文摘
多能干细胞被认为是一种很有前途的细胞来源获得人类足够的数量和纯度的多巴胺神经元细胞替代疗法。重要的是,临床应用的成功取决于我们的能力引导多能干细胞的神经元的身份。帕金森病的多巴胺神经元的损失更明显的腹外侧人口感觉运动项目的纹状体。由于突触是非常具体的,只有神经元这种精确的身份将贡献,在移植时,背侧纹状体突触重建的。因此,理解mesostriatal多巴胺神经元的细胞发育程序的识别是至关重要的外在指示信号和细胞内在因素,最终,决定细胞的身份。在这里,我们审查外部信号和转录因子共同行动在开发过程中如何塑造中脑细胞命运。进一步,我们将讨论如何可以应用这些因素在体外诱导、选择和重新编程细胞mesostriatal多巴胺的命运。
1。腹侧中脑多巴胺神经元的中心作用在帕金森病
帕金森病的特点是进步的多巴胺(DA)神经元变性的黑质致密部(SNc)的腹侧中脑(vm)。神经元损失也发生在其他脑干核,如蓝斑和迷走神经的背运动核(1]。成人大脑,这些核显示一个黑色色素由于积累neuromelanin迷失在帕金森病。此外,路易小体,包含过度磷酸化蛋白质的总量α-突触核蛋白(2)、泛素和p62等蛋白质,通常是发现在这些患者的脑干。这些总量也出现在其他大脑区域和外部的大脑,例如,在肠神经丛(3]。尽管路易小体被认为是帕金森病的病理特点,没有直接相关性路易小体的存在和神经功能障碍(4]。事实上,帕金森病的遗传形式显示不同的大脑病理学和通常缺乏路易小体(5- - - - - -7路易体)的同时,另一方面,可以在无症状的个体。疾病的共同继承和零星的形式在SNc DA神经元的损失。神经元损失更明显的腹外侧的族群vmDA感觉运动区域的纹状体神经元项目(8mesostriatal集团),并伴随着大脑相应区域减少DA在这些地区。
为了生成在体外替代疗法的足够的细胞类型,特征是很重要的身份和性质vmDA神经元。所有DA神经元表达酪氨酸羟化酶(TH)、酶催化初始,病原反应一步儿茶酚胺的生物合成(包括DA、去甲肾上腺素和肾上腺素)。最脆弱的神经细胞,位于腹外侧SNc,往往是大型和严重melanized和表达高水平的DA受体D2 (DRD2)和DA转运蛋白(DAT SLC6A3)。此外,这些神经元相对低水平的TH和水泡单胺transporter-2 (VMAT2 SLC18) [9],和大多数不表达calbindin-D28k [10]。这些特性中的一些已经与一个增强易受氧化应激和老化11]。例如,高DA营业额结合细胞内存储容量低于越脆弱DA神经元位于SNc的背线,retrorubral字段和腹侧被盖区(VTA)有助于更早和更严重的损失mesostriatal神经元。比更有弹性更大依赖钙通道VTA神经元也被卷入的微分脆弱性vmDA亚种群(12]。
通常被称为的mesostriatal vmDA群A9命名后的集团,醛荧光细胞群(即。,containing monoamines) identified using the Falck-Hillarp technique, in the rodent brain [13]。然而,界定相当于人类DA程序经常不准确,因为有些亚种群的腹侧被盖区(A10),主要是parabrachial色素核(PBP),是流离失所的背侧和外侧(14]。标记用于定义特定的准确性vmDA亚种群尤其相关的神经元衍生和发展在体外的标识完全依赖这些标记的表达和电生理特性。
表达蛋白的内向整流钾通道亚基2 (Girk2 Kir3.2)富含vmDA神经元,在由homotetramers Girk通道(即。、四2型子单元)和脆弱mesostriatal一直被视为一个特殊的标记神经元(9,15- - - - - -17]。然而,一个详细的研究最近报道类似的表达水平的Girk2人类SNc的腹侧和背侧层(14),77%的SNc和55%的VTA神经元PBP(62%)显示强烈的Girk2免疫反应性。TH神经元的比例显示colocalization Girk2相似的小鼠大脑(18),多数SNc和VTA神经元显示Girk2表达式(14]。在超微结构水平上,这个钾通道的存在先前描述的所有vmDA细胞除了在维管束间的核的腹侧被盖区(19]。因此,最可靠的标准单独mesostriatal (A9)和mesocorticolimbic (A10)神经元在体外不是Girk2的存在但缺乏calbindin-D28k mesostriatal神经元(10,14,20.,21]。,但应该注意的是,大约12%在鼠标(20%)DA神经元的SNc的内侧部分也coexpress calbindin-D28k [14]。
胎儿vm的移植细胞恢复功能在帕金森病人22- - - - - -24]。因为症状出现在病程后期,当绝大多数vmDA神经元已经丢失,细胞替代方法构成一个有吸引力的替代药物替代。然而,临床试验显示,而适度的临床成功和,在某些情况下,令人担忧的负面影响(23,25]。有限的效益和存在graft-induced动作障碍已被归因于一种次优的胎儿细胞成分移植,虽然其他生物和技术因素也很重要。细胞从胎儿获得vm异构;只DA神经元(~ 5%26,27]。5 -羟色胺神经元从桥的中缝通常包含在解剖区域(28]。因此,大量的5 -羟色胺神经元以及GABA神经元和胶质细胞存在于胎儿vmDA移植(29日]。目前,尚不清楚是否存在不同的神经元和神经胶质细胞群在胎儿移植是有害的,功能集成,或有益的,例如,通过提供营养支持vmDA神经元(见部分3所示。3)。5 -羟色胺神经元在胎儿移植的存在与发展的graft-induced动作障碍在患者(30.)和在实验模型(28,31日,32]。5 -羟色胺神经元有能力脱羧基左旋多巴和存储哒但不能调节哒释放和再吸收,因为他们缺乏多巴胺- d2受体和DAT。这种不平衡提出了构成graft-induced运动障碍的出现,基于宠物研究和药理改进与丁螺环酮(5 ht1a部分激动剂)30.]。然而,证据支持这种机制在移植患者受到质疑,作为运动困难应该然后用左旋多巴恶化,这并非如此(33]。此外,5 -羟色胺hyperinnervation没有直接相关性和运动困难的严重程度33]。最后,丁螺环酮也可以作为部分的多巴胺- d2受体拮抗剂的模型graft-induced运动障碍(34)和改善L-DOPA-induced运动障碍非常有效地在nongrafted动物模型35,36]。mesoprefrontal和mesocorticolimbic达亚种群的比例移植尚未详细检查但calbindin-D28k阳性神经元的存在并没有使不利影响(即使mesoprefrontal DA神经元不表达DRD2或DAT)。然而,这些神经元的突触重建不会导致背侧纹状体(37]。突触是高度专业化的接触特定合作伙伴,需要双向识别和沟通(38]。因此,只有那些细胞,显示一个特定vmDA mesostriatal表型能够恢复生理与中型纹状体带刺的神经元和突触连接重建监管DA传输导致功能恢复。胎儿组织的有限的可用性和伦理问题关于它的使用导致了一个积极寻找替代细胞来源(39),并希望将多能干细胞获得人类vmDA神经元在足够的数量和纯度。为多能干细胞和重组细胞,获取和保持正确的身份将成为未来临床应用成功的关键因素。
2。多巴胺神经元:血统规范和细胞的身份
血统的规范,发展形态因子激活转录监管网络。转录因子的控制,反过来,受体的表达和细胞内瀑布下游转导外在线索所必需的。协调时间和空间整合外部信号和细胞的内在决定因素因此需要适当的规范标识(图1)。
2.1。外在的信号
VmDA神经元产生腹侧中线底板(FP)神经上皮的细胞nonneurogenic字符(40,41]。FP是一家专业胶质结构位于最腹侧中线神经管的中脑尾部区域(42]。它控制神经元亚型规范沿着背腹轴(dv)通过成形素的分泌声波刺猬(嘘)[43]。FP的功能作为一个腹侧神经发展的组织者从鱼到哺乳动物是守恒的44,45]。FP细胞生成神经元的能力是大脑的空间限制沿着rostrocaudal轴。FP中脑获得神经元细胞mDA神经元的属性特征,而FP细胞位于中脑尾,通常不会引起神经元(41]。
形式之间的边界的地峡的组织者,中脑和后脑,中脑和后脑前的控制模式。至关重要的规范和DA神经元的正常发展和5 -羟色胺神经元在腹侧中脑和后脑,分别为(46]。几个信号的因素,包括嘘,纤维母细胞生长因子(Fgf) 8日Fgf17, Fgf18,和Wnt1表达和地峡的组织者和参与这个过程(图2)。嘘和Fgf8 DA神经元的诱导是必要的吻侧前脑和侧中脑(47,48]。然而,嘘E10.5后不再需要鼠标。在这个发展阶段,Foxa2 forkhead转录因子,嘘,引起对vmDA神经元的生成至关重要(49- - - - - -51]。
在早期发展(从E9), Fgf8地峡的组织者所表达的是(52,53),可以模仿地峡的活动(54,55]。fgf参与模式的中脑和小脑的感应rhombomere 1。小脑发展引起强烈Fgf信号介导Fgf8b通过绑定的酪氨酸激酶受体Fgfr1耦合和激活Ras-extracellular signal-regulated激酶(ERK)的途径。另一方面,中脑的感应是由较低的信号强度,并由Fgf8a Fgf17和Fgf18 [56- - - - - -58]。失活Fgf8导致损失的中脑和小脑组织(59,60]。这些解剖结构的缺失似乎主要是由于异位细胞死亡,想必失调造成的转录网络包括Wnt1, Fgf18, Fgf8、Fgf17和Gbx2 (61年]。此外,Fgf8似乎维持正常发展的中脑和后脑调节转录因子如engrailed-1 (En1) engrailed-2 (En2)和Pax562年]。除了vmDA神经元的功能规范,Fgf8指导的喙的增长从vmDA神经元轴突通过诱导排斥因素semaphorin 3 f [63年]。
Wnt信号是中脑早期发育所必需的。在E8.0 Wnt1表达先于Fgf8,开始。在体节早期阶段,假定Wnt1广泛表达在中脑(1-somite),但在神经管闭合,表达逐渐精炼的窄带细胞位于地峡立即吻侧,以及中枢神经系统的背中线(16体节)(64年)(图2)。和Fgf8 Wnt1没有isthmic-like活动。然而,Wnt1至关重要的缺失导致损失的中脑和小脑结构E10汽油和大量减少vmDA神经元的数量(65年- - - - - -68年]。此外,Fgf8和嘘未能诱导TH Wnt1敲除老鼠和Pitx3表达,表明Wnt1 vmDA神经元的发展是必要的(69年]。异位表达的Wnt1喙的后脑可以通过激活诱导神经元vmDA Otx2表达式和随后的镇压Gbx2 Nkx2.2感应mDA的标记,包括TH和Nurr1 [69年]。如果异位Wnt信号结合恢复Lmx1b水平,vmDA生成神经元似乎也在后脑的尾水平,尽管不是在脊髓70年]。有趣的是,Otx2似乎确定前身份,赋予神经性FP细胞的潜力。因此,异位表达的Otx2腹后脑诱发从FP vmDA神经元细胞,通常不引起神经元,部分是由诱导Lmx1a [41]。
重要的是,尽管Wnt1表达在很大程度上是受Lmx1a影响功能丧失,Lmx1b Wnt1表达的是一个至关重要的监管机构在发育后期的mDA祖细胞(71年]。
除了规范Wnt信号在早期规范的作用,Wnt1 Wnt3a增加神经发生和规范的扩散Nurr1-positive vmDA前体细胞(72年]。同样,规范Wnt信号中断导致神经发育缺陷和扰乱vmDA神经元的迁移和分离(73年]。Wnt2还参与vmDA神经发生通过激活规范的途径74年]。Wnt5a增加vmDA神经元的数量通过促进完全成熟的收购vmDA表型通过upregulation Pitx3表达式(72年]。Wnt5a也被认为控制形态发生,vmDA祖细胞分裂,细胞周期退出(75年]。
维甲酸(RA)似乎也扮演一个角色在vmDA神经元分化。视网膜脱氢酶1(小鼠),这将视黄醛转化为类风湿性关节炎(76年),表示在vm已经E9.5 [77年]。Pitx3调节中脑RA水平直接转录激活小鼠(78年,79年]。缺乏Pitx3结果在SNc vmDA神经元的选择性损失80年]。产妇补充Pitx3 RA可以部分救援SNc变性的基因敲除小鼠(79年]。
其他形态因子和生长因子对vmDA神经元的存活和成熟很重要。转化生长因子β(TGF的成员β2)总科,骨形成蛋白(bmp), 6、7发展中vm的表达,促进vmDA神经元在大鼠的生存81年- - - - - -83年]。此外,TGFβ2 - 3、苯丙酸诺龙、胶质细胞line-derived神经营养因子(GDNF)对vmDA神经元(神经营养因子84年- - - - - -89年]。GDNF似乎作为target-derived神经营养因子通过其高表达在纹状体神经元支配的nigral vmDA神经元(81年,90年]。此外,GDNF表达短暂地在中脑神经元vmDA规范。在这里,GDNF诱发Pitx3通过NF -κB-mediated信号(91年]。Pitx3是反过来要求激活的脑源性神经营养因子(BDNF)表达在胚胎发生SNc DA神经元的族群。损失的BDNF的表达与凋亡细胞死亡的增加这个vmDA族群在Pitx3基因敲除小鼠(91年]。
2.2。内在决定因素
涉及多个细胞内在因素在扩散,规范,vmDA神经元的成熟和维护。同源框转录因子Otx2控件的定位地峡的组织者,这反过来,定义了vmDA域(46,69年,92年- - - - - -96年]。此外,Otx2参与模式中脑,调节颈板下游基因表达和激活因素vmDA细胞命运的决定因素,例如,Lmx1a和Msx1/2 [46,69年,92年- - - - - -96年]。Otx2被认为是一个主调节器vmDA神经元发展项目通过建立最腹侧域。Otx2表达维护主要是在成人中脑腹侧被盖区。因此,成人显示减少mesocortical Otx2和边缘神经支配,但正常mesostriatal连接(46,69年,92年- - - - - -96年]。Otx2指定vmDA神经元亚型的身份出现在腹侧被盖区通过调节Girk2和DAT的水平。重要的是,当Otx2 ectopically表示在SNc vmDA神经元,这些脆弱的神经细胞免受MPTP-induced毒性,可能通过限制SNc细胞的数量与高效DA吸收,因此也毒害神经的阳离子的吸收MPP + (97年]。
Foxa1/2表达式是由嘘FP的腹侧中脑。规范FP的身份需要Foxa2-dependent镇压的腹外侧中脑命运的决定因素,包括Tle4 Otx1, Sox1, Tal2,减少嘘信号(98年]。Foxa1/2维持在postmitotic vmDA神经元作用基因剂量依赖的方式来调节vmDA神经元的分化和表型成熟通过控制Nurr1的表达,En1, TH, AADC [49,99年- - - - - -101年]。Foxa1/2也需要维护Lmx1a所采用的两个和Lmx1b表达和功能合作与这些转录因子调节vmDA神经元的分化(96年,One hundred.,101年]。此外,最近的一项研究表明,Foxa2积极调节转录的大多数vmDA神经元在vm祖细胞命运的决定因素,包括Lmx1a Lmx1b, Msx1, Ferd3l,而压抑的嘘嘘受体信号通路包括Patched-1,传感器Gli1-3和转录因子Nkx2.2和Nkx2.998年]。有趣的是,保持适当的基因剂量水平的Foxa2出现长期生存的关键vmDA神经元的成年人,因为Foxa2老化+ /−杂合的老鼠开发parkinsonian-like症状,与选择性SNc vmDA神经元的损失(99年]。
十字的1和2 (En1和En2)最初是广泛表达于中脑在后期他们的表情变得局限于postmitotic vmDA神经元(102年- - - - - -104年]。需要En1/2 gene-dose依赖的方式,vmDA生存和成熟的神经元,但不是他们的规范105年,106年]。En1/2 vmDA神经元的基因敲除小鼠凋亡由于细胞自动要求En1/2而不是由于中期的损失/后脑结构(105年,107年]。此外,注射外源性En1/2可以防止vmDA神经元MPTP药物,6-OHDA,-核蛋白毒性,可能是通过增加线粒体复杂我活动108年]。
homeodomain蛋白质Lmx1a所采用的两个神经元和Lmx1b vmDA的规范很重要,似乎都有特定的和冗余功能40,41,71年,109年,110年]。VmDA祖细胞可分为内侧和外侧域分子不同的Wnt1表达,DRD2, Corin表达式。这些子组显示不同的敏感性丧失Lmx1a所采用的两个和Lmx1b Lmx1a影响神经发生的内侧祖细胞和Lmx1b所需的建立横向DA祖域(71年]。Lmx1a可以诱导vmDA神经元ventralized ES细胞表型(40,111年,112年),但它不是绝对的规范要求这些神经元(71年]。重要的是,Lmx1a下腹正中nonneuronal地板板细胞转换成神经vmDA祖细胞(40,41]。这个过程包括一个Lmx1a-triggered退出细胞周期,激活神经元分化的Ngn2信号和建立Notch信号在腹侧中线细胞,从而提供神经元可能FP细胞(40,71年]。在中线要求Lmx1a所采用的两个细胞是有限的早期发展阶段,缺乏vmDA神经发生,(沿中线最为明显),在Lmx1a突变老鼠恢复时间41,71年]。Lmx1b控制发病Pitx3表达相对于TH和需要生存,因为所有vmDA神经元丢失在Lmx1b E16天零突变体(109年]。此外,Lmx1b需要规范的横向vmDA祖细胞不似乎源自底板(71年]。此外,Lmx1b,而不是Lmx1a,似乎是一个至关重要的监管机构Wnt1表达vmDA发育后期的祖细胞。虽然功能Lmx1a所采用的两个似乎致力于vmDA神经元血统,Lmx1b有广泛的功能和影响眼部运动神经元的顺序规范和红核神经元从祖细胞外侧vmDA中脑神经元(71年]。
Neurogenin 2 (Ngn2)是一个关键因素的下游Lmx1a, Msx1/2, Otx2 glial-like FP的转换成一个vm(神经性的地区40,41,71年]。此外,Ngn2是mDA的监管规范和神经发生,但其颈板功能可以部分取代Mash1 (Ascl1) [40,113年]。
转录因子Nurr1 (Nr4A2)表示在许多大脑中神经元的数量,包括所有post-mitotic vmDA神经元。Nurr1需要感应DA所需的TH和其他蛋白质合成、储存和释放,包括VMAT2 DAT,芳香L-amino酸脱羧酶(AADC),以及c-Ret [77年,114年- - - - - -116年]。此外,看来Nurr1可以身体与细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK) p57交互促进vmDA成熟神经元(117年]。在Nurr1基因敲除小鼠,vmDA神经元是天生的,但未能获得和/或维持一个适当的表型(114年,118年,119年]。
同源框转录因子Pitx3显示了限制表达式在SNc和VTA DA神经元在大脑中。有趣的是,失去Pitx3导致选择性SNc DA神经元的变性,而VTA DA神经元保持不变(80年,120年,121年]。SNc DA神经元的原因选择依赖于Pitx3并不完全理解。如前所述,小鼠是一个转录Pitx3[的目标78年,79年)和产妇补充RA可以部分救援Pitx3 SNc变性的基因敲除小鼠(79年]。此外,Pitx3需要激活BDNF表达rostrocaudal人口SNc mDA神经元和损失BDNF的表达与凋亡细胞死亡的增加这些mDA Pitx3神经元基因敲除小鼠(91年]。此外,Pitx3调节神经元SNc mDA的水平(122年]。
总之,全面了解发展途径参与vmDA规范和成熟促进他们在体外一代不同的细胞来源。
3所示。多巴胺神经元的多能干细胞
人类多能干细胞代表的良好来源在体外生成的细胞,因为它们允许无限制的扩张(至少在理论上)和派生的任何一种细胞类型。然而,广泛的潜力也是他们的主要缺点,很难限制它们分化成只有一个特定的细胞表型。细胞治疗、细胞异质性问题,因为减少了安全、效率和有效性(生物制剂的必要批准治疗)。的确,多个细胞表型的存在在不同的发展阶段也会引起一些并发症。不成熟和增殖细胞构成的风险形成畸胎瘤(123年,124年和移植生长125年- - - - - -127年]。污染的细胞表型可以在几个方面影响移植肾功能,例如,通过支持贪污self-innervation和减少graft-host集成(128年)或通过直接与主机交互神经元,影响功能。特别是,虽然争议(见部分1),5 -羟色胺神经元的存在胎儿vm移植的发展提出了占graft-induced运动障碍(30.]。最后,污染细胞的存在必然减少治疗的比例相关的细胞,导致细胞的增加剂量和注射量与更高的手术相关风险和不利影响。因此,挑战在于如何最大化生产的一个(或几个)治疗相关的细胞类型(s)和减少其他细胞群的存在,特别是那些会导致直接的损害或减少移植物的功能效果。与这一目标,分化和选择协议开发和优化的内在和外在的信号使用标记部分中讨论2,指导多能细胞到相应的发展计划(图3)。
3.1。感应细胞培养协议
根据收集的信息从发展研究,归纳文化协议开发,使用连续的接触形态因子,为了繁殖在体外信号的融合因素(描述的部分2.1),发生在vmDA神经发生在胚胎(图2)。嘘的组合和Fgf8成功诱导DA神经元从小鼠多能胚胎干细胞(129年),灵长类动物(130年- - - - - -132年和人类起源133年,134年]。神经诱导、coculture系统利用小鼠基质细胞系的电感特性像[5级135年)或尼龙6 (130年,136年]。stromal-derived归纳活动相关的分泌细胞因子,生长因子,和轴突导向分子像CXCL12 pleiotrophin,胰岛素生长因子2 (IGF2)和ephrinB1137年]。后续修改的基本协议试图提高多能细胞的比例致力于神经命运通过阻断mesendodermal命运,使用BMP抑制剂,如‘诺金’、苯丙酸诺龙、TGFβ抑制剂,SB431542 [124年,133年,138年,139年]。糖原合酶激酶抑制剂(GSK) 3 -β也有利于神经感应和vmDA神经元分化,通过加强规范化Wnt信号活动(140年]。其他策略包括Fgf / Erk信号的瞬态抑制早期神经感应ventralize神经祖细胞和维护Otx2表达而抑制前脑和后脑的命运141年]。
微分表达式的microrna与多能细胞系生成vmDA神经元的倾向使用这些归纳协议(142年]。因此,microrna的表达可以操纵为了提高分化过程,重要的是,它可以用来选择最有效的细胞系分化,例如从病人中诱导多能干细胞是否可以使用几个克隆。
长在体外文化时期的BDNF、GDNF、Wnt5a和其他因素,讨论部分2转录网络,稳定和提高神经元成熟(143年),导致进步浓缩通过积极的选择。然而,相比其他细胞数量少突胶质细胞派生形式人类胚胎干细胞(144年,145年),长文化时期可能不是最优的净化vmDA神经元用于移植由于密集的神经炎的分枝,从而增加他们的弱点在收获。进一步提高vmDA神经元的比例从多能干细胞群体,表达的转录因子来评价和选择策略。
3.2。过表达
一些转录因子,如Nurr1 Lmx1a Pitx3,被用来增强vmDA分化多能和神经干细胞(表1)。
Nurr1作为的角色终端选择器一直在强调表达研究证明其能力移植DA神经递质表型的增加表达TH, DAT, AADC和c-ret神经元来源于胚胎干细胞(146年,147年]。在活的有机体内,Nurr1-overexpressing神经元诱导更快和更完整的行为复苏hemi-parkinsonian老鼠,包括自发的运动行为(147年]。最近,Nurr1被用于直接重编程实验148年- - - - - -151年)(见下文,部分4)。Nurr1高度上下文相关的的影响,未能引起vmDA前脑神经元表型在神经干细胞(152年,153年没有添加其他模式的因素)。同样,Nurr1可以上调DA标记没有诱导神经细胞在小鼠ES细胞表型(154年]。
Lmx1a可以诱导vmDA神经元表型在以前ventralized小鼠胚胎干细胞(40,111年,112年),但它不是绝对的规范要求这些神经元(71年]。事实上,尽管表达小鼠ES细胞分化成vmDA神经元,改善人类ES细胞中的结果不符合预期(111年,155年]。在另一项研究中,使用vm祖细胞从啮齿动物,几Lmx1a-transduced细胞成长为神经元,但一种更健壮的增加被发现在人类神经祖细胞(156年]。最近,慢病毒载体是用来稳定转换他的细胞表达Lmx1a分化(由一个巢蛋白增强器),导致在TH阳性神经元增加了40%,75%的这些coexpressing Girk2 [157年]。
3.3。选择的方法
感应vmDA神经元命运的限制时间与空间在发展中中脑。这些限制是很难完成的在体外在干细胞衍生的文化。而添加一组特定的形态因子(如Fg8,嘘,Wnt)干细胞文化可以限制生成细胞的命运,多个神经元的数量仍将形成,包括5 -羟色胺神经元和运动神经元(112年,129年,134年,135年]。这并不奇怪,因为这些神经元数量生成在一个关闭时间窗口内非常近端域在胚胎发育阶段(71年,112年),而在体外文化系统不能达到所需的水平的定义单独的这些领域(时间和空间)。然而,排除这些邻近种群可能是可取的,甚至有必要,正如上面所讨论的。此外,干细胞细胞分裂并积极(125年,127年,158年- - - - - -160年可能导致肿瘤的产生或畸胎瘤(123年,125年,126年)和主机是不利的。
目标人群,比如vmDA神经元和/或他们的祖细胞,可丰富期间或之后在体外分化使用荧光激活细胞分类(流式细胞仪)或磁激活细胞分选(mac)。感兴趣的细胞可以积极选择通过使用标记抗体染色为特定的细胞表面标记出现在限制人口所需的细胞。积极的选择也需要使用基因内部选择标记(从转基因细胞系,动物菌株,或使用病毒载体)。此外,浓缩策略可以结合-选择程序,删除不需要的细胞的数量,例如,增殖细胞表达标记,如特定阶段胚胎抗原,SSEAs [161年,162年)(例如,SSEA-1 ESCs在老鼠和人类的ESCs SSEA-3)。几个策略利用到目前为止,寻求丰富祖细胞或postmitotic vmDA神经元(表1)。在理想的情况下,结合细胞表面标记定义一个族群,至于血细胞(163年),允许我们选择vmDA神经元在不同的阶段。然而,这样一个细胞表面指纹尚未被定义为vmDA神经元。除了标记的选择,时间的选择也很重要,因为生存post-mitotic排序后神经元损害。
最初的概念验证研究,表明主,post-mitotic vmDA神经元可以通过流式细胞仪浓缩,使用染料标记或TH-based荧光表达(164年- - - - - -166年]。此外,这些细胞存活在成人6-OHDA损伤帕金森大鼠的纹状体移植和诱导部分功能恢复165年,166年]。从选择研究已经变得明显,高纯度mDA神经元数量需要额外的营养支持,可通过coculture与星形胶质细胞(159年,166年]。神经元的数量通常需要目标——(轴突、树突)派生的营养因素对生存的支持。因此,coculturing纯化mDA与纹状体神经元靶细胞可能会促进生存。此外,也有可能净化vmDA神经元镀文化会更好地生存,如果他们在一个足够高的密度,以确保增加细胞间接触和暴露于营养因素,例如,BDNF分泌邻近细胞群。
隔离vmDA神经元干细胞已被证明是更复杂的自细胞不仅在时间或空间的方式,如胚胎,(见上图)。例如,使用TH作为选择标记表达TH以来提出了挑战在开发过程中多种细胞类型,包括细胞增殖能力(167年]。我们和其他人以前利用TH驱动eGFP表达在胚胎干细胞丰富vmDA神经元(127年,168年]。然而,由于nonneuronal eGFP的表达在细胞形态、产生的移植是由大多数比非mda生成神经元和大多数vmDA嫁接之后,而不是之前排序过程(127年,168年]。结合积极的与消极的选择选择TH-eGFP未成熟的细胞通过细胞表面标记SSEA-1导致人口丰富神经(127年]。
更限制vmDA神经元的标记是homeodomain转录因子Pitx3,既定的和选择性的mDA大脑神经元中表达。Pitx3也是暂时性的表达骨骼肌和眼睛的镜头27,121年),但一代的细胞数量期间是可以避免的在体外分化使用感应协议针对中脑的命运(129年,147年,159年,169年]。在我们的研究中移植Pitx3-eGFP ESC-derived人口丰富的表达可以有效地扭转amphetamine-induced旋转行为,显著降低apomorphine-induced旋转的行为(159年]。然而,细胞数量,包含~ 80% Pitx3-eGFP细胞仍然可以偶尔产生畸胎瘤的形成。虽然这积极的选择过程导致了10倍SSEA-1阳性细胞的数量减少,一些未分化的细胞增殖能力。第二轮的流式细胞仪等eGFP的表达可以删除不必要的细胞,纯度98% mDA神经元,这活了下来在体外。而不是通过第二轮将细胞流式细胞仪,消极的选择可以同时执行SSEA-1 Pitx3-eGFP的积极的选择。这种消极的选择之前成功地减少增殖细胞(127年和避免移植后肿瘤形成160年]。
Sox1-GFP转基因表达已成功作为积极的选择标记的神经祖细胞从肿瘤干细胞衍生的文化,避免形成125年,158年]。然而,尽管这种策略似乎减少的风险从移植细胞过度生长,很少产生多巴胺神经元丰富Sox1积极的人口(125年,158年]。这个结果并不完全令人惊讶因为vmDA祖域神经元缺乏Sox1表达和最近的一项研究发现,除重组的Sox1鸡尾酒改善Pitx3阳性神经元的一代小鼠成纤维细胞(149年]。
多项研究已经使用细胞表面膜蛋白NCAM的表达(神经细胞粘附分子)及其polysialylated形式,PSA-NCAM,分析或丰富post-mitotic神经元(111年,112年,159年,170年,171年]。选择PSA-NCAM和随后的移植已经表明,肿瘤形成可避免(111年,171年]。然而,结果移植都很小由于贫穷的生存111年]或缺乏vmDA神经元的一个合适的身份(171年]。
4所示。直接重编程vmDA神经元
所有细胞个体本质上相同的基因,不同的细胞表型是由其独特的基因表达谱,这是由转录因子控制。因此,操纵某些关键转录因子的表达细胞转录的允许修改配置文件,最终,重组的表型(172年]。利用重组技术,可以生成诱导多功能干细胞(iPS)细胞系和成熟的表型,如诱导神经元(iNs) [173年),从访问的细胞,如皮肤成纤维细胞。重编程技术是特别有价值的获取人类神经元携带突变与神经系统疾病有关。直接重编程方法的优势是绕过多能阶段(图3),它缩短了实验过程和避免与再分化过程相关的障碍。另一方面,没有可能扩大产生的细胞群,这需要每个细胞重新编程的需要。这成功地克服了不便直接重编程老鼠和人类成纤维细胞的神经干细胞阶段Sox2表达(174年]。最关键的问题,但与此相关的方法是确定细胞重编程过程完全重置身份和这些细胞是否成为真正的功能神经元。在最初的报告173年),结合Mash1, Brn2 Mytl1生产的细胞没有明确定义的区域表型(175年]。从那时起,TH阳性的生成通过直接重编程(148年- - - - - -151年)通过添加一个或多个转录因子在中脑发育很重要,包括Foxa2 Lmx1a / b, Nurr1, En1和Pitx3不同(表组合1)。内在因素和外在信号之间的相互作用是再次强调在一项研究中使用鼠标Pitx3-eGFP转基因成纤维细胞(149年]。在这项研究中接触嘘和Fgf8重新编程细胞部分克服了他们缺乏成熟,更类似于vmDA神经元。然而,尽管一些证据在活的有机体内函数,这些DA iNs还不同于主要神经元在分子和功能分析。有趣的是,Sox1的过度表达,Pax6,有趣的是,Lmx1b,没有一个抑制作用或影响重组效率(149年]。因此,这些研究有助于建立血统决定因素的层次结构,这些转录因子的相对贡献在制作vmDA神经元的身份。
到目前为止,这些分化转化研究的新兴的照片(和以前的超表达化验)强调了需要克服上下文依赖性,这似乎是由染色质的修改。在这方面,而令人困惑的是,同样的因素足以重新编程从不同的生殖细胞层,也就是说,真皮成纤维细胞和肝细胞,神经元(176年),原则上,不同的内生程序需要压抑的起始细胞群。这也许表明颈板的一些基因,最有可能Mash1,能够开关整体转录网络。所谓的主监管机构的组合,如Mash1 (Ascl1)腹侧神经元和Foxa2底板神经的后代,和终端选择器,像Nurr1 (Nr4a2)和Pitx3,加上外在感应信号(177年和染色质修饰符149年,178年)可能需要生成vmDA神经元有一个正确的分子和功能的身份,直接从体细胞无关。
总之,一个精确的时间和空间一体化的外在和内在因素是建立转录所需的网络,赋予细胞的身份。只有神经元与适当的mesostriatal vmDA身份能够取代神经元突触连接和迷失在帕金森病和恢复功能。了解信号在胚胎发育的复杂的相互作用将有助于识别关键因素需要改进这些神经元的生产在体外多能干细胞和体细胞。同样,单个转录因子的能力和外在信号诱导和稳定vmDA表型将有助于确定他们的角色在天堂规范,并进一步了解人类中脑的发育。
确认
j·c·阿古里亚·的FPI奖学金支持西班牙经济和竞争力。格兰特从瑞典医学研究委员会(不支持。e .荷得拉得2011 - 2651),从西班牙科技部创新(r . Sanchez-Pernaute saf2008 - 04615)和部门的行业(PE10IB04)和教育(EC2010-28)巴斯克政府r . Sanchez-Pernaute。作者感谢这张因他杰出的工作Karlen生成数据。