心脏细胞再生潜力的儿科患者心力衰竭阶段:结束可翻译方法丰富和传播

文摘

背景。人类cardiac-derived祖细胞(hCPCs)有望用于治疗心力衰竭(HF)的成年人。本研究的目的是描述推导hCPCs从儿童终末期心力衰竭患者。方法。在手术,丢弃的右心房组织(hAA)从心力衰竭患者(;hAA-CHF)。剁碎组织被悬浮在完成DMEM(血清)。细胞被选为他们的组织移植和干细胞因子受体的表达(hc-kit)。描述的包括细胞免疫组织化学检查面板的单克隆抗体。结果。细胞,包括phase-bright细胞识别文化,从hAA-CHF自发移民暂停外植体(SEC)后7天。当cocultured组织,移民细胞扩散,首先一样松散连接克隆,后来多细胞集群。在21天~5%的细胞。在14天、28天的评分细胞中胚层的承诺(GATA -展出和);后28天心脏血统(,平滑肌,,肌凝蛋白光)。结论。hCPCs可以来自心房组织儿童终末期心力衰竭患者。证券交易委员会是一种新型的文化迁徙的推导方法细胞,有利于临床翻译通过减少体内添加因素需要扩大hCPCs)在体外。

1。介绍

在当前的时代,人类的心脏被认为拥有一些再生潜力。实验证据证实了基于遗传的命运映射cardiac-derived干细胞或前体细胞(年度"特别关注国")导致更换的成年哺乳动物心肌细胞(1]。这些天生的年度"特别关注国"具有干细胞的特性,具体地说,它们是单独使用,自我更新,不对称分裂的能力,表达干细胞标记(即。,stem cell antigen receptor or c-kit), and are capable of differentiating into cells of the cardiac lineages, including endothelial cells, smooth muscle cells, conduction cells, and cardiomyocytes [2]。

心力衰竭是一种禁用,昂贵的和致命的障碍儿童不仅在成人也。高频在儿科患者主要是继发于先天性心脏病(CHD) [3]。儿童冠心病的外科修复已经非常成功的手术死亡率较低(4),正常的血流动力学效果,术后生活质量(5]。但心力衰竭(HF)可以是一个晚期的并发症在多达40%的冠心病adult-aged与冠心病6),是儿童心脏移植的频繁的指示(7]。在儿童年龄、冠心病和心肌病心力衰竭导致的占主导地位的原因是心脏移植(8),更少由于缺血性心脏病与成人相比年龄(8]。不幸的是,大多数孩子以来经历了冠心病手术修复,他们经常有高水平的HLA抗原抗体,增加他们的心脏移植的风险(9,10]。对于许多小儿心力衰竭患者来说,是一种自体的细胞再生策略将是一个比同种异体心脏移植(更好的治疗选择11]。

小儿心力衰竭的象征的先天心脏再生有限,可能是因为细胞损失超过先天的低数量的有限的再生潜力hCPCs [11,12]。从骨髓细胞疗法试验的成人患者(13和儿科患者的案例报告14,15)与终末期心力衰竭显示改善心脏功能。没有确凿证据这些接种细胞的显著的心肌细胞分化,提高函数的假设机制一直是旁分泌factor-mediated招聘天生的年度"特别关注国" (13,16]。

哺乳动物的心脏包含心脏干细胞或祖细胞(CPC)表达表面受体酪氨酸激酶c - kit。c - kit^积极的在人体组织细胞被发现最初的Anversa集团cardiac-derived祖细胞(CPC) (17]。现在人们普遍认为,c - kit^积极的细胞可以识别在儿科18)以及成年人的心(19]。几组报道,c - kit^积极的细胞来源于心脏组织可以区分在体外跳动的心肌细胞(20.]。我们报道了c - kit^积极的细胞同源的绿色荧光蛋白表达的心老鼠,扩大了秒,并管理与冠状动脉损伤小鼠由于APO-E缺乏症,本地化和血管壁内皮细胞分化[21]。后在体外扩张,有很多好处当c - kit的报告^积极的确定特别关注国管理损伤模型。早期的证据进行成人慢性心力衰竭患者的临床试验表明改进管理后心脏功能在体外扩大自体cardiac-derived hc-kit^积极的细胞(22]。

这些考虑集中我们的利益的在体外扩张hCPCs自体的细胞治疗儿科患者冠心病和终末期心力衰竭。迄今文献中描述的方法依赖于酶破坏组织和媒体的补充与生长因子(22]。与现有的监管约束,hc-kit的推导方法^积极的细胞可能产生问题与使用酶消化和文化补充剂可以引入non-autologous蛋白质,潜在的抗原,异种的感染风险以及改变细胞表面蛋白标记所需精确细胞特征(18,23]。我们以前报道,悬挂外植体培养(SEC)小鼠心脏组织促进c - kit的无损推导^积极的细胞和扶持在体外c - kit的扩张^积极的细胞(21]。本文的目的是描述的应用交会人类心脏组织促进hc-kit的选择和扩张^积极的细胞具有干细胞特性。

2。方法

2.1。病人

本研究所有儿童医院的机构审查委员会批准(IRB 07 - 0028)。2007年11月至2010年11月25日儿科患者手术对冠心病或原位心脏移植的终末期心力衰竭先天或后天性心脏病被纳入本研究。所有患者在儿童年龄范围;组平均年龄为4.6岁(范围:4天到16.5年)。13例,选择跨度的小儿年龄患者16年(8天),因心脏组织细胞移民的时机和再现性使用交会确定。c - kit的表征^积极的人口来自所有患者进行细胞()使用单克隆抗体。最后,从三个患者右心房附件组织被用来确定收益率和c - kit的浓缩^积极的随着时间的推移细胞。

2.2。组织块培养

细胞移植心脏组织文化的移民已经前所述[24]。我们还认识到,这些移民细胞表达干细胞标记(21]。外植体培养方法中使用这个报告是用于patient-derived,丢弃的心脏组织从之前报道文化方法小鼠心脏组织(21]。这种方法,认为这里是悬挂外植体培养(SEC)是基于修改的方法最初被梅西纳et al。24史密斯),后来修改等。23]。使用无菌技术,收集废弃的人权心房附件,重,剁碎。剁碎组织被放置在高葡萄糖(4500 mg / L)杜尔贝科的最小基本媒体(DMEM;表达载体,与添加20%胎牛血清(美国)FCS;英杰公司、美国)和抗生素(青霉素和链霉素;英杰公司、美国)。t - 75聚丙烯培养瓶(美国康宁公司),50毫升的完成媒体补充道。这更高的体积是一个重要的修改,以确保组织仍然暂停,不成为附着表面的长颈瓶。所有文化都保持在37°C调湿室空气在95% / 5%股份有限公司₂。每三天,3毫升的DMEM + FCS被移除,同等体积的新鲜完整的媒体了。是注意不要破坏文化在处理。为此,重新喂料仅限于~ 6% v / v交流的媒体。这种喂养策略的基本原理是保存任何所提供的“条件反射”假定的旁分泌因素来源于留存cocultured组织而新建的营养成分。文化进行每日使用一个倒置显微镜(美国徕卡)。

2.3。加工和表征的外植体和移民细胞

细胞计数或描述,整除的松散附着移民细胞只是吸气集合不使用酶消化。贴壁细胞收获后短暂(不到30秒)酶治疗(0.2% / 1毫米胰蛋白酶/ EDTA;英杰公司、美国)。所有收获细胞立即固定在悬挂在10%中性缓冲福尔马林(NBF)交联,减少损失的临界表面膜抗原表位。此外,固定还稳定高度脆弱,多细胞cardiospheres之间的空间关系,使保留细胞在这些结构。固定的单个细胞的收成和多细胞cardiosphere样本准备层在幻灯片的离心(1000 rpm@5分钟,Shandon Cytospin,热科学、美国)。

Immunohistological表征tissue-derived单细胞和多细胞cardiospheres进行如前所述[21]。本研究的目的,c - kit^积极的细胞被认为是代表年度"特别关注国"在小儿心脏和类似于cardiosphere-derived细胞从成年人的心18,23]。描述面板包括单克隆抗体(美国Vantana或圣克鲁斯生物技术,美国)干细胞标记(c - kit或CD117、本来Isl-1)转录因子(GATA-4和Nkx2-5),和分化/谱系标记(Flk-1、平滑肌肌动蛋白、肌钙蛋白I,心脏肌球蛋白轻链2阳性肌动蛋白、CD45、和CD34)。SEC也固定在10%后心脏组织NBF和加工为制备石蜡组织切片苏木精和伊红()),三色的,或免疫组织化学染色。被确定在固定组织和细胞增殖细胞cytospin准备通过免疫组织化学染色使用增殖细胞核抗原(PCNA);圣克鲁斯生物技术,美国)25];只有核染色(中期)被认为是积极的。CD34、CD45抗体(美国Vantana)被用作内部负控制。控制包括肿瘤组织、正常心脏组织、平滑肌和骨髓。记者发色体3,3′Diaminobenzidine (DAB)启用可视化结合抗体。细胞和组织immunopreps与苏木精复染色。

2.4。中国共产党收益率从证券交易委员会

估计hc-kit的数量^积极的从证券交易委员会和细胞在体外hc-kit^积极的细胞增殖,一式三份次级样本(~ 0.1 g)从每个病人的心脏组织()置于个人T-25聚丙烯培养瓶(美国康宁公司)包含30毫升DMEM完成。交换百分之十的每种文化的媒体是新媒体每3天。文化收获7天、14、21、28天。用于计数,不依从细胞收集使用温和的愿望和附着细胞收获非常短暂的胰蛋白酶化。

c - kit^积极的细胞被immunomagnetically选为之前报道(26)使用高亲和力的单克隆抗体进行c - kit在含铁纳米颗粒(EasySep包# 18757;干细胞技术,CA)。选择(c - kit^积极的)和nonselected (c - kit^负)细胞被手动使用血细胞计数器计数。c - kit总^积极的细胞数量为每个样品测定时间点和测量组织湿重。

3所示。结果

收集废弃的右心房附件,在可能的情况下,平均体重在无菌条件下之前秒。湿重1.19克(;范围:0.21到10.9 g)。

与证券交易委员会、自发移民phase-bright单核细胞从暂停观察移植心脏组织培养的心房组织从所有25个慢性心力衰竭患者(图1(一))。移民phase-bright细胞松散附着在瓶的底部,最初作为单个细胞(箭头)和白天21表现为紧密的聚集显示克隆扩张(图1 (b);矩形框)。秒有一个刻板时间移民和扩张cardiac-derived hc-kit^积极的细胞观察25例病人样本无论病人年龄或诊断。最初的移民细胞相比,从右到左心房附件13儿科患者选择小儿年龄跨度的病人(8天16年)如图2。

(一)

(b)

图1

代表相衬显微照片的细胞移民和扩散秒。(a)自发移民phase-bright细胞(绿色箭头)“萌芽”或新兴从暂停心房组织的切割面秒。放大的第七天400年。(b)松散连接phase-bright单个细胞(箭头)和细胞聚集体(箱)天21秒。放大250年。

移民阶段亮细胞最早最早观察到第四天,直到天11(图2)。的平均time-to-first移民RAA和LAA组织没有不同(8和8.6天;)。然而,有一个长时间的趋势与病人的年龄(移民)。

的一些细胞第一次移民表示c - kit(图3(一个))。之间的10 - 14天,一个小族群的c - kit^积极的细胞自发聚集形成球体结构(图3 (b))称为cardiospheres [24]。Cardiospheres最初由c - kit^积极的细胞(图3 (b))和较大的人口里散布着许多c - kit^积极的单个细胞。起初,cardiospheres很小(~ 30μ米)但在28天细胞组成的球体的数量增加形成大直径> 150嗯cardiospheres。Cardiospheres类似于胚胎干细胞形成的拟胚体(27)和之前报道,代表cardiac-derived c - kit的克隆扩张^积极的细胞(24]。图3是一个代表性的显微照片的c - kit表达细胞(图3(一个))和cardiospheres(图3 (b))在秒后28天。c - kit表达指出单独发生细胞和多细胞SEC-derived cardiospheres 25例。我们之前报道的持久的c - kit^积极的表达式使用流式细胞仪分析细胞的SEC培养小鼠心脏在文化[12周21]。

(一)

(b)

图3

^积极的 ^积极的 ^积极的 ^积极的移民细胞c - kit的识别。(一)群c - kit细胞从cytospin准备后28天文化(c - kit细胞(光-和深棕色的箭头)可视化使用记者发色体轻拍核苏木精复染色(浅蓝色)。放大630.。年。(b)代表cardiosphere由多个单元主要是c - kit(箭头)(布朗black-nickel-toned民建联和浅蓝色核苏木精复染色)。放大400年。

14天、28天的评分之间的交会,c - kit^积极的细胞表达的转录因子GATA-4(图4(一)(图2.5)和Nkx4 (b)在中胚层祖细胞中表达的)28]。心脏肌球蛋白轻链(图后28天4 (c))和肌钙蛋白I(图4 (d)在一些的c - kit)表示^积极的细胞是符合他们的心肌细胞的命运29日]。Immunoselected hc-kit^积极的由SEC没有表达造血细胞谱系CD45和CD34。Immunoselected hc-kit^积极的由SEC也主要为阴性细胞本来就和Isl-1而一些细胞来源于cardiospheres表达本来就和Isl-1(没有显示)。

(一)

(b)

(c)

(d)

图4

在体外 ^积极的 ^积极的 ^积极的 ^积极的 ^积极的 ^积极的 ^积极的 ^积极的 ^积极的 ^积极的 ^积极的分化hc-kit细胞。代表显微照片的移民和immune-selected hc-kit细胞中胚层的展示表达标记(叫4和Nkx 2.5)和心脏分化(Mcl-2和简单)。单克隆抗体绑定使用轻拍记者发色体可视化(棕色)和核苏木精复染色(蓝色)。(一)叫4hc-kit细胞。放大630.。年。(b) Nkx 2.5hc-kit细胞。放大20.。0年。(c) Mcl-2hc-kit细胞在28天。放大630.。年。(c)简单hc-kit细胞在28天。放大630.。年。注意:hc-kit细胞呈阳性4抗原表位。

在基本培养基补充20% FCS,移民hc-kit^积极的细胞会只有增殖和生存在体外如果cocultured心房组织。秒,净细胞自发移民数量从组织和扩散随时间增加,14至21天达到高峰,(表1)实际上增加了一倍多。的净数量immunoselected hc-kit^积极的细胞在天7、14、21、28估计表1从组织的一式三份的决定慢性心力衰竭患者。值得注意的是,在21天,hc-kit^积极的细胞代表大约5%的移民,或约240000细胞/ g组织。(表1)。


	在文化时间(天)
	7	14	21	28

组织:瑞士法郎^积极的()
总细胞数*
c - kit^积极的手机号*
% c - kit^积极的	13.6	2.7	5	4.4

*意味着±sem细胞/毫克湿重。

秒,人类心脏组织从心力衰竭患者可以保持长时间。值得注意的是,28天培养心房组织保留相当普通的显微镜图像(图5(一个))和肌动蛋白^积极的心肌细胞保留有条纹的收缩元素(图5 (d))。增加少量间质结缔组织被三色的染色(图表示5 (b))。增生的间质单核细胞被核PCNA免疫组织化学染色(图表示5 (c))。

(一)

(b)

(c)

(d)

图5

^积极的描述秒。代表后心脏组织的显微照片的组织部分formalin-fixed石蜡包埋心房组织。终末期心力衰竭患者的心房附件当时移除心脏移植和培养使用美国证交会方法28天。(一)28天组织外植体与苏木精染色(蓝色)和伊红(红色)。注意保存心肌细胞形态学和小有核间质细胞(箭头)。放大630年。年。(b) 28天组织外植体和三色的染色。注意,在间质结缔组织适度增加(蓝色;箭头)。放大630年。年。(c) 28天组织外植体应用演示增殖间质有核细胞。增殖细胞核抗原(PCNA细胞是棕色(DAB)与苏木精复染色(蓝色)。放大400年。为阳性(d) 28天组织外植体应用肌动蛋白是棕色(DAB)和苏木精复染色(蓝色)。注意保护myocellular收缩元素可见cross-striations(箭头所指)。放大630年。年。

4所示。讨论

c - kit^积极的细胞可以从右心房附件的儿童慢性终末期心力衰竭。c - kit^积极的在正常的人类心肌细胞极为罕见和实际数量是有争议的。c - kit的估计^积极的细胞从低至0.0005%的细胞(~ 100细胞/ g)在成人的心2)0.01%的婴儿心脏细胞(22,30.]。共焦显微镜的部分从儿科患者的右心房,c - kit^积极的细胞平均3.2至8.9%的细胞包括心肌细胞(18]。基于证据,证交会的心房附件从心脏在儿童慢性终末期心力衰竭导致的孤立单一hc-kit ~ 240000^积极的细胞/ g。秒,~ 5%的所有派生细胞是c - kit^积极的(表21天1)。这重要的浓缩虽然小于由史密斯et al。23使用一个更梅西纳等人的劳动密集型的修改方法。经过选择的松散附着细胞和cardiospheres后跟两个段落,略低于20%的细胞是c - kit^积极的(23]。

多种因素可能导致hc-kit的浓缩^积极的细胞通过与秒秒。组织不解决瓶表面上,在我们的经验以及其他人,减少快速组织导致纤维母细胞增生的纤维母细胞移民文化。我们推测,选择组织移民和移民可能导致这个明显的富集“第一反应者”,如图所示,包括年度"特别关注国"(图1)可能从利基市场在心房组织动员31日]。hc-kit的浓缩^积极的细胞指出与SEC也可能是由于增加了在体外生存和/或扩散。细胞计数实验的一个限制是,immunoselected c - kit的数量^积极的细胞的报道在表1可能包括CD45^积极的c - kit^积极的细胞内皮祖细胞(32)或肥大细胞(33]。然而在他们的描述,c - kit的大部分^积极的CD45细胞检查被发现^负的,因此可能cardiac-derived干细胞或祖细胞(18,34]。

秒,hc-kit的时机^积极的细胞从心房组织移民趋势是长在儿科病人年龄的范围(图2)。在综合研究中,Mishra等人描述了hc-kit百分比减少^积极的细胞作为年龄的函数(18]。可能会有相似的年龄差异hc-kit的收益率^积极的细胞用秒额外的病人数字在不同的年龄。

的推导hc-kit^积极的年度"特别关注国"由证券交易委员会包括实质性修改的方法最初被梅西纳et al。24),现在广泛应用(35]。SEC的修改列表如下:组织与Ca没有洗^{+ +}毫克^{+ +}无磷酸盐溶液(PBS);组织没有消化三次5分钟0.2%胰蛋白酶和0.1%胶原酶IV;杜尔贝科的修改基本培养基(DMEM)是用来代替Iscove修改的杜尔贝科的媒体;DMEM没有补充2更易与L谷酰胺,0.1 L 2-mercaptoethanol更易与凝血酶,bFGF, EGF, cardiotrophin;为秒,增加了额外的媒体,这样组织外植体停牌特别要避免接触培养瓶表面。通过暂停组织,contact-dependent纤维母细胞产物是最小化。没有酶消化,添加外源酶是可以避免的。SEC消除酶消化的组织外植体,可能会影响细胞表面特征依赖于免疫反应性的标记。

我们以前所示的小鼠模型的心脏组织预防在体外移民c - kit扩散^积极的细胞在相同的文化条件下使用本(21]。添加未分离骨髓也支持在体外移民c - kit扩散^积极的细胞,消除混淆可能性的“支持效应”心脏组织是提供持续供应新移民的细胞。我们已经初步报告说,移民hc-kit^积极的细胞基本媒体补充20% FCS只会增殖和生存28天在体外如果cocultured他们的心脏组织36]。从技术的角度来看,hc-kit的推导^积极的病人管理细胞没有采用同种异体或异种的蛋白质之前病人管理改善,使翻译未来临床试验从监管和患者安全的角度。c - kit^积极的年度"特别关注国",以及从骨髓干细胞被认为促进在活的有机体内居民细胞的增殖和/或分化成心肌细胞通过旁分泌作用[18,34]。鉴于非凡的组织保护指出心房附件后秒(图5我们推测组织增殖和/或旁分泌作用年度"特别关注国"的生存。支持的潜在价值交会模型的心脏旁分泌功能,Schittini等人报道,媒体受制于心脏组织促进了cardiomyogenic分化的间充质干细胞(37]。

5。结论

进展报告所包括SEC hc-kit的技术演示^积极的细胞可以来源于心脏衰竭的儿童患有慢性终末期心力衰竭。这些迁徙的细胞增殖在体外并且可以丰富。此外,hc-kit^积极的细胞可以孤立与SEC没有酶消化。由于酶消化是避免,细胞特征不太可能影响细胞复苏。在临床再生策略基于自体tissue-derived年度"特别关注国",优化细胞特性是一个至关重要的安全目标。证交会是宽容的时间扩散,后来心脏分化。在特定的,我们推测的旁分泌影响cocultured自体心脏组织排除需要补充与昂贵的“生长因子”和涂层的玻璃瓶是临床试验的安全问题。这些发现表明,进一步研究消除FCS的使用,SEC可以翻译好儿童自体干细胞策略与最终阶段高频。

确认

作者感谢所有儿童医院的人导致了这项研究。特别感谢手术移植团队,手术和移植护士协调员,威廉•Schleif的技术援助和病理学和实验室医学组织学实验室。这项研究是由美国心脏协会支持,Suncoast心血管和教育基金会,从运动员心脏基金会和贡献,儿童优先一个倡议,基瓦尼俱乐部向所有儿童医院基金会。

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干细胞国际

心脏细胞再生潜力的儿科患者心力衰竭阶段:结束可翻译方法丰富和传播

文摘

1。介绍

2。方法

2.1。病人

2.2。组织块培养

2.3。加工和表征的外植体和移民细胞

2.4。中国共产党收益率从证券交易委员会

3所示。结果

4所示。讨论

5。结论

确认

引用

版权

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