推导的神经祖细胞和视网膜色素上皮细胞从普通狨猴和人类的多能干细胞

文摘

胚胎干细胞和诱导多能干细胞(万能)来源于哺乳动物是有价值的工具,用于模拟人类疾病,包括视网膜退行性眼病,导致视力丧失。恢复视力集中在移植的神经祖细胞(npc)和视网膜色素上皮(RPE)视网膜。在这里我们使用转基因普通狨猴(Callithrix jacchus)和人类多能干细胞携带增强型绿色荧光蛋白(eGFP)记者作为视网膜模型系统分化。使用悬挂和随后的贴壁分化文化,我们观察到自发的在体外分化,包括npc和色素颗粒的特征分化RPE细胞。视网膜细胞来源于人类和普通狨猴多能干细胞提供安全性和免疫细胞来源不限测试兼容性自体或同种异体移植后使用非人灵长类动物在早期转化应用。

1。介绍

小说的应用干细胞为基础的治疗已经彻底改变了退化性疾病是如何接近的。鉴于干细胞分化的倾向神经元通路,影响神经系统疾病和相关的组织,如视网膜,是很有价值的。视网膜疾病,如年龄相关性黄斑变性(AMD)、色素性视网膜炎、功能性失明和黄斑变性疾病,使个体通常的结果受损或功能完全丧失的感光细胞或支持视网膜色素上皮(RPE) [1- - - - - -3]。支持在活的有机体内移植,现成的和有效的协议获取供体神经视网膜和RPE细胞是必需的。

先前的研究已经证明了人类胚胎干细胞的能力(为)和人为多能干细胞(HIPSCs)与RPE细胞分化成形态、功能和分子表型(4,5]。迄今为止,HESC、HIPSC和fetal-derived RPE一直用于研究移植可以纠正视网膜退行性疾病的程度(2,5]。营养不良的临床前研究老鼠报道的能力HESC-derived RPE细胞挽救视功能(1]。

之前HESC或HIPSC衍生品可用于临床的设置,这些细胞的安全性和再现性必须大力进行动物模型。尽管使用转基因小鼠的价值在早期的研究中,跨物种差异常常阻碍疗效和风险评估在临床前研究中,一般不适用于评价免疫反应。另一方面,非人类灵长类动物提供有价值的,很少利用,工具扩展的啮齿动物模型可能更相关的再生医学。由于其同源性和高度生理学与人类相似,一些种类的猴子已经被用作临床非人灵长类动物模型。最近,常见的绒猴猴(Callithrix jacchus)已被确认是一个有成本效益的和易于维护非人灵长类动物模型的生物医学研究的兴趣(6]。

推导Callithrix胚胎干细胞(塞斯克)打开了机会研究人类早期胚胎发育相关的各个方面,以及使用这些细胞获得功能的细胞类型在体外和在活的有机体内研究[7,8]。然而有一段限制创建了塞斯克线的长期培养。所以有必要利用线已成功导出以描述lineage-specific分化和探索他们的潜能。

转基因携带标志基因潜能干细胞分化研究是有价值的潜力和迁移在宿主组织。测试转基因在转基因的ESCs的功能,重要的是要实现稳定的基因表达在细胞分化的不同阶段(9]。这里,我们演示视网膜的推导过程,包括神经祖细胞(npc)和视网膜色素上皮(RPE),从稳定转染子的人类和狨猴多能干细胞携带增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的记者。

2。材料和方法

2.1。推导的人类诱导多能干细胞(HIPSCs)

包皮成纤维细胞(写明ATCC)杜尔贝科修改鹰的传播媒介(DMEM)补充10%胎牛血清的边后卫,1毫米Glutamax-I, 1毫米不必要的氨基酸(NEAA)。293英尺的细胞被用作包装、细胞系生成逆转录病毒。293英尺转染与pMXS-OCT4 FuGENE高清,-SOX2或-KLF4质粒,pHIT60包装和pVSV-G信封构造。两天after-transfection Medium-containing逆转录病毒收集。包皮成纤维细胞被感染逆转录病毒和保持在5%₂孵化器。两天后,细胞被山肩支线层和介质改为HIPSC介质(淘汰赛与敲除血清DMEM / F12补充替换,1毫米Glutamax-I, 1毫米NEAA, 55毫米2-mercaptoethanol和10 ng / mL FGF2)。使用200 HIPSC殖民地了μL吸管技巧四个星期after-transduction和维护在基底膜基质feeder-free文化StemPro(英杰公司)或mTESR介质(干细胞技术)。subcultivation, HIPSCs对待accutase(表达载体)1分钟,由离心收获,山肩到新matrigel-coated菜StemPro媒介。细胞系都保持在37°C和5%的公司₂。

2.2。人类胚胎干细胞和诱导多能干细胞的文化

Riv9 HIPSCs [10)是培养mTESR媒体(干细胞技术)Geltrex-coated tissue-culture-treated菜肴在5%的股份有限公司₂和37°C。细胞被subcultivated每隔5 - 7天到达80 - 90% confluency轻轻取出殖民地使用accutase和15毫米玻璃珠子。mTESR媒体每天补充。

2.3。文化Callithrix胚胎干细胞(塞斯克)

Cjes001 Callithrix胚胎干细胞(塞斯克)[8)保持在辐照小鼠胚胎成纤维细胞在生长介质(MEF)喂食器:淘汰赛高葡萄糖DMEM KOSR补充15%,1%不重要的氨基酸,Glutamax-I 2毫米,0.1毫米b-mercaptoethanol, 10 ng / mL bFGF。细胞用0.25%胰蛋白酶/经常通过EDTA的比率1:5 - 1:8每隔5 - 7天。

2.4。为其分化,HIPSCs,塞斯克

HESC和HIPSC文化之前保持mTeSR岩石抑制剂(RI)治疗,疗程1小时前分离成单个细胞用0.25%胰蛋白酶/ EDTA。细胞被resuspended STEMPRO媒体缺乏bFGF和山肩到non-tissue-culture-treated培养皿。Cjes001细胞使胰蛋白酶化、颗粒状和分化在塞斯克媒体缺乏bFGF non-tissue-culture-treated培养皿。分化细胞形成的聚合物称为拟胚体(EBs),代表组成的细胞分化生殖三层。

2.5。Nucleofection HESC HIPSCs

使胰蛋白酶化单细胞悬液于100年resuspendedμL prewarmed人类干细胞nucleofector解决方案1 (Lonza)。人类干细胞Nucleofector解决方案1中的细胞被转移到试管和4μ克的质粒DNA补充道。试管轻轻传得沸沸扬扬,敲了两台,插入的小型管固定器Lonza Amaxa Nucleofector II装置,并使用B-16 nucleofected程序。nucleofected细胞恢复在媒体和孵化prewarmed 37°C对馈线细胞金属堆焊前10分钟。

2.6。流式细胞术分析

Nucleofected细胞用0.25%胰蛋白酶/ EDTA分离。细胞球然后resuspended在250年μL清洗缓冲和受到流式细胞术的SC广达流式细胞分析仪(贝克曼库尔特)。

2.7。逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr),

总RNA分离使用锆RNA MicroPrep工具包(Zymo研究)。RNA浓度测量使用NanoDrop分光光度计(热科学)。合成第一链cDNA执行使用iScript互补脱氧核糖核酸合成装备(Bio-Rad)。互补脱氧核糖核酸合成半定量rt - pcr进行。每个rt - PCR反应包括PCR大师,底漆,下午0.3和0.3点反向引物,和cDNA、rt - PCR扩增95°C都开展了5分钟后退火和延伸。使用的正向/反向引物和退火温度对灵长类动物基因5′ACTB -ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG-3′, 3′-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-5′, 58°C;LRAT 5′-CTCATCCTGGGCGTTATTGT-3′, 3′-CCAGCCAT CCAT AGGA AGAA-5′, 49°C;NEUROD1 5′-AAGCCATGAACGCAGAGGAGGACT-3′, 3′-AGCTGTCCATGGTACCGTAA-5′, 55°C。rt - pcr扩增后产品上凝胶电泳观察到flash凝胶(Lonza)。

2.8。实时定量聚合酶链反应(Q-PCR)分析

Q-PCR执行使用Assay-on-Demand技术(应用生物系统公司)。每个反应由2.5μL 2 x TaqMan主混合,0.25μL TaqMan探针,1.25μL(水,1μL互补(100 ng,标准化基于管家基因控制)。PCR扩增95°C都开展了10分钟之后,42 95°C的周期为15秒和60秒60°C。每个样品进行PCR反应使用384 -实时CFX384 thermocycler (BioRad)。使用比较C Q-PCR数据进行了分析_T方法。Q-PCR进行重复从三个不同的互补脱氧核糖核酸样品。

2.9。免疫细胞化学

细胞被洗两次与PBS w / o Mg^{2 +}和Ca^{2 +}和4%多聚甲醛固定10分钟。固定细胞又洗了PBS w / o Mg^{2 +}和Ca^{2 +}。接下来,固定细胞被封锁与PBS w / o Mg 30分钟^{2 +}- - - Ca^{2 +}的清洗缓冲Triton-X驴血清含1%和0.1%。固定细胞培养在一夜之间在4°C主要抗体:波形蛋白,MAP2(细胞信号),OCT4、GFAP (Santa Cruz), SOX2(研发系统),SSEA3(微孔),和TUJ1 (Covance)。在4°C隔夜孵化后,主要抗体解决办法是删除。与清洗缓冲细胞随后洗两次。二次抗体被添加到染色细胞在黑暗中清洗缓冲和孵化25°C 1小时。后二次抗体孵育细胞被洗两次与缓冲洗5分钟在每次洗孵化的一步。细胞被安装在DAPI安装解决方案(Vectashield)并使用尼康成像Ti Eclipse和NIS-elements成像软件。

3所示。结果

3.1。推导eGFP-Expressing Callithrix和人类多能干细胞系

Cjes001 Callithrix胚胎干细胞(塞斯克)显示相似的形态学Riv9人类诱导多能干细胞(HIPSCs;图1(′))。未分化cjes001还表示OCT4 SOX2转录因子和stage-specific胚胎antigen-3 (SSEA3;图1(b))。在这些特点,绒猴的ESCs相似HIPSCs和为其11]。在初步研究中,我们比较了巨细胞病毒的功效和CAG发起人在推导稳定转染子cjes001塞斯克和Riv9 HIPSCs。这两个启动子以前称为强启动子在人类胚胎干细胞(为)和HIPSCs [10,12),但他们的活动在塞斯克不清楚。单细胞悬浮液nucleofected,瞬时转染效率的山肩喂食器,检查第二天(图2(a))。流式细胞术分析证明%,% cjes100细胞转染和pCMV-eGFP pCAG-eGFP表达eGFP标记基因,分别(图2(b))。因此,我们的数据表明,绒猴的ESCs HIPSCs[相比取得了较高的瞬时转染效率10]。

稳定转染子幸存的抗生素选择在两周内出现after-nucleofection。的频率稳定转染克隆可以恢复药物选择过程中不同HIPSCs和塞斯克。最佳剂量药物的选择是由用Geneticin杀死曲线(G418)和嘌呤霉素。500年μ克/μG418的L和1.5μ克/μL嘌呤霉素选择在cjes001转染子就够了,而200μ克/μL G418和1μ克/μL(嘌呤霉素专门为稳定的要素选择Riv9以最小的背景不抵抗的细胞。我们观察到的存在不同的eGFP-expressing殖民地pCAG-transfected Riv9和cjes001(数字2(c)和2(d))。相比之下,没有一个细胞eGFP积极在CMV启动子克隆携带,证实了先前的报道,巨细胞病毒启动子是高度沉默在多能干细胞(12]。这些转基因eGFP-expressing pCAG-transfected克隆继续表达SSEA3培养一个月后(图2(e))。因此我们证明转基因HIPSCs和塞斯克维护他们的多功能潜力。

3.2。视网膜祖细胞的分化

我们下一个试图描述这些eGFP-expressing转基因人类和非人类灵长类动物的潜在的ESCs分化成视网膜细胞相关的血统。Cjes001 Riv9细胞分离,转移到non-tissue-culture-treated盘子,和分化在媒体缺乏bFGF促进自发分化的细胞(图3(一个))。悬挂文化促使自由浮动的聚合物称为拟胚体的形成(EBs)。eGFP表达在这些细胞保留在体外分化,显示稳定的转基因集成(图3 (b))。Q-PCR多能性的差别分析显示对这些标记OCT4和SOX2在EBs(图3 (c))。

调查的影响转基因表达在中枢神经系统(CNS)和视网膜分化,我们山肩EBs在单层文化进一步分化的基底膜基质。细胞分散,扩大到单层EB产物,并欣然接受进一步分化(图3 (d))。稳定转染eGFP-expressing cjes001塞斯克分化神经祖细胞(npc)之后在体外分化。值得注意的是,类似的细胞的细胞形态观察在初级或HESC-derived神经祖文化13,14]。免疫细胞化学分析显示标记的表达代表不同阶段的神经家族承诺在EB产物,包括未成熟神经细胞波形蛋白标志(图4(一))。细胞EB结果还显示gial原纤维酸性蛋白(GFAP)免疫反应性,一个中间丝特有的星形胶质细胞在中枢神经系统和穆勒在视网膜细胞。细胞免疫反应性的细胞质microtubule-associated蛋白2 (MAP2)βIII-tubulin (TUJ1),两种标记的神经细胞,首次观察到金属堆焊后两周。

我们比较倾向的神经和视网膜谱系分化狨猴cjes001塞斯克,Riv9 HIPSCs。让人想起在绒猴自发分化细胞,与neuron-like人类多能干细胞引起细胞形态。然而,我们观察到波形蛋白的增加,MAP2, TUJ1, GFAP蛋白表达在Riv9 EB(图产物4 (b))。神经集群拥有长流程和激烈的TUJ1丝状染色,和那些为(15,16]。此外,当他们出现,GFAP-expressing细胞自组织成丝状骨料,表明一个更成熟的HIPSC-derived神经细胞的分化阶段。总的来说,这些结果表明,为和HIPSCs倾向于对神经血统而狨猴的ESCs区分。

3.3。隔离的视网膜色素上皮细胞

我们持续观察色素细胞殖民地在细胞的外观cjes001和Riv9 EB集群的产物。这种现象以前惊人相似的观察视网膜色素上皮(RPE)出现在支流文化来源于各种为和HIPSC线(17,18]。在我们的例子中,最密集的色素细胞位于EB的外围集群(图5(一个))。平均不到20%的cjes001 EB殖民地RPE结构分化。这些CESC-derived色素细胞表现出鹅卵石形态,证实RPE祖细胞(图的存在5 (b))。

进一步检查这些色素细胞的身份,我们精心挑选和孤立的色素上皮(PE)焦点使用吸管技巧和研究基因表达模式。尽管LRAT mRNA在未分化的ESC样本,类似于为其以前的报告(18),丰富了其表达在手动选择体育相比nonpigmented区(肺水肿;图5 (c))。我们还发现NEUROD1 bHLH转录因子的表达,表明终末分化的神经元,从而形成视网膜利基的孤立的体育细胞层。定量PCR分析显示,孤立的RPE收购相关的转录因子表达与一般神经视网膜感应(PAX6),眼睛领域规范(OTX2)和视网膜色素上皮(RPE65;图5 (d))。值得注意的是,有一个完整的损失在RPE OCT4 mRNA的表达,表明没有剩余的未分化的干细胞。

4所示。讨论

月初的一个关键挑战转化研究用人体干细胞是一个可靠的主机的可用性模型来评估临床应用的长期利益。非人灵长类动物都非常适合测试的安全性和可行性实验协议之前在人类细胞替代疗法。之前的报告,以及最近的研究已经开始显示,干细胞能改善各种退化性疾病的后果在非人灵长类动物19]。而人类多能视网膜神经干细胞的证据和RPE细胞迅速发展,相当于分化倾向狨猴的ESCs先前从未被探索。

基因操作的能力非人类灵长类动物的胚胎干细胞是中央在我们努力利用其巨大的潜力在再生医学中使用。而转基因狨猴的后代已经生成使用self-inactivating慢病毒(6),据我们所知这项研究是第一个报道转基因Callithrix胚胎干细胞系的推导。虽然慢病毒感染已被证明有效的生成稳定的要素,它的应用可以受到一些挑战,如大小限制插入DNA和向量的耗时的生产。这里我们报告,使用质粒窝藏CAG启动子导致无处不在的和高度稳定表达eGFP狨猴和人类的多能干细胞。我们的发现的重要性也凸显了启动子的选择在工程稳定的细胞系,为CMV启动子的活动是完全沉默后几个细胞分裂。

目前的研究表明视网膜神经细胞和色素上皮的推导eGFP-expressing稳定转染子。我们成功获得转基因Callithrix胚胎干细胞克隆细胞系允许使用这些记者跟随并追踪移植细胞在临床前研究。此外,目标基因击倒可以开发使用过度或短发卡RNA干扰(shRNAi)向量[20.)来研究人类疾病涉及特定基因功能的丧失在非人灵长类动物,包括亨廷顿氏舞蹈症(21),脊髓损伤(22),和帕金森病(23]。

承诺向视网膜家族是一个逐步的过程。尽管nonneural表型,RPE解剖和神经视网膜发育近24]。我们的研究结果表明,不同类型的视网膜神经细胞,以及RPE结构在体外,结果从一个正常的发展途径,可以复制使用狨猴和人类多能干细胞悬浮的文化。符合Osakada的发现(25),我们没有发现任何RPE-like色素病灶细胞直接分化从单层的文化。我们发现是一个必要的先决条件治疗策略基于细胞浓缩从人类和非人类灵长类动物的ESCs作为供体的来源视网膜细胞类型。

为了实现长期的目标,利用从非人灵长类动物多能干细胞,方法优化npc和RPE形成塞斯克是必需的。我们发现Riv9 HIPSCs显示对神经分化谱系的发生率更高,进一步支持了这种观点,即人类多能干细胞神经默认假设一个默认的路径在没有外在因素在体外分化(26]。另一种可能的解释较低的神经cjes001塞斯克线包括他们的承诺容易增强潜在分化为生殖细胞之前报道(7]。因此,早期中和可能会增加神经前体细胞的收益率cjes001塞斯克。

作为基因ES细胞系来自异构人口,可能有生物变化,异质性,遗传,表观遗传差异不同ESC线。因此我们的研究结果强调建立和筛查的必要性小说非人灵长类动物lineage-specific分化的干细胞系。此外,绒猴万能的可用性(27将加快推进临床再生医学的研究,允许的安全性和有效性评估外源的移植和异种的各种视网膜退化性疾病。

确认

作者感谢吉米,安吉拉·王,冬青Eckelhoefer协助细胞培养。这个工作是通过资金来自加州再生医学研究所(CIRM)加州干细胞核心。

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