血液和Neurological-Expressed序列1基因产物在纽特视网膜祖细胞的发展

文摘

Urodele两栖动物如日本普通蝾螈的再生能力神经视网膜受伤,即使他们已经成年。我们发现血液-和neurological-expressed序列1 (Hn1)基因在脱色诱导视网膜色素上皮(RPE)细胞,和它的表达在后期维护的蝾螈视网膜再生。在这项研究中,我们调查的分布HN1蛋白质,HN1基因的产物,在发展中视网膜。我们建议HN1蛋白免疫组织化学分析是一个不成熟的视网膜中高度表达,和亚细胞定位改变retinogenesis纽特视网膜再生中观察到。我们还发现Hn1基因的表达并不是诱导小鼠视网膜后删除。我们的研究结果表明,Hn1基因可以用于检测未分化肉瘤细胞在纽特视网膜发育和再生。

1。介绍

脊椎动物视网膜是一个组织专门在接受光子产生电子信号发送到大脑。神经视网膜是一个高度有组织的神经组织,这是在哺乳动物无法再生。相比之下,Urodele两栖动物如日本常见的蝾螈(Cynops pyrrhogaster)有一个惊人的再生能力他们的视网膜,即使成人(1,2]。研究视网膜再生的过程有助于理解神经视网膜的机制形成和拯救患者失明。

蝾螈的再生过程视网膜形态已被调查多年(3,4]。当神经视网膜手术切除从纽特的眼睛,再生发生在下列顺序(5,6]。首先,剩下的视网膜色素上皮(RPE)细胞失去色素颗粒(脱色)和transdifferentiate视网膜祖细胞(7- - - - - -9]。随后,这些视网膜祖细胞增殖并分化成神经元和胶质细胞重建神经视网膜(10]。视网膜再生过程通常在5 - 6周内完成,和蝾螈恢复他们的视力大约在3个月时,视觉神经连接到大脑中的视觉中枢(11]。虽然它已经表明,大部分的视网膜再生的过程类似于视网膜的发展(10,12- - - - - -15),RPE细胞的去分化再生是一个独特而重要的事件。

我们进行差异显示分析,发现血液,和neurological-expressed序列1 (Hn1)基因调节后几天内清除视网膜(16]。Hn1基因最初是被唐之一和他的同事在小鼠胚胎,据报道,表达更丰富的大脑和造血细胞的胚胎比成年人17]。Hn1同源的基因的基因组中发现了不仅脊椎动物,无脊椎动物,形成一个进化保守基因家族(18]。据报道,的产品木星,一个果蝇脊椎动物的相同器官Hn1,绑定到微管在体外和在活的有机体内(19]。在脊椎动物,Zujovic和啮齿动物的同事确认Hn1基因与自发的运动神经元再生(20.]。劳克林和同事进行的可拆卸的分析使用黑素瘤细胞系B16转椅Hn1基因。F10,表明Hn1基因起到了抑制增殖分化的细胞(21]。在目前的研究中,我们调查了Hn1基因的表达在视网膜形成和讨论其翻译产品的作用(Hn1蛋白质)。

2。材料和方法

2.1。动物

日本成人常见的蝾螈(Cynops pyrrhogaster)从滨松Seibutsu Kyozai(日本滨松)。纽特幼虫饲养如前所述[22]。小鼠C57BL / 6 j的品种名称,从日本Doubutsu有限公司购买,(日本大阪)。在全身麻醉下使用戊巴比妥钠(日本住友制药有限公司、大阪、日本),眼睛是沿途背侧角膜缘的一半。后缝合切口晶状体和视网膜。正常的老鼠被关在笼子里直到安乐死的二氧化碳气体。蝾螈和老鼠,大阪大学的动物实验指南。

2.2。免疫组织化学

整个蝾螈胚胎固定(如前所述)(22]。胚胎的发育阶段,按照标准确定冈田克也和川23]。Cryosections的8 - 10μ厚度是干65°C和4%多聚甲醛固定再次PBS。部分被封锁与块解决方案(包含3% BSA PBS,山羊血清,1%和0.4% Triton x - 100),和孵化anti-HN1抗血清稀释1:100块一夜之间解决方案在4°C。洗后PBST (0.1% Tween20 PBS)几次,部分是孵化Alexa Fluor488-conjugated anti-mouse免疫球蛋白(生命技术)稀释1:500年PBST,在室温下1 h。在4°C的抗血清与重组preincubated HN1一夜之间被用来作为消极的控制。细胞核的染色部分孵化了1g / mL溴化乙锭PBST 15分钟。使用荧光显微镜荧光信号检测BX50(奥林巴斯、东京、日本)或共焦显微镜系统FLUOVIEW(奥林巴斯)。

2.3。过度的HN1 COS7细胞

的完整编码区Hn1 cDNA之间插入EcoRI哺乳动物表达载体和XhoI网站,pcDNA3(技术)。COS7细胞被稀释至1 - 5×10⁴细胞/菜60毫米盘37°C的5%的股份有限公司₂孵化器。采用免疫分析、盖玻片(30毫米)放在盘子的底部前稀释。接下来,介绍了构造与FuGENE6(罗氏诊断k . k .)根据制造商的协议。空pcDNA3向量作为负控制转染。

COS7细胞的免疫组织化学,样本与4%多聚甲醛固定在PBS转染后48 h。我们进行包埋cryosections上述免疫组织化学染色的方法,以下改变:(1)细胞孵化与anti-HN1抗血清稀释1:100和antitubulinα抗体(实验室有限公司愿景,Fremont, CA)稀释1:150块解决方案;(2)生物素化的anti-rabbit免疫球蛋白(1.5 mg / mL,向量实验室Inc .,伯林盖姆,CA,美国)稀释1:100年是用作二次抗体,然后这些细胞被洗轻轻PBST和对待Cy 3-conjugated链霉亲和素(杰克逊ImmunoResearch实验室,Inc .)、西树林,PA,美国)解决方案,微管蛋白的检测;0.5(3)细胞治疗克/毫升Hoechst33258(技术)核染色。

2.4。rt - pcr分析

总rna被等基因筛选了(Nippongene有限公司、东京、日本)的小鼠视网膜切除后洗眼杯。随后,互补dna合成使用逆转录酶M-MuLV(罗氏诊断K·K。、东京、日本)和pd (T)_{12 - 18}(通用电气医疗集团),用作PCR扩增Hn1和模板β肌动蛋白(内部控制)。寡核苷酸引物设计如下:mHn1rtf1 5′-GCCTCGAGGTGGGTCCAATTTTTCATT-3′, mHn1rtr1, 5′-GCGTCGACTGGCTTCTCCTCCATCTG-3′,鼠标Hn1 cDNA放大的;和mActinf1 5′-GAACATGGCATTGTTACCAACTGG-3′, mActinr1: 5′-AGCATAGCCCTCGTAGATGGGC-3′。35周期的PCR在94°C进行了30秒,30秒56°C, 72°C,持续60秒。

3所示。结果

3.1。在发展中纽特视网膜HN1蛋白的表达

我们之前的研究表明,Hn1基因被诱导RPE细胞在早期阶段纽特视网膜再生(16]。澄清HN1蛋白质的分布在视网膜的形成,我们进行了免疫组织化学分析HN1蛋白质的蝾螈胚胎。在发育阶段28日视杯从神经管外翻。的免疫反应性anti-HN1观察抗血清不仅在整个眼睛,而且在假定大脑和内脏(数字1(一)和1 (b))。在32个发展阶段,眼睛大,表皮接触视网膜凹入镜头。HN1蛋白的免疫反应性还观察到在整个视网膜(数字1 (c)和1 (d))。在37个发育阶段,当一个分层组成的镜头和视网膜神经细胞形成,anti-HN1的抗血清认识到每一个细胞的边缘地区(数字1 (e)和1 (f))。在发育阶段,42岁的丛状层和RPE层形成时,观察HN1蛋白的免疫反应性尤其是网状层(数据1 (g)和1 (h))。HN1的免疫反应性也被发现在内侧外侧区域(箭头人物1 (e)- - - - - -1 (h))。HN1-immunopositive细胞可能是视网膜祖细胞在ciliarly边缘区。这些数据表明HN1蛋白表达的高度未分化细胞在视网膜的正常发展。

然后,我们检查细节HN1蛋白质在发展中纽特视网膜的double-staining实验(图2)。HN1蛋白的免疫反应性是重叠的细胞核成熟视网膜发育阶段28(数字2(一个)- - - - - -2 (c))。虽然HN1的免疫反应性蛋白在细胞核没有被观察到后来发展阶段42(数字2 (d)- - - - - -2 (f))。这些结果符合我们之前的研究视网膜再生纽特(16),这表明HN1蛋白质扮演类似的角色在开发和蝾螈的再生神经视网膜。

3.2。过度的蝾螈HN1培养细胞的蛋白质

超表达无特征的分析蛋白质在培养细胞可以是一个有用的方法来解决蛋白质功能。我们介绍了Hn1基因在COS7细胞和调查anti-HN1抗血清的免疫反应性。是表示,这些信号来自外生纽特HN1蛋白质,而不是内在HN1蛋白质,因为没有信号负控制实验观察。免疫反应性是完全在COS7细胞(图3(一个))。特别是,相对较高的免疫反应性观察胞质和细胞过程(箭头在图3(一个))。Karpova和同事显示的产品木星微管(基因有约束力的能力19]。因此,我们研究了纽特的超表达是否HN1 COS7细胞的细胞骨架蛋白的影响。微管蛋白观察联免疫反应性的信号,显示不同的模式从HN1蛋白质(图3 (b))。微管模式从周围无特征的细胞,缺乏外源HN1蛋白质(图3 (c)),这表明HN1超表达的蛋白质并不影响微管网络。

3.3。鼠标Hn1 mRNA的表达在视网膜后RPE细胞清除

我们使用小鼠作为模型,缺乏自发再生的能力。四天后的神经视网膜从老鼠的眼睛,大多数色素细胞层巩膜,但部分细胞层分离,色素细胞被发现的眼内腔(数据没有显示)。色素细胞层的外观是相似的在手术后18天。我们的观察没有反驳的以前的报告retinectomy导致上皮细胞的迁移,发展与液泡的多层在兔子的眼睛24]。我们检查了Hn1基因的表达在鼠标通过rt - pcr(图洗眼杯4)。Hn1 mRNA表达小鼠正常视网膜和RPE细胞。视网膜去除后,鼠标Hn1基因的表达水平几乎相等,表明老鼠Hn1基因没有诱导剩下的RPE细胞或其他,与纽特。upregulation Hn1基因可能是一个独特的现象中去分化RPE细胞。

4所示。讨论

我们的研究中最重要的发现是,纽特HN1蛋白质亚细胞定位的改变按照成熟的蝾螈视网膜在视网膜发展(图2)和再生16]。周和他的同事进行的超表达分析人类HN1蛋白融合GFP在海拉细胞。他们建议GFP信号积累在细胞核,因此建议HN1是核蛋白(18]。他们预测共识序列(PVRKNKM)核本地化HN1蛋白质的序列分析。纽特HN1蛋白具有相同的序列(PVRKHKM)作为人类HN1蛋白质在相应的位置,和HN1蛋白的免疫反应性是重叠的细胞核发育阶段28(图2)。

相比之下,荧光显微观察Jupiter-GFP表达融合蛋白的转基因果蝇表明,木星本地化的微管网络中通过细胞周期19]。孤立Jupiter-GFP重组蛋白质直接结合到微管或表示microtubule-associated蛋白质。纽特HN1的免疫反应性蛋白在细胞核没有本地化后发展阶段(图2),在COS7细胞(图3)。应该注意的是,相对较高的免疫反应性是观察到的过程和在COS7细胞中微管(图3 (c)箭头)。HN1蛋白质的表达水平可能在COS7细胞中是足够高的饱和微管蛋白的结合位点,释放的信号HN1观察细胞溶质和细胞核不影响细胞骨架的外观。HN1蛋白质可以在扮演多个角色的形成和维护神经组织。

劳克林和同事进行了一个有趣的研究脊椎动物Hn1基因的功能(21]。他们调查的影响基因抑制黑色素瘤B16转椅的内在Hn1。F10细胞。B16转椅。F10细胞黑素原生成活动像RPE细胞。对Hn1引入特定的核基因导致B16转椅杀菌作用。F10 melanogenic蛋白表达增加,细胞酪氨酸酶和TRP2,促进肌动蛋白之间的相互作用和Rab27a蛋白质参与melanosoma的分泌途径。他们还表明,击倒Hn1诱导G1 / S细胞循环逮捕从免疫印迹分析的因素参与了细胞循环和细胞生长信号。因此,他们得出的结论是,Hn1基因抑制细胞分化。劳克林的结果一致,观察纽特HN1蛋白质的强烈的免疫反应性不成熟视网膜显示活跃的增殖视网膜祖细胞(图1)。

Hn1家族基因的基因组中发现了各种脊椎动物和无脊椎动物。然而,Hn1无特征在大多数动物的功能。啮齿动物的表达Hn1被Zujovic相比,同事在四个不同的轴索显微外科术模型:面部神经轴索显微外科术在成人和新生儿,迷走神经切断术,和红核脊髓的束切断术,这表明啮齿动物Hn1调节只有在一些外围神经元可再生自发(20.]。以前,我们表明,纽特Hn1基因调节视网膜后删除了rt - pcr (16]。然而,rt - pcr分析在这项研究显示,老鼠Hn1基因并不是诱导视网膜后删除(图4)。这些结果可以支持假设动物Hn1基因相关的表达在脊椎动物神经再生的能力。

我们的免疫组织化学分析表明,HN1蛋白强烈表达多能细胞在正常发展。纽特Hn1基因调节的表达在脱色RPE细胞的早期视网膜再生(16),这意味着脱色RPE细胞有一个性格像干细胞。之前的upregulation Hn1基因的转录因子,Ngn-1,对视网膜形成Pax-6,重要6,25]。Hn1基因可能是一个可用的制造商来检测dedifferented细胞或干细胞在成人组织。

5。结论

纽特HN1蛋白是高度活性的表达在视网膜形成的早期发展和再生,而不是调节小鼠肉瘤RPE细胞缺乏能力去到祖细胞。也建议HN1蛋白质改变其亚细胞定位从核细胞溶质在纽特神经视网膜的形成。可用的upregulation Hn1基因可能是一个制造商检测dedifferented细胞或干细胞在成人组织。

确认

作者感谢Masafumi松下博士和教授Hiroshi金泽(大阪大学)赠送COS7细胞和教他们方法处理细胞,和教授Hiroki Nishida(大阪大学)有益的讨论。这项研究是特别协调基金赠款支持促进科技拨款(SCF)和援助从日本教育部科学研究,科学,体育,和文化。

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