视网膜下植入实际上电纺,短的纳米线,光滑的聚己内酯)支架猪眼睛的视网膜下空间

文摘

生物可降解支架起着重要的辅助作用,移植视网膜祖细胞(rpc)视网膜下空间。聚ε己内酯(PCL)支架与视网膜下植入28猪的眼睛是不同的修改和评估多病灶的electroretinography 6周后(mfERG)和组织学观察。PCL纳米线短、PCL实际上电纺和PCL光滑支架在猪和良好的耐受性在视网膜下空间没有造成炎症和有限的组织破坏。PCL短纳米线平均速率保留覆盖外层视网膜比PCL实际上电纺高17%和25%高于PCL光滑。此外,PCL短纳米线被发现最合适的刚度对外科交付到视网膜下空间。mfERG membrane-induced感光损害可以显示,但是P1的削减幅度只有重要的PCL光滑。我们得出这样的结论:测试支架,PCL纳米线是视网膜下植入的最佳人选。

1。介绍

视网膜下移植视网膜祖细胞(rpc)的动物模型显示迁移到外层视网膜的能力,分化成熟的光感受器,产生突触与现有细胞(1]。在哺乳动物的视网膜不再生(2),这提供了一个很好的恢复视网膜退行性疾病的潜力。当细胞移植到视网膜下空间,支架的使用已被证明增加的数量交付和存活的细胞,使一个更精确的和局部的交付(3),促进分化和组织移植rpc (3- - - - - -5]。此外,支架可以通过监管和加载调节药物进一步帮助分化、功能,和生存6- - - - - -8]。

一些材料已经为RPC支架移植和测试发现支持附着力,生存,和迁移3,9]。的一个更有前途的支架材料聚ε己内酯(PCL)机械兼容,无毒,降解缓慢表面侵蚀和可以制作非常薄的膜9- - - - - -11]。PCL的支架可以通过不同的方法来制作生产特定的结构和力学性能9,10,12,13]。这种类型的PCL膜实际上电纺(PCL-E),短纳米线(PCL-SNW)和光滑(PCL-S)。所有三个以前被测试,PCL-E和PCL-SNW承诺为支持经济增长的能力,分化和迁移的rpc体外和对于PCL-SNW也在老鼠体内研究[9,13]

在这项研究中,我们裸体PCL膜移植猪的视网膜下空间获得的基线组织学和电生理的影响视网膜下移植以及长时间存在PCL-E PCL-SNW, PCL-S膜的眼睛。猪眼睛的大小使使用外科手术技术和设备应用于临床,因此本研究还评估测试膜的机械性能与人类视网膜下移植的过程。沃斯Kyhn et al。14)所示的手术步骤获得视网膜下空间没有多病灶的检测影响视网膜电流图(mfERG)猪术后6周,我们假设只看到出现的移植膜电生理效应。也立即组织学缩短光感受器外段气泡形成后被证明规范化术后6周(14]。我们因此希望这项研究作为未来的组织学和电生理学的基线RPC-PCL综合研究。

2。材料和方法

所有实验进行符合下午语句使用动物在眼科和视觉研究。丹麦的动物实验检查机构授予许可使用的动物(许可2007/561 - 768)。训练有素的兽医护士和技术人员进行处理的动物。

共有28个女国内猪丹麦长白猪/杜洛克猪/汉普郡/约克郡犬被用于这些实验(年龄3 - 4个月;体重23-30公斤)。只剩下眼睛接受膜植入。这些动物premedicated Tiletamine 1.19毫克/公斤,Zolazepam 1.19毫克/公斤(Zoletil 50兽医Virbac SA,卡罗,法国),美沙酮0.24毫克/公斤(奈科明、鲁开德、丹麦),氯胺酮1.43毫克/公斤(Intervet、Skovlunde、丹麦)和甲苯噻嗪1.24毫克/公斤(Intervet、Skovlunde、丹麦)。此后,持续静脉注射麻醉维持了(注射)异丙酚15毫克/公斤/小时(费森尤斯公司Kabi,糟糕的小礼帽,德国)。这些动物气管内插管和人工通气34% O₂。在麻醉动物被放在他们的手肘最小化对心血管系统的影响(15]。为了避免体温过低,在麻醉动物被裹着毯子

2.1。膜制备

PCL-E膜被转移捏造的溶液10重量百分数(wt %)在CHCl PCL₃5毫升注射器连接到一个生硬的将18计(G)不锈钢针。进行电纺的然后通过15千伏的应用正电压聚合物溶液。美联储的解决方案是通过注射泵以恒定的质量流率1毫升/小时。最后纤维收集在一个不锈钢接地旋转鼓直到非织造布垫成立。

PCL-SNW膜是捏造的,首先准备一个聚合物铸造解决方案在二氯甲烷溶解PCL (4 wt %) (Sigma-Aldrich)。PCL溶液然后投到上一纳米多孔阳极氧化氧化铝模板使用一个旋转涂布机(特种涂料系统,印第安纳波利斯,在美国)。溶剂被允许在室温下蒸发。形成的聚合物熔体在130°C,而接触纳米多孔模板。纳米线长度是融化时间的函数。融化时间5分钟被用来形成短纳米线为2.5μ米的长度。最后的薄膜支架垂直对齐的纳米线被蚀刻发布模板在稀氢氧化钠溶液和允许在室温下晾干。

PCL-s膜是捏造的电化学抛光硅片使用spin-cast /溶剂蒸发法。

2.2。外科手术

眼睛是麻醉,扩张、消毒和一个标准的三端口如前所述执行核心玻璃体切除术(16]。总之,注入线获得下级(铃声乳酸;悲伤,哥本哈根,丹麦),玻璃被在endoillumination使用20 G vitrector (Karl Storz GmbH, Tuttlingen,德国)。后透明细致移除在视觉条纹和视神经盘区。视网膜下气泡在连续的视觉区域被注入了铃声乳酸(悲伤,哥本哈根,丹麦)通过41克插管(ref。1270;DORC国际BV Zuidland、荷兰)。进入视网膜下空间,进行retinotomy在时间方面的水泡使用endodiathermy (Storz首映,博士伦;能源组15%,输出范围7.5瓦特额定在100欧姆)和自动剪刀(Storz首映,自动剪)。

这使得一大块膜(约。12毫米²)插入视觉连续区域。DORC结合抹刀/剥皮钳是用于此(DORC Ref。1297年,荷兰)。为了确保膜,部分fluid-air-exchange与排水retinotomy网站在放置视网膜下膜后执行。巩膜及结膜缝合与7涂布vicryl (Ethicon, Norderstedt,德国)。过程后,眼压与双手触诊评估,执行和间接检眼镜检查确保正确位置的膜和无出血、视网膜脱离。最后,给出了局部应用氯霉素软膏,眼睛是修补(Kloramfenikol“驿站”;奈科明、鲁开德、丹麦)。为了确保可靠的组织学和mfERG录音,动物与任何手术并发症,如出血、手术镜头损坏,或视网膜脱离以及动物重要的透明在媒体上被排除在研究之外。

2.3。后续的过程

过去六周内手术,动物reanesthetized如前所述[15与添加神经肌肉阻断剂),以避免眼球运动:2毫克/ h增长值Pancurium溴化(Oss,工具论、荷兰)。

红外(IR)眼底成像,mfERG(真实科学5.0.1)和彩色眼底照片(蔡司FF450 plus-IR)前获得安乐死。所有颜色眼底照片拍摄的角度50度。动物安乐死由20毫升注射戊巴比妥200毫克/毫升(皇家兽医和农业大学,哥本哈根,丹麦)和左membrane-transplanted眼睛被阐明。一个初始固定15分钟后在甲醛4%,无核的眼睛被分成两部分ora serrata切口后。随后,甲醛固定长期24小时。

2.4。组织学

视神经和视觉条纹被孤立于甲醛固定洗眼杯。获得的标本石蜡包埋和部分4.5μ米被苏木精和伊红染色(他)和光学显微镜评估。形态的比例不受干扰的视网膜移植层覆盖膜测量显微照片。对于每一个视网膜层,一小部分视网膜形态不受干扰的计算。这半定量的得分对视网膜组织学的影响使膜比较独立于膜内的位置。

2.5。多病灶的视网膜电流图

多病灶的ERG是记录在双眼如前所述17]。简单地说,眼睛是扩张和Burian艾伦(真实红外照明电极,EDI, Inc .,红木,CA)双极型隐形眼镜放在角膜。录音进行了使用视觉刺激的真实科学5.0.1显示在1.5英寸的阴极射线管显示器集成在刺激相机。左边membrane-implanted眼睛总是首先被记录,记录麻醉前两小时内。两只眼睛都记录在30分钟的时间。241们的刺激模式白人和黑人六边形的帧速率每帧使用75赫兹和16个样本。m序列指数是15和录音的时间是7.17分钟。信号是带通滤波外10 - 300赫兹。没有使用空间平均只有一阶内核。

多病灶的视网膜电流图得分的膜是如前所述17]。总之,IR的左眼眼底照片真实的刺激网格系统和相应的蔡司彩色眼底照片一致确定六边形覆盖membrane-supported视网膜。相应的面积在正确的(控制)眼睛被确认,和平均P1-amplitudes mfERGs来自六边形的两个区域进行计算,并被发现。ANOVA-test是用来测试之间的平等意味着不同的膜类型(SigmaPlot 11.0为Windows, Systat软件公司,圣何塞,加利福尼亚,美国)。

2.6。亮度分析

彩色眼底照片被用来评估移植视网膜下膜的亮度。感兴趣的领域做了标记和测量在Photoshop中规模从0(黑色)到255(白色)所描述的哈伯德et al。18]。膜面积之间的比例和视神经盘亮度甚至被用来眼底照片闪光强度的差异。三个膜的亮度比使用SigmaPlot绘制。

3所示。结果

共有28个猪PCL-membrane植入手术,12所PCL-S, 10 PCL-E, 6 PCL-SNW膜植入。

植入膜不能发现7例在跟踪和1头猪膜在玻璃腔被发现。两头猪开发人工出血并没有解决,和2猪视网膜没有再植。一个PCL-SNW mfERG响应,但视网膜组织学制备过程中丢失;4眼(PCL-E PCL-SNW,和两个PCL-S),膜移动到目前为止外围地mfERG的检测是不可能的,和在一个PCL-E膜intraretinally迁移。这给了总共有10头猪包括组织学评分和mfERG录音(表1)。

PCL膜辩驳的不同制备方法导致不同程度的灵活性。这证明了影响易于植入眼内。PCL-SNW最简单的回旋余地和插入在视网膜下空间。相对僵硬PCL-E给扭曲了周围组织的印象时插入的视网膜下,而光滑的膜的高灵活性使它弯曲,蜷缩在植入。

组织学检查显示所有膜,而视网膜下空间的耐受性良好,没有炎症在视网膜或脉络膜(图1)。在一些情况下,RPE细胞外表面上的膜转换为组织细胞的形态创造巨大的细胞(图1(上))。脉络膜新生血管(CNV)与PCL-E被认为在67%的情况下,75%的病例与PCL-S移植,并与PCL-SNW膜在50%的情况下。

可以得分的形态完整的分数所有视网膜上覆层包括眼睛。平均值为每一层和膜类型包括图的最低和最高分数3。PCL-SNW平均最高比例的形态保存完好覆盖所有评估视网膜外层视网膜层。光感受器外节层中断所有膜,不同从夷为平地到完全消失。这一层,只有一个,因此,作为保存如果存在(图3)。所有其他层不同原状打扰得面目全非,只有这些层的形态不受干扰的部分作为保留。视网膜内被几乎所有膜完整但一例PCL-S(图3)。得分低的一个PCL-SNW外层视网膜层因为视网膜褶皱的得分为形态学干扰(图1)。常见的膜都是边缘的趋势渗透通过膜的视网膜层和在一个案例中发现位于完全intraretinally。

有可能获得好的mfERGs接受信噪比在左、右眼在所有包括猪。3 d演示振幅显示一般抑郁症的膜相比邻视网膜(图2)。这种趋势是P1-amplitude还发现比率(图4)。P1-amplitude比率的萧条,然而,只有PCL-S 1显著不同。三种膜之间,没有显著差异意味着P1-amplitude比率被发现(图4)。振幅的3 d演示三种膜的膜相邻视网膜显示了个人间之间的区别通常见过猪(图2)。

基底膜的照片揭示不同亮度的膜(图2)。这种亮度的差异是显著的PCL-SNW和PCL-E膜(图5)。

4所示。讨论

我们证明,在这项研究中,三种不同修饰的聚ε己内酯)膜,实际上电纺,短的纳米线,光滑,在猪视网膜下空间的耐受性良好。没有测试膜变异引起的炎症反应,但视网膜损伤的差异可能与的物理性质不同的膜类型。

支架的厚度和生物相容性此前已经解决基本性质的组织支架的视网膜下干细胞移植(13,19,20.]。首先,脚手架必须薄和渗透营养允许外层视网膜生存。PCL-SNW支架尤其是满足这个需求,因为它是最薄的聚合物基质用于视网膜下RPC移植(13]。其次,支架材料不得有毒周围组织。PCL作为支架材料符合这些要求,因为它既高度渗透(12)和降解缓慢的方式并且更不容易离开酸性比聚合物分子量较高的PLGA微环境(21,22]。最后,允许外科交付视网膜下空间,支架需要僵硬,但还是足够灵活,能够防止视网膜下空间的扭曲。PCL-E有非常高的杨氏模量(刚度)9),防止细胞膜适应曲率的眼球,并可能导致观察到移植到视网膜。相比之下,PCL-S太灵活,因为它往往会蜷缩在植入,因此引起了较大的手术创伤。总体来说,我们发现PCL-SNW最佳程度的灵活性和PCL-S有最坏的打算。

我们的组织学结果还指向PCL-SNW最好的脚手架候选人的三个测试覆盖外层视网膜(从内部核层和)PCL-SNW大约17%比PCL-E保存形态,和25%超过PCL-S(图3)。内层视网膜组织学显示,主要是原封不动的在所有标本,除了一个光滑的膜。在一个标本与PCL-E我们发现完整的感光层,但整体的发现是,光感受器被缩短,完全形态的观察到完整的层。压扁的外层部分曾被观察到在猪视网膜脱离这里外段的形态是恢复超然和随后的回贴(后4 - 6周14]。因此,我们把损失和形态学改变外段的预期,而不是特定于这些膜类型。除了机械膜之间的差异的影响,解释了不同程度的保护可能是细胞膜的能力来支持增长细胞(13]。

我们相信,蜷缩在植入的倾向结合表面光滑的解释是大量PCL-S膜没有发现视网膜下跟踪(表1)。随着PLC降解很慢,发现保存完好的在另一个眼睛,我们不认为膜没有发现6周后解散。他们要么视网膜下迁移到目前为止在前面,他们不可见的眼底照片和组织学,或者更有可能的是,他们通过retinotomy流离失所,一看到后晶状体囊,和,因此,在制备过程中未见。

脉络膜的neovasculariztion经常发生伤害布鲁赫膜(23),包括在这项研究中发现超过一半的眼睛。我们不希望出现如果电活动直接影响mfERG CNV。然而,间接CNV可以影响mfERG通过散射。我们不希望这个影响细胞膜的mfERG支持视网膜下CNV位于膜植入。

故意使用mfERG作为体内细胞生存是妥协的测量研究。如果mfERG用于评价移植细胞的生存,明显抑郁mfERG振幅比的控制情况(裸膜)是强制性的。的3 d演示mfERG,有抑郁症的倾向mfERG信号膜,但相比,控制眼睛只PCL光滑振幅明显下降P1。虽然组织学显示显著差异外视网膜层覆盖不同的膜的破坏类型,我们不能表现出任何显著差异在P1振幅比率。这是进一步复杂化的亮度比例明显高于观察PCL-SNW PCL-E相比,所以亮度之间的关系比和mfERG P1振幅比率不能证明,以前显示的PLGA膜(17]。我们解释这种不同的存在残余光感受器功能覆盖的膜,导致mfERG振幅组成的信号功能局部视网膜和不同程度的光散射。

5。结论

总之,PCL衍生品在猪视网膜下空间的耐受性良好。三国PCL支架测试,PCL短纳米线似乎是最好的候选人将来使用的脚手架RPC移植。

缩写

RPC:	视网膜祖细胞
PCL:	聚ε己内酯)
PCL-E:	聚ε己内酯)实际上电纺,
PCL-SNW:	聚ε己内酯)短的纳米线
PCL-S:	聚ε己内酯)光滑
mfERG:	多病灶的视网膜电流图
注射。	静脉输液
旅客:	计
红外光谱:	红外
他:	苏木精和伊红
CNV:	脉络膜新生血管形成。

利益冲突

本文的作者没有利益冲突披露。

确认

作者要感谢丹麦机构科学、技术和创新,以及Lincy基金会和安德烈Olenicoff纪念基金会。

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