试。gydF4y2Ba

1。介绍gydF4y2Ba

再生医学的使命是修复或替换受损的组织和器官创伤、疾病或衰老与生活的生物工程组织恢复功能(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。在再生的细胞来源的应用程序之间,基质细胞得到了越来越多的兴趣。基质细胞,也被称为多功能基质细胞或msc,已从几乎所有成人孤立和产后组织和器官gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。最近的研究集中于使用基质细胞的细胞输送系统营养因素来修复损伤和免疫调节活动抑制炎症的破坏性影响,自身免疫,移植物抗宿主病(GVHD)会导致器官和组织移植排斥的(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。胎儿msc可能优于其它来源的msc对增殖能力(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。胎儿细胞可以获得与微创方法在常规羊膜穿刺术(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba),轻松转换到体外培养(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。然而,羊膜穿刺术样品是复杂的混合物从胎儿和胎盘表面排泄出来的细胞暴露于羊水(gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。标准细胞疗法需要细胞群,满足安全性和有效性标准(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。整合羊膜细胞再生应用将更好地了解先进的复杂性在羊膜细胞群和羊膜穿刺术样本之间的差异不同的捐赠者。gydF4y2Ba

羊膜细胞异同点,已经很大程度上细胞形状分类。羊膜细胞克隆首次分离近4年以前克隆环和分类的基础上,菌落形态、看到Hoehn和沙克(1982)的审查(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。f型殖民地由“主轴——”形状的纤维母细胞形成致密、多层让人想起汇合的基质细胞培养的殖民地。e殖民地由“类上皮细胞与光滑的利润率和并列单元边界。AF-type殖民地从羊水是最常见的群落类型,代表~在一个研究中,70%的殖民地和被认为是特定于羊水。房颤殖民地由纤维母细胞周围径向排列密集的无定形的细胞聚合,耐酶生成单个细胞的方法。尽管目前尚不清楚AF-colonies反映独有的细胞类型羊水细胞培养方法,这些开创性的研究奠定了体外培养的细胞从羊水和提供了第一个被广泛使用的正常来源,而不是改变,细胞生物医学研究。gydF4y2Ba

当前的标准评价基质细胞身份和功能都是基于从骨髓msc。这些BMMSCs是最好的研究基质细胞和目前正在临床试验治疗一些疾病(gydF4y2Bahttp://www.clinicaltrials.gov/gydF4y2Ba)。BMMSCs来源于骨髓送气和坚持塑料文化商品,与造血的骨髓衍生品增殖悬浮(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。细胞治疗的国际社会建立了标准分配BMMSC身份(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba),包括坚持塑料,分化成脂肪间充质血统,骨,软骨,和表达的细胞表面标记endoglin或CD105,星质5′核苷酸酶或CD73和Thy-1或CD90。超过95%的细胞必须表达这些标记,尽管绝对或相对的可以接受的水平表达尚未建立。这些标准之间的关系为基质细胞身份和基质细胞的潜在治疗性质尚不清楚,部分原因在于表达相关,而不是病因,因为最终的细胞表面抗原并不是唯一的基质细胞。突出的问题包括是否基质细胞群的不同表达BMMSC-definitive标记和表达谱是否分化潜力的预测。gydF4y2Ba

羊水细胞的多样性关系的解释分子分析和功能测试,因为结果可能反映了添加剂的影响一个或多个细胞类型。的上皮细胞和基质细胞在羊膜细胞培养在大多数报道(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba22gydF4y2Ba但不是所有的研究[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。上皮细胞已经指出快速消失在传播的混合细胞培养(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。羊膜细胞培养获得统一的基质细胞外观(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba这可能反映了上皮细胞的复制衰老[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。失去上皮细胞在文化也可以反映上皮间充质转变(EMT),上皮细胞的分子途径成为基质细胞与免疫反应性的概要文件和分化潜力,预计msc (gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。羊膜细胞群的复杂性可以通过克隆种群的分析。克隆的数量已建立羊膜细胞克隆环(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba),immunoisolation细胞表达的受体斯蒂尔因素或CD117 [gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba),预先制定的文化生成单个细胞酶治疗后通过限制稀释(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba这些方法[],变体gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]。在每种情况下需要大量的工作产生克隆和羊膜细胞暴露于旁分泌信号混合细胞群在隔离。gydF4y2Ba

这项工作的最初的目标是开发一种有效的方法来建立独立的克隆从无教养的羊膜穿刺术样品用最小的操作和没有体外扩张混合细胞群。我们进一步问及克隆种群的基质和上皮细胞从BMMSCs不同于对方。克隆的特点是相显微镜、流式细胞术、体外分化,以及高分辨率的免疫荧光成像。结果显示表型和功能上不同的基质细胞克隆,第一次克隆种群的长寿的上皮细胞。我们的研究结果表明,羊膜细胞不需要镜子的分化潜能的细胞表面标记物的表达其他BMMSCs羊膜细胞克隆或表达谱。我们表明,克隆的羊膜基质细胞和上皮细胞可以共享几乎无法分辨的细胞表面标记和coexpress上皮和间质细胞的胞质标记,但在脂肪形成的不同和成骨的潜力。分析多个nonclonal混合来自不同捐赠者的细胞群的高分辨率成像识别大多数,但不是全部,相同的克隆种群的细胞类型和显示清晰的混合细胞群之间的差异。综上所述,我们的研究结果揭示羊膜细胞之间的差异,提高问题的来源。gydF4y2Ba

2。材料和方法gydF4y2Ba

2.1。细胞培养gydF4y2Ba

羊膜穿刺术样本与通知书面同意捐赠,机构审查委员会批准的维克森林大学健康科学(2008)和鉴定进行研究。母亲的年龄、妊娠期进行羊膜穿刺术,或基因检测的结果不批准披露。gydF4y2Ba

之前所有羊膜穿刺术样品在室温下保存细胞培养。样品用于推导混合细胞群被稀释1:1 - 1:2血清1或2井的媒体和镀6-well板。样品用于获得克隆种群被稀释如表所示gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和分布在一个或多个24-well盘子。媒体和任何不依从细胞经常结合大约一半体积的新鲜的媒体,转移到新的盘子后48 - 72小时,并丢弃后另一个72到96小时,允许细胞共5天到7天坚持文化产品。细胞通常保持在常的媒体控制gydF4y2Bamem补充15%的边后卫,1%谷氨酰胺和1%的青霉素和链霉素,18% Chang B, C和2% Chang(欧文科学)。细胞培养都维持在37°C公司为5%gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在湿润的孵化器。媒体组件从Gibco /英杰公司除非另有规定。组织文化的商品(BD猎鹰)没有使用细胞外基质蛋白除了盘子用于分化潜力如下详细的分析。gydF4y2Ba

主要subconfluent文化通道,需要保持健康的人群。细胞通过与Accutase稀释1:4钙和magnesium-free杜尔贝科的磷酸缓冲盐(DPBS)与标准方法。克隆种群的单井24-well板是保持独立的行。最大数量扩张通道进入另一个文化卷:从24井35毫米井或60毫米板块扩张到100毫米板之前和/或低温贮藏。混合细胞群来自单个样本收获了酶治疗,汇集,低温贮藏在多个整除长期储存在液氮的标准方法。gydF4y2Ba

BMMSCs扩大从cryofrozen单核细胞是来源于人类骨髓(Lonza 2 m - 125 C)。Cryovials被解冻gydF4y2Bamem heat-inactivated的边后卫媒体补充10%,1%谷氨酰胺,1%青霉素和链霉素治疗的15厘米文化菜肴。一些细胞附着在几天后和独立的细胞被丢弃在第一媒体改变。连接细胞常被扩大在媒体更好的支持持续增长和简化的媒体准备。BMMSCs在早期通过冷冻小整除和解冻。gydF4y2Ba

2.2。成像和免疫细胞化学gydF4y2Ba

细胞在多井传播组织文化板块在盖玻片或多井Permanox室幻灯片(Nunc)免疫染色。样本洗杜尔贝科的磷酸缓冲盐(DPBS)和2%多聚甲醛固定~ 20分钟在DPBS (EM科学)。固定剂是由新鲜的稀释16%多聚甲醛和冷冻在整除-80°C。整除的固定剂解冻在需要的时候,使用一次,然后丢弃。固定后,细胞简要洗两次DPBS有或没有~ 0.1% (v / v) Triton-X和0.1% (v / v) Tween-20(σ)透化作用。细胞经常阻塞~ 30分钟在阻断缓冲区包含3%牛血清白蛋白(BSA分数IV,杰克逊Immunolabs) DPBS有或没有适当的清洁剂。细胞培养与主要抗体阻断缓冲区在室温下(RT) ~ 1小时,然后洗了30分钟。二次抗体阻断缓冲区的申请至少一个人力资源在RT或一夜之间在4°C。主要为免疫荧光抗体用于以下稀释:AE1 / AE3 DAKO (1: 100);波形蛋白(1:100)和纤连蛋白(1:100)圣克鲁斯,N-cadherin Pharmingen (1: 100)。 Alexa Fluor conjugated secondary antibodies (1 : 1,000) were obtained from Invitrogen/Molecular Probes.

彩色样本洗前和安装在延长黄金+(分子探针)安装媒体包含4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)查看。除非特别指出,否则大视场图像捕获与Image-Pro软件使用打印大师CCD相机直立安装在徕卡显微镜使用20 x干客观(NA 0.40)并导入到Photoshop。疣状在至少2技术复制和重复超过3独立试验每一个标记/组合测试。本文中显示的图片是代表;结论是基于至少3视图为每个领域超过100细胞的复制和检验。gydF4y2Ba

2.3。流式细胞术gydF4y2Ba

细胞流式细胞术的酶处理Accutase生成单细胞悬浮体。细胞通过离心收集在300年gydF4y2Ba在DPBS g 5分钟,洗一次,再次被离心分离和收集。细胞颗粒resuspended约200gydF4y2Bal(论文之前直接稀释DPBS 20毫升的2%多聚甲醛。细胞被固定为20分钟温柔的摇摆,离心收集的如上所述,在DPBS洗一次,立即使用或储存在4°C。之前染色流式细胞术,离心收集的细胞,然后在阻断缓冲区resuspended 30分钟。细胞悬浊液阻碍缓冲过滤了40gydF4y2Bam网格篮子消除细胞团,然后分发到个人15毫升为疣状锥形管。细胞染色与fluorochrome-conjugated鼠单克隆抗体或同形像匹配控制抗体阻断缓冲区中至少1小时临时房间。细胞被洗DPBS和resuspended ~ 300的两倍gydF4y2Ba流式细胞术分析l阻断缓冲区。gydF4y2Ba

Fluorochrome-conjugated抗体稀释在阻断缓冲区作为推荐的供应商:CD90异硫氰酸荧光素或FITC(微孔),CD90 Allophycocyanin或APC (BD Pharmingen)、CD105 Alexa萤石647 (BD Pharmingen)、CD105 FITC, (BD Pharmingen) CD73 APC (BD Pharmingen) SSEA4 Alexa萤石647 (BD Pharmingen), CD44 FITC (BD Pharmingen)和CD29 Alexa萤石488(分子探针/表达载体)。同形像统计图从BD Pharmingen获得的控制。人群被封闭的只包括活细胞和排除背景染色,可以归因于非特异性染色的同形像抗体控制。数据是基于每个标记检测10000个事件。执行数据收集与FACSCalibur (BD生物科学)流式细胞分析仪和结果导入到FlowJo 7.6.4进行分析和表示。gydF4y2Ba

2.4。脂肪形成的和成骨分化gydF4y2Ba

健康的细胞培养~ 90%融合在cultureware Chang的媒体使用1:300稀释growth-factor-reduced基底膜基质。媒体随后转向gydF4y2Bamem补充的边后卫和成骨的代理[0.1 10%gydF4y2BaM地塞米松,10毫米gydF4y2BaβgydF4y2Ba甘油磷酸,50gydF4y2Ba抗坏血酸2-phosphate]或脂肪形成的[1gydF4y2BaM地塞米松,5gydF4y2Bag / ml胰岛素,0.5毫米isobutylmethylxanthine (IBMX), 60gydF4y2BaM吲哚美辛)分化(gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。媒体没有分化补充剂作为消极的控制,所有媒体交换每3 - 5天。骨生成和脂肪生成评估与茜素红和石油红色的o染色,分别使用标准组织化学的方法。每个细胞分化人口至少2试验超过3技术复制,使用相同的未分化的细胞培养板为控制和BMMSCs正面和负面的控制,分别。gydF4y2Ba

2.5。记录分析gydF4y2Ba

总RNA提取与DNAse RNAeasy工具包(试剂盒)治疗消除基因组DNA根据生产方向。RNA被转换为互补脱氧核糖核酸与上标三世第一链合成工具(表达载体)。TaqMan葡萄糖醛酸酶的基因表达分析被用来检测记录gydF4y2Ba(Hs00939627 GUSB)钙粘蛋白(背景)Hs01023894和N-cadherin (CDH2) Hs00983056。平均Ct值的复制化验和平均归一化的表达GUSB,内部控制是包含在所有的实验。gydF4y2Ba

3所示。结果gydF4y2Ba

3.1。稀释和直接电镀的无教养的羊膜穿刺术样本gydF4y2Ba

离心通常用于细胞集中在羊水和最小化稀释的媒体,但还不清楚这是否恢复操作是必要的可行的羊膜细胞群。新孤立小于2.0毫升的羊水样本稀释1:1或1:2血清媒体和直接镀在个别井的6-well tissue-culture-treated盘子。早在72年第一个48小时电镀,几贴壁细胞在每个样本中发现。这些数量,指定为ChM混合细胞群,在几天内被扩展到更大的文化产品。几乎所有主要的文化扩展层。随后使集中与胰蛋白酶生成殖民地位于聚合,让人想起AF-type殖民地在开创性的工作的描述gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。很少有例外,文化通过与Accutase扩展层没有聚合形成,表明聚合形成可能反映了细胞培养的方法,而不是一个特定功能的一类独特的羊水细胞(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。一起这些发现表明,复苏的细胞浓度是不必要的增殖细胞和血清的浓度减少~ 1:1 - 2并不排除细胞吸附和扩散。gydF4y2Ba

我们下一个测试了多个独立的数量是否可以孤立仅仅通过稀释羊膜穿刺术样品成大卷的媒体。四个后续样品,我们收到了在25到125毫升的血清稀释媒体和镀到一个或多个24-well板治疗组织文化。媒体和不依从细胞复制新的盘子48小时后72小时。4羊膜穿刺术RC样品,磅,吉瓦,和铅生成12日9日14日和9个独立的可行的细胞群,分别为(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。每个人口被分配一个名称反映其来源和隔离地址:样本(RC、磅、瓦、铅),一级或二级(2)转让、塔板数(1 - 5)、行(模拟),列(1 - 6)。类似数量的细胞群来自4个样品,我们测试了,但是样本大小(gydF4y2Ba)排除了有意义的统计显著性的测试。尽管如此,44个独立可行的细胞系生成2到4天内镀不到8毫升的无教养的羊膜穿刺术示例使用这个简单、高效的方法。gydF4y2Ba

3.2。克隆种群扩大从离散的点光源gydF4y2Ba

单细胞克隆的细胞群发达如预期;每日监测阶段显微镜显示不断扩张的一个小球形细胞集群,最常的边缘(数字gydF4y2Ba1gydF4y2Ba(一),gydF4y2Ba1gydF4y2Ba(b)),但偶尔附近的中心。我们没有检测细胞分散在井在人口膨胀,这表明任何细胞迁移仅限于短距离。细胞群的克隆特征符合检测2-well-separated扩大范围的单一的油井,好像每个集群是发起创始人从两个不同的细胞。这些观察的基础上,我们指定单独的数量由一个球形集群等只克隆种群和种群进一步进行了研究。gydF4y2Ba

扩大克隆种群可以通过相位显微镜分类的基础上,细胞形态、指定作为基质或上皮使用术语广泛应用于细胞生物学和符合描述细胞的混合细胞群,被他人建立(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba,gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。基质细胞种群是由大,布置得井然有序平与多极细胞形态和不规则的细胞质扩展(数字gydF4y2Ba1gydF4y2Ba(c)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba(e)与BMMSCs(图)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba(f))。基质细胞种群通常包含非常小的细胞很少和小大量的细胞质中没有检测到细胞核。上皮细胞由球形数量集中位于核(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba(d)),作为一个阶段出现折射圆顶被夷为平地相位透明细胞质包围。上皮细胞的主要人口往往是相互并列的多个单元的岛屿。所有的羊膜穿刺术样品至少产生一个明显衰老人群没有扩大足以使后通过或失败的增殖。虽然我们没有试图扩大和描述所有人群,简单的检查在殖民地扩张表示,大约一半的克隆分类(gydF4y2Ba)是基质,一半是上皮。尽管AF-type克隆配件Hoehn和沙克的描述gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]并不典型,一个千瓦克隆一直开发总量在重复段落的原因还不清楚。这些发现表明形态不同的克隆数量可以从无教养的孤立羊膜穿刺术样品通过稀释和直接电镀的新鲜无教养的样本。gydF4y2Ba

3.3。流式细胞术分析细胞表面标记物的表达gydF4y2Ba

细胞表面标记物的表达,流式细胞术检测确定羊膜基质细胞克隆的概要文件与BMMSCs和流式细胞术是否可以区分克隆种群的基质和上皮细胞。细胞和抗体应用CD73 CD90、CD105,最小的一组任务所需的细胞表面标记BMMSC身份(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba),以及额外的标记,这些标记被广泛用于描述msc (gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba),包括整合素gydF4y2Ba1与CD29抗体检测,透明质酸,CD44糖蛋白受体和stage-specific胚胎抗原4 (SSEA4)。概要文件首次建立了BMMSCs作为immunodetection积极的控制程序。结果表明,几乎所有BMMSCs CD73表达CD29、CD44, SSEA4(图gydF4y2Ba2(一个)gydF4y2Ba)。大的子集BMMSCs CD105表达和CD90 ~分别为86%和60%,使用FITC-conjugated抗体(图gydF4y2Ba2 (b)gydF4y2Ba),但所占的比例还不到95%频率预期[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]。CD105的比例和CD90 immunopositive细胞增加到100%和97%,分别与抗体结合的长波长面粉Alexa萤石647 (AF647)和allophycocyanin (APC),增加检测的灵敏度(图gydF4y2Ba2 (b)gydF4y2Ba)。两组FITC -和APC / AF647-conjugated抗体被用于其余实验作为额外的测量CD90和CD105的表达自信的羊膜细胞群。gydF4y2Ba

克隆PB羊膜穿刺术的样本进行了分析:两个基质细胞克隆,PB4A2 PB1C4,上皮细胞克隆PB3B5。BMMSCs等几乎所有PB4A2 PB3B5细胞表达CD73 CD29、CD44, SSEA4(图gydF4y2Ba2(一个)gydF4y2Ba)。PB4A2基质细胞和PB3B5上皮细胞显示非常相似的配置文件CD105和CD90表达式;不到~ 14% ~ 7%的细胞群表达CD105 CD90、分别与化验FITC-conjugated抗体。的比例CD105 immunopositive PB4A2 PB3B5细胞上升到60%和75%,分别与AF647-conjugated抗体,但CD90检测显示变化不大。相比,BMMSCs并行运行,平均荧光强度(MFI)与CD105和CD90 PB4A2基质细胞和组织化学染色PB3B5上皮细胞只是温和或极低,表明CD105和CD90不是高度表达。从这些调查结果可以得出两个结论。首先,表达CD29、CD44 CD73, SSEA4没有区分BMMSCs和克隆PB4A2基质细胞和PB3B5上皮细胞。第二,流式细胞术没有区分PB4A2基质细胞的数量和PB3B5上皮细胞。最后,CD105和CD90 PB4A2基质细胞和PB3B5上皮细胞的表达明显低于BMMSCs。gydF4y2Ba

PB1C4基质细胞不同于其他细胞群;67%,63%,和57%的细胞表达CD73 CD29、CD44,分别只有~ 17%的细胞表达SSEA4(图gydF4y2Ba2(一个)gydF4y2Ba)。只有不到8%的PB1C4基质细胞被immunopositive CD105或者CD90,即使AF647 / APC-conjugated抗体。最后,产生的抗体测试一个主峰在信号强度在所有其他人群,但概要文件的控制和测试数量PB1C4细胞显示多个主要的山峰和广泛的信号强度。尽管PB1C4差异的分子基础和其他细胞数量还不清楚,这些数据连同上面的数据表明,稀释和直接电镀可以生成不同的基质细胞克隆种群。gydF4y2Ba

3.4。成骨分化gydF4y2Ba

流式细胞术结果显示羊膜细胞不会显示分化,细胞表面标记表达式从BMMSCs显著不同。克隆细胞群是使用标准方法检测成骨分化。Subconfluent PB4A2p19文化,PB3B5p14、PB1C4p11 BBMSCp5细胞被播种在多井在near-confluent密度板。随后细胞分化中维护媒体3到4周,交换媒体每3到5天。媒体没有细胞分化补充剂被用作消极的控制。固定和茜素红染色后,健壮的沉积的钙检测BMMSCs和PB4A2人口,但无论是PB1C4细胞还是PB3B5细胞显示钙沉积(图gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。结合流式细胞术的结果,微分成骨的PB4A2和PB1C4人口支持复苏的潜力不同克隆的稀释和直接电镀。此外,缺乏强劲的CD90和CD105的表达表明,这些标记物的表达不是成骨的潜力的预测。gydF4y2Ba

3.5。脂肪形成的分化gydF4y2Ba

平行实验测试使用标准方法去分化后的染色油红色的o(图检测脂肪滴gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。相位显微镜显示,BMMSCs脂肪滴的积累和PB1C4细胞诱导后2周内(数据没有显示)。染色油红色的o显示,大约有30%的大而明亮的红色水滴BMMSCs和大约10%的PB1C4细胞。虽然PB4A2数量显示只有偶尔的细胞(< 1%)相似集群的大液滴,大约10%到30%的PB4A2细胞集群的小亮油红反应滴。类似的小型石油红色的o反应水滴也出现在BMMSCs和PB1C4细胞。PB3B5细胞没有显示油红色的o反应滴,表明PB3B5细胞没有脂肪形成的潜在和小型石油红色的o反应滴不染色的工件。结合的证据成骨的潜力,这些发现表明,克隆的数量PB4A2 PB1C4细胞具有不同的分化潜能。gydF4y2Ba

3.6。中间丝典型的疣状上皮和间质细胞gydF4y2Ba

迄今为止的结果表明基质的分化,但不是上皮细胞数量。我们接下来问分化潜力是否可以与基质的表达式,而不是上皮细胞标记。对角质细胞群与panantibodies应用,中间丝状体超家族,家族蛋白在上皮细胞中表达gydF4y2Ba37gydF4y2Ba)、波形蛋白中间丝的另一位成员总科,被广泛用作基质细胞的标记。BMMSCs细胞显示组织immunopositive波形蛋白纤维作为基质细胞的预期,但只有低水平的扩散角蛋白染色检测在BMMSCs归因于背景染色。PB4A2 PB3B5细胞数量显示明亮immunopositive网络波形蛋白和角蛋白虽然角蛋白免疫染色强度显示更多的变化相比,波形蛋白。与其他人群测试,PB1C4细胞的克隆数量没有显示波形蛋白或组织化学染色角蛋白网络。这些发现表明角蛋白和波形蛋白的表达并没有与成骨的和脂肪形成的分化潜能。此外,羊膜基质细胞可以从另一个歧视的基础上角蛋白和波形蛋白网络。gydF4y2Ba

3.7。Immunodetection纤连蛋白和N-CadheringydF4y2Ba

波形蛋白的缺失网络提出的问题是否PB1C4基质祖细胞表达基质细胞标记。纤连蛋白是一种细胞外基质(ECM)蛋白质基质细胞中高度表达,虽然不排斥这些细胞(gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]。N-cadherin是细胞粘附分子表达间充质细胞(gydF4y2Ba39gydF4y2Ba),与钙粘蛋白高表达在上皮细胞(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。双标记的实验显示coexpression纤连蛋白和N-Cadherin所有人群测试(图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。然而,差异被发现;BMMSCs显示复杂的纤连蛋白网络而PB4A2 PB3B5细胞显示稀疏纤连蛋白细丝除了高细胞密度的局部地区。PB1C4细胞纤连蛋白纤维组织化学染色了,即使在低密度细胞培养。纤连蛋白细丝PB1C4细胞出现几乎平行的短的丝状结构安排让人想起豪猪相比BMMSCs交叉线的长纤维网络。这些结果与流式细胞术和分化化验的结果表明PB1C4细胞代表一个独特的基质细胞克隆种群隔离的稀释和直接电镀。gydF4y2Ba

3.8。微分表达波形蛋白和角蛋白的混合细胞群gydF4y2Ba

变异羊膜细胞克隆预言ChM混合细胞人群将包含相同的上皮和间质细胞的混合物。我们测试了这个预测使用的几个ChM混合细胞群,我们从不同的捐赠者的分离研究。初步检查阶段显微镜表明ChM人口比例明显不同的上皮细胞和基质细胞;上皮细胞的高纯度ChM1人口,但很少被发现在其他ChM人口(数据未显示)。疣状角蛋白和波形蛋白抗体或显示角蛋白、纤粘连蛋白的大小和形状的多样性之间的细胞内和化学加工数量。ChM1人口与知名网络包含许多大型球形细胞角蛋白和波形蛋白,代表85%的细胞(gydF4y2Ba)以及较小的细胞有不规则的细胞形状(图gydF4y2Ba7(一)gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba7 (d)gydF4y2Ba)。ChM immunopositive的人群也包含细胞波形蛋白纤维,但immunonegative角质,只显示弥漫性背景染色。这些观察表明,羊膜穿刺术样本包含的混合基质和上皮细胞,包括一些相同的细胞克隆种群隔离的稀释和直接电镀。gydF4y2Ba

疣状纤连蛋白、角蛋白显示本质上无处不在的纤连蛋白染色(数字gydF4y2Ba7 (e)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba7 (f)gydF4y2Ba密度),尽管文化显示领域的复杂网络,像纤连蛋白网络BMMSCs(数据没有显示)。ChM1种群包含大型球形细胞纤连蛋白,与惊人的伞状安排鹅毛笔和突出的角蛋白(图网络gydF4y2Ba7 (e)gydF4y2Ba)。虽然短刺纤连蛋白在上皮细胞混合单元数量相似的外表,我们没有检测细胞类似于PB1C4细胞在任何数量的测试。这些发现表明,PB1C4细胞类型可能是罕见的或难以检测混合细胞群。gydF4y2Ba

3.9。上皮细胞的数量随钙粘蛋白的表达和N-Cadherin记录gydF4y2Ba

Coexpression基质和上皮细胞标记免疫荧光(图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)提出的问题是否PB3B5上皮细胞表达钙粘蛋白的成绩单。尽管所有的测试克隆immunopositive N-cadherin, PB3B5细胞immunonegative上皮(数据未显示)一如预期的上皮细胞。敏感的基因表达分析被用来测试上皮和N-cadherin成绩单在克隆种群以及ChM1混合细胞群。主要文化BMMSCs源自人类尿道上皮和上皮细胞是用作基质控制和上皮细胞,分别。N-Cadherin记录被发现在所有控制和羊膜细胞群;然而钙粘蛋白成绩单只有ChM1细胞和控制uroepithelial细胞中发现(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。钙粘蛋白表达在控制和ChM1证实了细胞群免疫荧光分析(数据未显示)。这些发现显示羊膜上皮细胞之间的差异,可以定义的存在或明显缺乏钙粘蛋白的表达。gydF4y2Ba

4所示。讨论gydF4y2Ba

4.1。隔离不同的克隆分群的稀释和直接电镀gydF4y2Ba

这项工作提供了概念证明,稀释的羊膜穿刺术和直接电镀样品,没有制冷或离心分离,是一种高效的方法来生成惟一的克隆种群。克隆的身份PB4A2、PB3B5 PB1C4数量反映在这些克隆线(表之间的表型差异gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。我们的发现的一个推论是,羊水细胞种群多样性大于可以欣赏转让羊膜细胞上皮和间质细胞类型由相位显微镜形态学的基础上。gydF4y2Ba

稀释和直接电镀允许有效的复苏细胞类型,否则可能会丢失或未被发现在混合细胞群。这个观点是由2观测。首先,我们孤立长寿上皮细胞克隆;PB3B5细胞在文化已经有超过25个段落。这是很重要的,因为也有人指出,上皮细胞的克隆种群难以维护超过5或6通道(gydF4y2Ba35gydF4y2Ba,gydF4y2Ba40gydF4y2Ba,gydF4y2Ba41gydF4y2Ba)和羊膜细胞培养显示或获得一个统一的基质或呈形态文化(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba42gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]。长寿克隆种群像PB3B5可能反映了独特的上皮细胞类型和/或没有旁分泌上皮细胞克隆的传播效果,可能存在于混合细胞群。第二个观察支持复苏的未被发现的细胞类型是典型PB1C4基质细胞的隔离;这些祖细胞具有分化脂肪形成的潜力,但不显示检测到中间纤维组织化学染色波形蛋白、角蛋白。考虑到聚合物的中间纤维细胞骨架提供强度和保护细胞免受剪切力gydF4y2Ba45gydF4y2Ba,gydF4y2Ba46gydF4y2Ba),我们推测,细胞剪切可能构成的复杂性PB1C4细胞流式细胞仪探测到(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。克隆种群的长寿的上皮细胞和非典型基质细胞,如PB3B5和PB1C4,分别在羊膜细胞培养还没有被发现。gydF4y2Ba

4.2。细胞表面标记表达式可以从分化潜力的非耦合gydF4y2Ba

流式细胞术被广泛用于描述基质细胞群从各种各样的来源、CD73 coexpression CD90、CD105 MSC的身份是一个标准(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。几个我们的研究结果表明,这些细胞表面标记物的表达不是羊膜细胞的分化潜能的预测。首先,相当比例的所有人群测试表达CD29、CD44, CD73, SSEA4,是否证据显示种群分化的潜能。第二,PB1C4和PB4A2数量显示成骨的和/或脂肪形成的分化潜能,但CD90和CD105表达的频率和强度很低,或者在PB1C4细胞,几乎检测不到。因为分析BMMSCs并行运行在这些实验中,低或未被发现的CD90和CD105并非由于技术水平差异的实验。第三,PB3B5上皮细胞和PB4A2基质细胞(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)显示,几乎无法分辨的表面标记表达式通过流式细胞术(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba),但只有PB4A2细胞分化潜力(数据gydF4y2Ba3gydF4y2Ba和gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。这些发现表明脂肪形成的羊膜细胞和成骨分化潜力可以从细胞表面标记分开,被广泛用于计基质细胞身份和潜在的分化能力。gydF4y2Ba

几组有异形细胞表面标记物的表达在羊膜细胞的数量和检测分化潜能来生成结缔组织血统(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba43gydF4y2Ba,gydF4y2Ba47gydF4y2Ba,gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]。很难比较不同研究的结果,部分原因在于研究不同技术方法和基准分配积极和消极的结果。结果也可能不同,因为测试的成分和胎龄羊膜细胞数量有所不同。考虑到组织的起源和用于培养细胞的条件已知影响基质细胞的分化潜能(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba),分化潜力之间的关系和细胞表面标记物的表达可能出于类似的原因各不相同。除了这些影响,未来的工作可能显示细胞表面标记物的表达和分化潜力是否影响细胞旁分泌影响混合细胞群。gydF4y2Ba

4.3。Coexpression上皮和间质细胞的特征gydF4y2Ba

角蛋白表达在上皮细胞在羊膜细胞群和已知普遍(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。高分辨率的角蛋白和波形蛋白免疫荧光成像显示coexpression复杂长丝网络子集的羊膜细胞,包括PB3B5克隆上皮细胞(人口数据gydF4y2Ba5gydF4y2Ba和gydF4y2Ba6gydF4y2Ba在球形细胞)和混合单元数量(图gydF4y2Ba7gydF4y2Ba),可能对应于上皮细胞检测到相位显微镜。上皮细胞之间的差异表明了钙粘蛋白的表达;这epithelia-specific PB3B5细胞粘附分子在不被察觉的情况下虽然是发现ChM1的细胞群(表中gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。这些上皮细胞间明显差异的基础是不清楚,但文化差异可能反映了变量寿命或旁分泌信号ChM混合细胞培养中不存在克隆种群。差异也反映推导不同胎儿来源;胎儿的皮肤是一个很好的候选人来源羊膜上皮细胞(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba),它是可行的,羊膜上皮细胞可能来源于胎盘膜(gydF4y2Ba49gydF4y2Ba),释放自然在羊膜穿刺术或针穿刺手术。除了这些来源,上皮细胞这条线的内部表面胎儿也是潜在的候选人,其中包括从胃肠道上皮细胞,肺和尿液排出。gydF4y2Ba

PB4A2细胞的克隆数量显示共存上皮和基质细胞特征;coexpressed PB4A2细胞角蛋白和波形蛋白显示multipotential生成骨骼和脂肪分化潜力。上皮和间质细胞共存的特征提出了一个问题:是否基质细胞羊水的EMT (gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。优先通过EMT基质细胞来源来自研究上皮细胞在诱导释放从乳腺上皮细胞gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]。这些上皮细胞转变成msc表达基质细胞标记和分化成脂肪、骨、软骨(gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]。虽然推导EMT是可行的,它不太可能是独家的基质细胞来源自PB1C4基质祖细胞没有显示表达上皮标记和混合细胞群包括许多基质细胞类型缺乏角蛋白表达。进一步的工作需要显示EMT是否有利于基质细胞池的羊水和EMT是否影响羊膜上皮细胞之间的多样性。gydF4y2Ba

4.4。小说的基质细胞克隆种群为ECM蛋白质资源gydF4y2Ba

细胞外基质(ECM)是至关重要的组织工程和生物工程制造器官。去细胞被认为留下洗涤剂不溶性ECM提供形式和组织血管再生和功能(gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]。虽然有相当大的进步组织和器官工程、重播的脱细胞和生物工程与可行的器官,proliferation-competent细胞仍然是一个挑战(gydF4y2Ba52gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba56gydF4y2Ba]。最近的研究表明,比较生物可降解支架移植构造的BMMSCs改进的性能(gydF4y2Ba57gydF4y2Ba]。在这个框架中,PB1C4人口的显著特点是广泛沉积纤连蛋白在低密度的文化(图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。克隆种群的基质祖细胞像PB1C4羊水提供细胞来源和/或交付车辆纤连蛋白和其他ECM蛋白质与生物工程支架改善结果。gydF4y2Ba

利益冲突gydF4y2Ba

作者没有商业协会,可以创建一个与本文有关的利益冲突。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

作者感谢凯西马西斯的宝贵指导分化所需的组织化学检测和技术支持的辛西娅·齐默尔曼的早期阶段,这项工作。UECs渊源Zhang博士的礼物,WFIRM,维克森林大学。作者收到资金的支持远程医疗与先进技术研究中心(W81XWH0710718)和克里斯托弗·莫斯利的基础。他们也感谢国家的慷慨支持北卡罗莱纳(G20431003411MED)。gydF4y2Ba

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