导演通过VSV-G间充质干细胞与心肌细胞的融合促进干细胞编程

文摘

间充质干细胞(msc)自发地与体细胞融合在活的有机体内,尽管很少,融合产品能够组织功能(成熟特征)或扩散(不成熟的特征),这取决于微环境。干细胞可以通过编程或体细胞重编程,以这种方式表明干细胞融合的前景的治疗方法修复受损组织,特别是组织不易再生功能的能力,比如心肌。为了增加干细胞融合的频率,这样,增加潜在的心脏组织修复,我们表示fusogen水泡性口炎病毒(VSV-G)在人类msc。我们发现VSV-G表达msc (vMSCs)融合与心肌细胞(CMs)和这些融合产品采取了CM-like表型和形态在体外。在活的有机体内通过胶原蛋白,vMSCs送到受损的老鼠心肌补丁能够心肌和融合细胞在心肌梗塞和peri-infarct地区。本研究调查提供了一个基础的生物影响融合与CMs的干细胞在活的有机体内并说明病毒融合蛋白如何更好的使这种研究。

1。介绍

间充质干细胞(msc)承诺治疗恢复受损心肌的功能(1- - - - - -5]。msc回家受伤组织(6,7),导致心肌的结构或功能恢复(1)通过旁分泌因子的分泌,可以抑制免疫反应(8)和/或促进血管生成(7,9,10),(2)分化转移/化生[11,12),和(3)核重编程通过与居民融合心肌细胞(CMs) (13]。后者已被大部分学者否认因为融合检测的频率较低的数量相对于移植msc。然而,最近的研究由美国(14)和其他(15- - - - - -17]表明,尽管仍然低频细胞融合可能产生戏剧性的影响在心脏干细胞编程或重组。

细胞命运决定,曾经被认为是单向(18),也就是说,祖细胞分化有进步和永久的特定基因失活允许为他们效力。然而,技术的进步表明这不是严格的情况。先驱核重编程利用细胞融合实验证明胞质元素融合的合作伙伴可以影响其他核转录因子融合伙伴,诱导编程或重组19- - - - - -21]。后来的研究发现特定的转录因子,激活体内时,可以完全重组体细胞胚胎样细胞(22- - - - - -26]。虽然成功重组实现定制在体外方法,编程可能需要更多的时间控制。自发的生理信息融合是一个时间与空间管制过程必不可少的编程或分化的细胞类型(27,28]。因此细胞融合,可能也会造就一个转录控制监管转移的必要推动干细胞或祖细胞分化成熟组织修复的动物。

信息融合发生在邻近的等离子体膜细胞融合形成多核细胞。保险丝,细胞膜的脂质影响必须密切接触,在几个埃。为了达到这种程度的近距离,两个表面必须成为至少部分脱水水膜的膜增强极地排斥。接下来,一个或两个影响必须以某种方式不稳定,导致局部重排的影响。如果两种影响都不稳定,一个水桥是形成和细胞的胞质内容组合。

不稳定的膜可以发生在身体压力的结果(例如,电熔)或化学干扰(如聚乙二醇)。电熔利用短的电脉冲机械破坏细胞的脂质双分子层形成毛孔,如果两个中断膜接触,可能发生细胞融合(29日]。不幸的是,这个过程是有毒的,细胞必须在接触另一个电场是管理。激光捕获之前电熔融合伙伴已被用于更有效的位置,但是这个过程是低吞吐量和细胞毒性30.,31日]。更少的有毒,还少有效和可再生的方法使用聚乙二醇(PEG) (32,33]。PEG-induced融合的确切机制尚不清楚,但也认为是由于当地脱水导致不利的分子包装双层或脱水的脂质双分子层附近的“水壳”,导致水分子细胞之间流离失所,从而迫使两个膜,随后融合细胞(34]。这种技术被证明是有用的,但融合只发生在管理挂钩,因此细胞交付挂钩会立即引起融合和非选择性。能更好的调节机制融合到特定的细胞或组织内的特定区域来研究融合是必要的在活的有机体内。

在自然界中,不稳定细胞膜和随后的膜融合利用特定积分膜蛋白的激活,称为fusogens。的主要信息来源fusogen架构,从病毒受体结合,激活。最广泛的特点fusogens流感病毒血凝素(HA)和人类免疫缺陷病毒1型包膜蛋白(hiv - 1 Env)。融合肽都是疏水性,需要蛋白水解乳沟,但哈酸性pH值在内吞作用下被激活,而hiv - 1 Env融合在中性pH值(了35- - - - - -37])。少研究真核细胞融合所需的fusogens如破骨细胞的融合,成肌细胞,滋养层。最大的挑战是建立蛋白质是对fusogens蛋白促进融合通过将细胞附近。许多公认的fusogens被证明是支持蛋白质(即。对于粘连或迁移)。识别真正的fusogens非常困难,集团提出了排名方案澄清这些蛋白质的性质和功能(28]。因为假定的fusogens自发干细胞融合还没有被鉴定,发展替代策略指导干细胞融合可以增强我们对生物的影响的理解这样的融合。

这里我们利用病毒机械水泡性口炎病毒(糖蛋白,VSV-G)Rhabdoviridae家庭,诱导异形的融合人类msc和鼠标CMs在体外在一个在活的有机体内小鼠心肌梗死模型。MSC-CM融合之后,我们跟踪的表型和形态学融合产品一个星期在体外和3周在活的有机体内。VSV-G被选中,因为它不需要蛋白水解乳沟,受体结合和融合的唯一中介,和pH值是依赖38,39]。特别是VSV-G不需要促进蛋白质要么码头主机膜融合之前,或酶fusogen提示激活。此外,pH值依赖VSV-G优越的地方心pH值后急性缺血性损伤(40- - - - - -42)是在酸性范围内需要启动一个构象变化VSV-G [38,39]。通过这种方式,选择性激活的VSV-G转染msc (vMSCs)心肌损伤的网站应该引起当地的融合原位,从而增加供体细胞移植和集成在组织和潜在的促进心脏分化。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

msc来自人类胚胎干细胞(从WA-09 msc,博士的礼物Peiman Hematti)和HL-1心肌细胞(William Claycomb博士的礼物)扩展和培养如前所述43,44]。短暂,msc培养0.1%明胶(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)瓶包含预处理α最小必要的中期(MEM)完成。Alpha-MEM-complete由αmem(美国表达载体,卡尔斯巴德CA), 10%胎牛血清(Hyclone,洛根UT), 0.1毫米不必要的氨基酸(表达载体),和2毫米l谷氨酰胺(表达载体)。MSC confluency文化被允许长到60 - 70%的浓度,山肩1500细胞/厘米²。CMs是培养纤连蛋白/明胶纤连蛋白(1.25毫克/ 100毫升0.02%明胶)(Sigma-Aldrich)预处理包含Claycomb-complete烧瓶。Claycomb-complete介质是由Claycomb介质(SAFC生物科学,圣路易斯,密苏里州,美国),10%胎牛血清胜任CMs (SAFC生物科学),100 U /毫升:100μg / mL penicillin-streptomycin (Lonza Walkersville,医学博士,美国),0.1毫米去甲肾上腺素(Sigma-Aldrich),和2毫米l谷氨酰胺(表达载体)。CMs是通过100%的融合和分裂1:2。实验使用通道执行7 - 10和msc和CMs 60 - 110,分别。所有文化都维持在37°C公司5%₂。

2.2。转染和分析

msc与pCVSV-G-1转染质粒(45]编码下VSV-G CAG使用霓虹灯转染系统启动子表达载体,根据制造商的协议。简单地说,5×10⁵细胞转染2μ克的质粒与一个1300 V 20毫秒脉冲和镀6-well盘子。确定转染效率,electroporated细胞培养24 h和免疫细胞化学(ICC)进行检测VSV-G蛋白表达。简单,细胞被洗两个冲洗和两个孵化项目1 x PBS。细胞固定了PFA为4%,紧随其后的是另一套洗,和探索1:50稀释FITC-conjugated anti-VSV-G抗体(美国圣安东尼奥TX GeneTex) 3% BSA 60分钟。文化是洗最后一次和安装在DABCO / DAPI安装介质(1 2.5%,4-diazabicyclo[2.2.2]辛烷(Sigma-Aldrich)、50%甘油(费舍尔科学,森林草坪,新泽西,美国),和0.005% 4′,6-diamidino-2-phenylindole (PBS Sigma-Aldrich))。转染效率计算阳性细胞数量VSV-G(绿色)除以总数量的细胞。确定细胞分离试剂改变VSV-G表情,重复VSV-G转染MSC (vMSC)文化收获了0.25%胰蛋白酶(Mediatech公司马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)或1 x Accutase(创新细胞技术公司圣地亚哥,美国)包含0.5毫米EDTA、灭活与培养基,用1 x PBS,探测与anti-VSV-G抗体(如上所述),和洗1 x PBS的最后一次。通过FACSCalibur vMSCs分析(美国加利福尼亚州圣何塞BD生物科学)流式细胞术痈的威斯康星大学癌症中心设施(UWCCC)。

2.3。流式细胞术分析

VSV-G每细胞表达水平是决定使用量子MESF工具包(相当于可溶性分子荧光染料,刘海实验室,Inc .渔民,)和FACSCalibur血细胞计数器(BD生物科学)。量子MESF工具包包含5微球的数量和增加surface-labeled荧光染料,已标准化特定浓度的纯荧光团/微球。每个人口进行了分析通过流式细胞术和标准曲线被绘制人口(即生成。,每个微球的荧光团浓度)和强度。QuickCal软件被用来验证标准曲线的线性度。接下来,vMSCs和相应的控制人口贴上一个anti-VSV-G-FITC抗体通过流式细胞术和分析。使用标准曲线和实测强度值vMSC数量和相应的控件,每个细胞的荧光团数量决定。这个值除以平均数量的荧光团(4.2)绑定到单个抗原决定每个细胞表达蛋白质的数量。分析了一万个细胞和三个复制/人口。人口包括vMSCs anti-VSV-G抗体,msc anti-VSV-G抗体和vMSCs没有抗体。

2.4。细胞融合感应

来确定vMSCs保险丝与心肌细胞更容易比未经处理的MSC、vMSCs和MSC控制与CMs cocultured和分析融合的发病率。在cocultures区分细胞类型,msc和CMs是沾染了1μm CellTracker绿色CMFDA和20μ米红CMTPX(分子探针尤金,或者美国),分别根据制造商的协议。标签后,5×10⁵CMs是镀和培养4 h添加1.5×10紧随其后⁵msc在6-well或vMSCs每盘(BD生物科学)。coculture 14 h后,悬浮液与1 x PBS然后洗沐浴在融合媒体(2分钟46不同的pH值(即。,pH 5.5, 6.5, or 7.5 that correspond to active and inactive forms of the VSV-G fusion protein) adjusted with HCl. For long-term characterization of fusion products, medium was changed 1 day and 4 days after coculture.

2.5。量化融合产品的

Cocultures msc的CMs或vMSCs培养基中维护4 h与融合中孵化后,其次是成像和流式细胞术。获得图像20 x UPlanFluor客观(NA = 0.5), FITC和德州红色过滤器,在IX71倒反褶积荧光显微镜(奥林巴斯中心山谷,PA,美国)和分析与Slidebook软件(美国智能成像创新Denver, CO)和ImageJ(斐济;开源软件,http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji)。图像归一化使用无污点的控制。分析了细胞在UWCCC流式细胞术设施在FACSCalibur流式细胞分析仪(BD生物科学)。事件是生活/死亡大门向前散射和散点图。融合产品被选通量化该地区阳性FL1和FL2频道,分别对应CellTracker绿色CMFDA和红色CMTPX。

2.6。光学分析细胞表型和融合产品

msc在单层或CMs染色蛋白质特征的msc (CD73, CD90、CD105),以及蛋白质的特征CMs (sarcomeric肌凝蛋白(MF20))。细胞培养与4%多聚甲醛固定10分钟,其次是两个洗磷酸缓冲盐(费舍尔科学)。细胞;探讨了山羊anti-CD73 (V-20,圣克鲁斯生物技术,圣克鲁斯,CA,美国),兔子anti-CD90 (RB3970 Abgent,圣地亚哥,美国),山羊anti-CD105 (GKY02、研发系统,明尼阿波利斯,美国),和鼠标anti-MF20 (IgG2b,杂种细胞发育研究银行,爱荷华州的城市,IA)稀释1:25日,1:50岁,1:50岁,没有稀释,分别在稀释缓冲(5% BSA(费舍尔科学),0.02% NaN3——(记述有机物)的磷酸缓冲盐(费舍尔科学)和孵化30分钟在室温下或在4°C在一夜之间,其次是孵化与荧光二次抗体:驴抗体Alexa萤石(AF488表达载体),山羊anti-rabbit Alexa萤石(AF647,英杰公司),和驴anti-mouse (AF546英杰公司)1:200稀释preadsorption溶液(90%的稀释缓冲,5%的人类血清(美国WI Pelfreez,布朗鹿),和5%小鼠血清(美国Equitech-Bio公司、Kerrville TX))在室温下了45分钟。样本复染色DABCO / DAPI安装解决方案。荧光发射检测IX71倒反褶积的荧光显微镜(奥林巴斯)。获得的图像20 x UPlanFluor客观(NA = 0.5),并分析了使用Slidebook软件(美国智能成像创新Denver, CO)和ImageJ(斐济;开源软件,http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji)。图像阈值只二次抗体控制。验证的方法补充图所示可以在网上http://dx.doi.org/10.1155/2012/414038。

MSC-CM或vMSC-CM cocultures与抗体探测厘米标记(MF20)和MSC标记(CD105)评估融合产品的形态和coculture内细胞的表型。积极事件为融合计算的百分比CD105和MF20阳性细胞含有细胞核除以总数量的核从分析每个样本至少8光学领域。选择字段字段(3 - 10)是基于细胞数量(最少3细胞)和位置在井(井中心)。

2.7。诱导小鼠的心肌梗死

心肌梗死是C57BL / 6小鼠诱导(杰克逊实验室,巴尔港,我,美国),左冠状动脉结扎如前所述[47,48),通常表现在威斯康辛大学心血管生理学核心设施。所有动物程序进行按照美国实验室动物科学协会的指导方针和威斯康辛大学麦迪逊分校的动物保健和使用委员会。

2.8。msc的交付或通过TissueMend矩阵vMSCs小鼠心肌

TissueMend (TEI生物科学)制备和细胞被播种如前所述48]。短暂,TissueMend矩阵(2毫米×2毫米×0.8毫米)被放置在井24-well板包含α-MEM-complete培养基。电穿孔后,vMSCs被播种在TissueMend部分浓度3倍msc(细胞控制由于30%细胞电穿孔后生存能力,产生1×10⁶细胞/毫升。改变了媒介在24和48 h,此时TissueMend矩阵包含~ 2.3×10⁴msc、vMSCs或种子(矩阵控制)附加到心肌在矩阵的每一个角落。矩阵是放置,这样接触梗塞和心肌的peri-infarct地区(48]。

2.9。光学分析的心/组织外植体

矩阵植入小鼠心脏收获三周后评估发生,如果发现,的频率在活的有机体内融合。心被一分为二的纵向通过矩阵。组织立即放入10%缓冲福尔马林(pH = 7.2;费舍尔科学)24 h后24 h缓冲福尔马林新鲜的10%,和70%乙醇的最后24小时。样本进一步加工石蜡包埋和切片(如前所述)(49]。荧光原位杂交(FISH)组织消化设备与人类所有的着丝粒探针(红色)和所有鼠标着丝粒探针(绿色)(Kreatech,阿姆斯特丹,荷兰)上执行部分检测融合事件。样本处理的细胞遗传学实验室(WI WiCell研究所,麦迪逊,美国)根据制造商的协议。嵌入部分简要、幻灯片和石蜡为4 h烤56°C。标本孵化与胃蛋白酶序列杂交前70分钟组织消化人类探测鼠标探针紧随其后。获得图像60 x UPlanSApo石油(NA = 1.35), DAPI,绿色和橙色的过滤器,在奥林巴斯BX41直立荧光显微镜(奥林巴斯山谷,PA,美国),和分析与FISHView 5.5版本软件(应用光谱成像,Vista CA)。融合事件被定义为细胞核阳性染色为人类着丝粒(红色)和鼠标着丝粒(绿色)。融合事件被报道的频率随着每总核融合事件数量的心脏组织的对于一个给定的区域:心肌(肌),心肌梗死(MI),边境地区(边境),在Tissuemend补丁(TM),心肌健康(健康)。五到十二个字段被选为每个心中的位置和数量分析,仅供TM,为TM + vMSC。

2.10。统计分析

VSV-G表达的比较、融合频率和融合产品形态与控制,正态分布假定,单向方差分析和学生的t以及使用。数据分析与Microsoft Excel(美国微软,微软,佤邦)。

3所示。结果

3.1。表达VSV-G msc

msc诱导表达VSV-G通过电穿孔转染。转染效率低,将限制VSV-G促进融合的能力,所以VSV-G表情msc电穿孔后确定。转染后24小时控制msc和msc转染VSV-G (vMSCs)探测anti-VSV-G抗体结合到异硫氰酸荧光素(FITC)和可视化与荧光显微镜来确定细胞表达VSV-G的百分比。平均转染效率(=至少6光学领域每样试验3试验,图1(一))。因为vMSCs将收获在活的有机体内研究中,我们也评估VSV-G表达式通过流式细胞术切除后用胰蛋白酶文化板块。我们发现VSV-G跌到的表情(复制/样本/试验3试验,图1 (b))。这或许并不令人意外,其他人已经报道的稳定性下降VSV-G胰蛋白酶处理(50,51]。胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶,劈开羧基组在细胞表面去除细胞从一种文化表面。VSV-G是一种细胞表面蛋白会暴露在分离试剂(52]。胰蛋白酶的中断VSV-G被评估证实VSV-G蛋白/细胞的数量。管理的胰蛋白酶的数量显著降低VSV-G蛋白质在细胞表面的vMSCs(图1 (d))。因此我们与Accutase取代胰蛋白酶,蛋白酶和胶原酶可以提高细胞生存能力比胰蛋白酶(53]。Accutase治疗,细胞的平均数量表达VSV-G后细胞收获,显著提高治疗与胰蛋白酶和足够高的水平,足以辨别表达VSV-G能否影响MSC-CM融合(复制/样本/试验3试验)。

Fusogens VSV-G等最有效的在细胞表面有足量的蛋白质以促进融合,但足够低的数量,以避免免疫反应。因此VSV-G每细胞蛋白表达决心使用量子MESF工具包(刘海实验室,Inc .), FACSCalibur。使用这种方法,每个细胞VSV-G蛋白质的平均数量胰蛋白酶和Accutase (复制/样本/试验3试验,图1 (c))。因此,所有进一步的实验进行了使用Accutase作为分离剂以防止VSV-G乳沟。

3.2。VSV-G介导干细胞融合

确定是否能更好地表达VSV-G msc与CMs比unmanipulated保险丝,vMSCs或msc cocultured CMs。cocultures区分细胞类型,msc和vMSCs沾红CellTracker在CMs沾绿CellTracker荧光探针被总和。因为VSV-G发生构象改变其活性形式从其活动形式在pH值< 6.254,55),cocultures简要孵化(2分钟)融合的媒介pH = 5.5。图像分析的vMSC-CM cocultures对待融合的媒介pH = 5.5显示细胞colocalization绿色和红色荧光,表明融合事件,虽然MSC-CM cocultures pH值相同的条件下表现出有限的colocalization(图2(一个))。准确地评估细胞融合,cocultures播种收获后的24小时内,通过流式细胞仪分析(双阳性细胞对应融合事件)。vMSCs处理酸性介质(pH值5.5)有显著较高的融合与CMs ()比msc治疗以同样的方式(即。自发的融合,)()(图2 (b))。进一步融合产品的比例中确定vMSC-CM cocultures接触融合介质pH = 6.5或7.5(在不活跃的形式维护VSV-G)没有不同于MSC-CM文化(复制/样本/试验3试验,图2 (c))。

3.3。MSC-CM融合产品的微环境对表型的影响

许多研究表明,干细胞编程是影响微环境(56- - - - - -58]。确定的表型命运vMSC-CM融合产品可能是受微环境,处理与融合媒体之后,我们培养vMSC-CM融合产品MSC-specific或CM-specific文化条件,研究了融合的发病率和MSC-CM融合产品的形态。在5至7天内诱导细胞融合后,探讨了cocultures厘米和MSC特定抗体(anti-MF20 anti-CD105,分别复制/样本/试验3试验)。在第五天,vMSC-CM cocultures包含数量相对较高的细胞表达MF20和CD105 MF20的百分比⁺/ CD105⁺细胞相对于总细胞数明显比MSC-CM cocultures培养条件()(图3(一个))。值得注意的是,MF20的百分比⁺/ CD105⁺细胞的比例远高于双阳性细胞检测到使用CellTracker染料和流式细胞术(图2 (b))。这可能反映了VSV-G持续的损失由细胞收获,不同的分析方法(即。,flow cytometry versus image analysis) and/or the behavior of fusion products between day 1 and day 5 (i.e., proliferation). By day 7, the percentage of MF20⁺/ CD105⁺细胞减少水平统计不同培养条件的控制。同时,细胞的数量表达MF20单独培养条件的大幅增加。MF20百分比的变化⁺/ CD105⁺细胞从第五天到第七天可以反映出死亡的融合产品,或编程的MSC融合伴侣心肌细胞表型或两者兼而有之。如果死亡发生的融合产品,人们会期望未溶化的CMs和msc增殖来填补空洞的文化空间。有趣的是,只有CM人口从第五天增加到7天利率显著高于控制文化,建议至少部分融合产品维护,并最终采取了cardiomyocyte-like表型。这个结果是观察到的独立的文化条件。值得注意的是,这种实验方法不排除化生而不是融合发生的可能性,也就是说,msc分化成CMs coculture介质由于溶性因素和维护(至少是暂时性的)每个细胞类型的表达式。然而,MF20⁺/ CD105⁺细胞在MSC-CM cocultures,暗示化生无法占coexpression MF20⁺/ CD105⁺MF20或后续损失⁺/ CD105⁺细胞。此外,MF20⁺/ CD105⁺细胞表现出两种不同的形态;有些长,传播,显示MSC-like形态(MSC中等=;CM中=),而多数()cobblestone-like,表明CM-like形态(MSC中等=;CM中=)(数据3 (b)和3 (c),补充图)。这些结果进一步支持的可能性厘米核材料和胞质元素直接编程MSC-CM融合产品的独立的文化条件。

3.4。vMSCs保险丝在活的有机体内

确定msc VSV-G表达可能与心脏细胞融合在活的有机体内,vMSCs交付通过TissueMend修补受损的心肌。我们以前证明msc这样维护交付补丁和补丁之间的组织和心肌后3周交货在百分比高于传统的交付模式(48]。此外,Laflamme等人发现在移植细胞损失的一个主要因素是女性59),从而提供锚地支持移植细胞增加生存能力和保留。在这项研究中,我们试图确定VSV-G表达msc(供体)能够迁移到受损的心肌和融合受体心脏细胞类型。因此,一天后诱导通过结扎左冠状动脉前降的梗塞,包含vMSCs补丁应用到心脏与健康和受损组织。三周后细胞移植、心脏切除和组织学进行左心室组织如前所报道(48]。组织学部分探索使用鱼对人类和mouse-specific着丝粒和所有原子核包含探测器被认为是融合产品。人类细胞被发现在TissueMend补丁和“边境地区”(补丁和心肌之间的区域)。Donor-host细胞融合是明显TissueMend补丁,边境地带,心肌梗塞的心接受TissueMend vMSCs。没有发现人类细胞或融合产品健康的心脏组织的心接受TissueMend vMSCs。此外,没有发现人类细胞或融合产品TissueMend补丁,边境地带或心肌梗塞的心只接收TissueMend。红心地区接收TissueMend vMSCs和选择高密度的融合事件,细胞融合的频率相对于原子核在给定地区的总数TissueMend补丁(心,12字段);、边境区域(心,5字段);心肌梗塞(心,8个字段)。虽然这些水平代表了每个地区的最大数量的融合,他们大大高于此前报道自发融合MSC移植后,在每个领域一个融合事件或图像包含成百上千的核是罕见的13,60,61年)(图4)。这些结果说明表达病毒fusogen VSV-G可以用来诱导msc、融合和其他潜在的临床相关的细胞类型,使生物的研究和治疗在心脏细胞融合的影响。

4所示。讨论

融合与接受者心肌细胞移植干细胞一直在观察小鼠(13,60)和猪模型系统(49]。但是因为这些第一次观察,很少有人试图解开机制控制干细胞融合或研究干细胞编程的细胞融合的影响。缺乏研究反映了压倒性的意见,很少发生细胞融合也为干细胞相关的编程,通过推论,组织修复。然而,这个观点没有升值的可能性(1)检测方法可能不足以准确测定干细胞移植后细胞融合的贡献和/或(2),我们可以控制或增加细胞融合的频率更有效地诱导干细胞移植后的编程。我们已经开始探索这第二个可能性很好融合的机械的病毒。我们发现,间充质干细胞表达病毒修改fusogen VSV-G更倾向于与心肌细胞融合pH-dependent的方式。vMSC-CM融合产品形成了以这种方式很容易采用心肌细胞表型和形态。此外,vMSCs送到后小鼠的心肌梗死心脏细胞融合,居民自发融合的速度远高于先前的报道(13,61年),更容易融合现场比健康的心肌梗死。

增加的频率MSC-CM细胞融合将帮助细胞融合的研究在体外并且可以改善msc治疗的好处体内。治疗的好处可能改进的方法之一是通过感应的编程msc的心肌细胞的命运。msc分化为CMs可以启动在体外通过可溶性因子包括5-azacytidine [62年- - - - - -64年)或暴露于不溶性因素包括层粘连蛋白(65年]。然而,msc的功能分化心肌细胞只有完成日期与成熟的心肌细胞通过细胞融合。这个结果已经证明在体外(66年),在活的有机体内在MSC-CM融合产品心肌细胞形态,表达心肌细胞标记,和一对相邻的心肌细胞(60]。我们发现当MSC-CM融合与病毒fusogens诱导,CM融合伙伴占主导地位,大部分融合产品(不管介质类型)采用CM-like形态学和维护MF20,失去CD105的表达。这些数据进一步支持的令人兴奋的可能性,归纳与病毒融合fusogens可以增强MSC编程CM的命运在活的有机体内。值得注意的是,这里的CMs利用HL-1 CMs。该细胞株用于支持大规模和长期研究。然而,这些细胞的异质性和不朽的性质可能看似占主导地位的CM表型和未来的研究将主要利用胎儿心肌细胞或诱导多功能干细胞心肌细胞。

我们的研究结果表明,骨髓间充质CM的分化命运可以通过信息融合提升。然而,在某些情况下在体外MSC-CM融合产品可以进入细胞周期和增殖的建议和信息融合可以促进重组厘米(67年- - - - - -69年]。融合产品的扩散可能对心脏有利的组织修复功能的分化细胞类型自产生更多的细胞,以取代失去的细胞。此外,最近的证据表明,MSC-CM融合包括线粒体交换,这是必不可少的体细胞重编程(69年]。理解和信息融合与线粒体保护可能提供备用,简单,直接救援ischemia-induced后细胞损伤的机制。有证据表明融合产品的增殖能力是由干细胞而发展方向是由体细胞(70年- - - - - -72年,所给出的两个结果的组合意味着,心肌功能的改进。

虽然我们利用vMSCs理解和利用MSC-CM融合的生理作用,另一个干细胞的诱导融合,祖,甚至成熟的细胞类型可以增强我们的能力,以重新填充和修复受损心肌(59,73年- - - - - -79年]。在成熟或祖细胞移植的情况下,诱导融合可能不太有益从差异化角度来看,从一个移植或保留的角度来看更有利。干细胞交付的主要挑战之一是移植后~ 90%细胞损失(80年- - - - - -82年],促使新方法的发展提供和维护心脏细胞(48,83年,84年]。尤其成问题的心脏治疗心脏机械活动,迅速冲洗细胞的目标区域。如果干细胞转化为表达病毒fusogen,他们可能会快速坚持和保持长期的心脏。fusogens pH敏感的优势,如VSV-G,是控制活动的能力,这样细胞只在pH值低于6.5保险丝。这主要影响诱导暂时缺血期间(窗口)和空间(缺血性地区)监管融合在活的有机体内。事实上,vMSCs送到心脏被发现在补丁和受损心肌与老鼠细胞融合。VSV-G诱导融合能力的补丁可能是由于靠近缺血性地区造成的环境更酸性或改造的胶原蛋白片48]。通过MSC分泌胶原重塑已被证明发生的基质金属蛋白酶(matrixins)丝氨酸蛋白酶,半胱氨酸蛋白酶(85年]。而matrixins活跃在中性pH值、丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶是活跃在酸性pH值,间接证明细胞能够使微环境酸化(86年]。综上所述,诱导细胞融合的心可以通过多种机制发挥功能的好处。

这种方法的主要限制是引入病毒机器已经损坏的接受者。整个病毒粒子,VSV病毒,是免疫原性,在足够高的浓度,是致命的老鼠(87年]。纯化VSV-G VSV-G重组或脂质影响管理在体外促有丝分裂的细胞培养(> 0.8μg / mL) (88年]。有趣的是,如果脂质浓度增加,VSV-G浓度保持不变时,mitogenicity下降,这表明VSV-G间距的膜起着很大的作用。确认VSV-G安排的重要性,Ochsenbein等人证明了1000倍C57BL / 6小鼠产生的抗体是对高度有组织的VSV-G水疱性口炎病毒核衣壳的完整与组织不善VSV-G在胶束89年]。病毒蛋白的数量我们交付(基于蛋白质的质量(39),每个细胞表达的蛋白结合细胞的数量交付)7个数量级低于报道数量引起免疫反应(88年),我们只能表达fusogen而不是整个病毒粒子。即使方法被开发来增加每细胞表达水平和/或结合大量的细胞,间距可以避免免疫反应评价。然而,根据所需的集中报道引起响应,交付vMSCs准备在本研究不会产生反应。

虽然vMSCs可能没有免疫原性,转染本身可能会导致不良基因的影响。例如,稳定转染与大多数病毒系统导致集成的基因在基因组中随机网站(90年- - - - - -92年]。当发生突变时,集成可能发生在一个网站,干扰细胞自我调节,导致管制的增殖和肿瘤发生93年,94年]。除了实验证据的恶性肿瘤,这已经临床([95年,96年],在[复审97年])。这里,转染在很大程度上是短暂的,只有很少整合进入基因组。临床使用需要进一步保障,可能包括脂质体蛋白质的交付。

5。结论

VSV-G-mediated融合的数据提出了支持工具研究干细胞的影响融合细胞重编程和功能改善组织包括心脏。未来的研究也可以雇佣VSV-G拯救其他缺血性组织在体内受损细胞,甚至有选择性地破坏靶细胞。例如,肿瘤的微环境和佩吉特氏病的过分活跃的破骨细胞pH值低于阈值需要激活VSV-G的构象变化。当地政府在脂质体VSV-G含有毒因素或高度酸性pH值这个微环境可能与这些监管不力细胞融合并抑制其不利影响。

资金

本文从美国国立卫生研究院的资金支持(HL089679)。

确认

作者想感谢杰恩·m·Squirrell批评在纸上;埃里克·m·麦金太尔赛斯m . Taapken和卡伦·d·蒙哥马利WiCell研究所的细胞遗传学部门,蒂莫西·a .黑客,国庆歌曲,心血管生理学和吉尔科赫威斯康辛大学的核心设施,和贾斯汀·t·Koepsel威斯康星大学麦迪逊分校的技术援助。

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