分泌的因素从骨髓基质细胞移植il - 10和反向急性肾损伤

文摘

急性肾损伤是一种具有破坏性的综合症,影响超过2000000人每年在美国,有一个关联的死亡率超过70%的严重情况。不幸的是,标准的治疗方法不能满足修改病程。许多组织探索使用骨髓基质细胞(bmsc)治疗阿基因为bmsc已被证明具有独特的抗炎,cytoprotective和再生能力在体外和在活的有机体内。还未解决的主要机制是否控制BMSC治疗阿基取决于细胞直接注入,还是BMSC-secreted因素就足以减轻伤害。在这里,我们表明,BMSC-secreted因素能够提供一个生存利益受到cisplatin-induced AKI的老鼠。我们观察到当BMSC-conditioned介质(BMSC-CM)静脉注射给药,它可以防止管状细胞凋亡和坏死和改善。另外,我们观察到BMSC-CM导致对待动物,il - 10 upregulation是重要的动物生存和保护肾脏。总的来说,这些结果说明BMSC-secreted因素没有细胞移植能够提供支持,和il - 10在BMSC-CM-treated增加动物与衰减严重。

1。介绍

每年大约有2000000人在美国发展急性肾损伤(AKI),死亡的可能性大于70%的透析依赖(1,2]。阿基是一种炎症器官衰竭综合症,是由于广泛的肾实质损伤(3]。有多种病因源于肾前的的阿基,内在肾,或postrenal原因。不管病因,然而,它认为有持续的系统性炎症可能导致预防组织再生和疾病逆转(4]。分辨率是可能实现的,如果炎症细胞因子风暴由阿基可以减毒,和支持提供帮助受伤组织的愈合5]。不幸的是,只有现有的AKI患者姑息疗法。透析,同时有助于恢复电解质平衡,清除血液中的废物,弱补充剂没有肾脏没有提供抗炎或再生的支持(6]。单分子疗法针对阿基迄今为止证明不足解决复杂的病理生理学基础疾病(7]。能解决疾病的新疗法通过并行处理多个方面的安琪病理生理学是迫切需要的。

骨髓基质细胞(bmsc)一直在探索在临床前和临床研究作为一个潜在的治疗患者的阿基(8]。伴着已被证明具有强大的免疫调节和再生性能在体外和在活的有机体内(9,10]。综合治疗的主要机制尚不清楚。一些研究表明归航,移植和分化的关键疗效[11),其他则强调了从bmsc分泌因素的重要性的关键调解人(12]。试图解决这个问题,我们和其他人测试BMSC-secreted因素相比,各种疾病模型和完整的细胞移植。这些研究表明BMSC-secreted因素有能力提供治疗支持啮齿动物患有急性疾病与炎症相关的(如肝衰竭、败血症),并能提供优质的支持相比,细胞移植(13- - - - - -15]。特别是,我们已经看到BMSC-secreted因素负责逆转促炎细胞因子的表达和相应增加抗炎细胞因子白细胞介素- 10”(il - 10)。迄今为止,这尚未得到明确解决是否也在阿基。阿基的几个模型所示,这些因素能够提供重要的支持(16- - - - - -18),以减少总损伤肾小管上皮细胞,和保护肾小球滤过率和肌酐清除率的缺血性和rhabdomyolytic损伤模型。Togel和他的同事们(16和达菲尔德等。19]表明,当bmsc的上下文中注入阿基,很少细胞嫁接移植之后的几个小时内,和一些细胞在肾脏24小时后发现这是一致的与其他研究也表明bmsc的半衰期在活的有机体内的天(20.,21]。尽管如此,他们仍然观察到在缺血性肾脏结构和功能的改善。此外,他们观察到类似的减少促炎有害状态在阿基正如我们所看到的在其他炎性疾病模型与BMSC-secreted因素,可以通过抑制促炎细胞因子的表达和upregulation抗炎介质的表达在肾脏的mRNA水平,包括il - 10。

在当前,我们证明BMSC-secreted因素能够保护老鼠从发展中国家严重的阿基顺铂治疗后没有细胞移植和可以提供一个生存受益。车辆和模拟电池控制相比,我们看见一个统计上显著的生存利益授予的BMSC条件培养液(CM),连同优待组织学和血清肾功能参数。另外,我们观察到显著增加血清il - 10水平与BMSC-CM动物对待,il - 10使用一种抗体中和,BMSC-CM的影响明显减弱。这项研究的结果清楚地表明,在阿基,分泌的因素就足以减少伤害和长期生存。

2。方法

2.1。细胞培养和条件培养基

bmsc分离、纯化、发展和特点,和成纤维细胞生长如前所述22,23]。短暂,bmsc隔绝整个骨髓(Lonza、巴塞尔、瑞士)选择性粘附和扩大殖民地七天。殖民地使胰蛋白酶化和山肩进一步扩张。文化的纯度(> 99%)决心与流式细胞术(结果未显示)染色bmsc与BD Pharmingen CD44、CD45、CD29, CD73、CD106或CD11b抗体(BD,富兰克林湖,新泽西)。伴着都是在通过使用2 - 5。成纤维细胞培养的细胞系pc - 201 - 012(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州)。的条件培养基收集和集中如前所述24]。简单,细胞类型(bmsc和成纤维细胞)增长到60%融合,与PBS冲洗两次,然后孵化24小时的无血清DMEM含有0.05%牛血清白蛋白(σ,圣路易斯,密苏里州)。条件培养基是收集和集中使用Amicon离心集中器3 kDa截止(微孔、Billerica MA)。除了在不同细胞的存在,培养条件媒体bmsc与成纤维细胞(的边后卫)收集和准备相同。按照惯例,“1 x”是指条件培养液的浓度达到15毫升的调节介质孵化时的存在细胞24小时,收集,集中到最后一卷1毫升。这用于bmsc和成纤维细胞是预备这些研究的目的。

2.2。鼠模型Cisplatin-Induced急性肾损伤和BMSC-CM治疗

所有动物实验进行按照马萨诸塞州综合医院的动物权利政策委员会研究动物保健。男性SAS-SD老鼠(查尔斯河实验室,威明顿,MA)重275 - 300克有顺铂(7.5毫克/公斤;σ,圣路易斯,密苏里州)溶解在通过腹腔注射生理盐水诱导。注射后不同时间点,BMSC-CM FB-CM,生理盐水或混合物BMSC-CM + anti-rat IL-10Ab (BD,富兰克林湖,新泽西;表达载体,卡尔斯巴德,CA)通过阴茎静脉注射静脉注射治疗cisplatin-induced AKI。所有BMSC-CM FB-CM剂量由1毫升每剂1 x厘米,在所有情况下,在每个剂量4 IL-10Ab的浓度g稀释1毫升的条件培养基。

2.3。组织组织学和染色

老鼠与isofluorane麻醉(Hospira森林湖,IL),并进行剖腹手术进入腹腔。安乐死是由切断腹主动脉和刺穿隔膜。两个肾脏切除,用生理盐水冲洗在固定缓冲甲醛(σ,圣路易斯,密苏里州)在室温下一周。肾脏被嵌入在石蜡和4μ米部分创建使用切片机。的部分进行分析通过(1)与苏木精和伊红染色()),(2)TUNEL根据制造商的指示(研发系统、明尼阿波利斯、MN),(3)增殖细胞核抗原抗体;探讨了如前所述[25),或(4)彩色肾损伤molecule-1 (KIM-1) [26]。所有组织收集从安乐死动物腹腔注射顺铂后5天。)部分,组织学评分进行大鼠被安琪和处理盐水BMSC-CM或BMSC-CM + anti-rat il - 10抗体,分别每组三只老鼠。三个微观领域40 x放大尼康Optiphot-2分析的三个区域,每个动物肾脏、外皮层(OC),内皮层(IC)和外部的条纹外髓质(OSOM)。基于观察膨胀管损伤量化,刷状缘,演员阵容,碎片,变薄,细胞损失。定量的分数是基于以下指标:0 =正常;1 = 1 - 25%的伤害;2 = 26 - 50%伤害;3 = 51 - 75%伤害;4 = 76 - 100%伤害。 Apoptosis was quantified by taking the average number of TUNEL positive cells in four fields at 10X of the medulla and cortex of rats subjected to cisplatin AKI and treated with either saline ()或BMSC-CM ()。PCNA染色,我们使用了一个anti-PCNA克隆PC10(σ,圣路易斯,密苏里州),其次是第二个羊anti-mouse (1: 50;Chemicon,泰梅库拉,CA)和信号使用Vectastain ABC开发工具包(向量实验室,伯林盖姆,CA)。确定每个字段的PCNA阳性细胞数,代表20 x放大的图像被肾脏样品的三个动物,髓质和5的5图像的图像皮层,和每个字段被数和阳性细胞的数量列表。肾损伤molecule-1 KIM-1是彩色如前所述26,27]。简单地说,4μm石蜡部分患者,KIM-1贴上一只山羊anti-rat Tim-1 / KIM-1多克隆抗体(研发系统、明尼阿波利斯、MN)。二级抗体抗体使用驴Biotin-SP-conjugated,信号是用ABC开发过氧化物酶民建联标签。然后用苏木精复染色部分。TUNEL、PCNA和KIM-1染色,同形像控制进行,除了一个健康的肾脏控制比较结果(没有显示)。

2.4。血液尿素氮(BUN)和肌酐测定

所有包和肌酐分别进行血液来自肾功能的老鼠和分析小组根据制造商的指示(联盟城市Abaxis, CA)。包子和肌酐分析,所有动物都牺牲了五天后ip注入顺铂和阿基的感应。

2.4.1。il - 10 ELISA

河鼠il - 10酶联免疫试剂盒提供了使用商业供应商和使用根据制造商的指示(OptEIA酶联免疫试剂盒;BD,新泽西富兰克林湖)。血来自动物通过尾巴剪3天血清il - 10的存在使用这个商业分析工具。BMSC-CM也分析il - 10使用相同的工具来评估是否测量动物的血清il - 10是归因于BMSC-CM。

2.4.2。统计数据

除非另外注明,所有的实验都重复一式四份,和所有数据评估使用成对的意义,学生的双尾以及。所有的图表显示每个实验组有误差的平均值表示一个标准差的扩散数据。

3所示。结果

3.1。BMSC-CM变弱Cisplatin-Induced阿基在老鼠

在这些研究中,我们选择使用顺铂在大鼠模型。顺铂在临床上用作癌症化学治疗剂和仍然是许多恶性肿瘤的护理标准,包括卵巢癌和宫颈癌,因为其强大的治疗记录(28,29日]。然而,最常见的一种顺铂管理和危险的并发症是肾毒性30.与阿基),从而导致死亡。主要假设测试是BMSC-secreted因素,当用于治疗致命的顺铂,可以提供所需的多因子的支持保护肾脏,防止器官衰竭死亡。

我们开始我们的研究通过优化所需的剂量顺铂诱导75%死亡率两周,对7.5毫克/公斤i.p到达。(31日]。然后我们确定一个有效的疗法治疗与BMSC-CM阿基。先前的研究说明疾病发作表现出不可逆损伤的动力学在第一个72小时后顺铂管理(32]。因此,我们选择了五个时间点重复输液管理BMSC-CM: 3、9、24、48和72小时后顺铂。这方案提供了一个重要的生存(图中获益1);相对于控件(FB-CM,;生理盐水,),BMSC-CM ()生存从25%提升到71.4% ()[22]。除了提供一种生存利益,BMSC-CM也显著减少顺铂AKI的严重程度。当动物被注射相同剂量的顺铂,包子和肌酐急剧上升vehicle-treated老鼠白天3 (),继续爬到第五天,表明疾病的严重程度和不可逆性的损伤(数字2(一个)和2 (b))。然而,当这些动物对待BMSC-CM如上所述(),面包和肌酐急剧上升在任何时候在第一次五天后顺铂。这表明BMSC-CM阻止广泛损伤的肾脏和保留足够的架构和肾脏这样间隙的函数包和肌酐不是极大地影响。

3.2。BMSC-CM部分保留肾脏的组织学完整性老鼠接受顺铂

从肾脏功能标记的结果,包子和肌酐,似乎可能BMSC-CM治疗保护肾脏的架构,从而保护肾小球滤过率(GFR)。当老鼠受到致命剂量的顺铂,然后用生理盐水治疗(),他走时染色的肾脏皮质破坏的形式透露倒塌肾小球囊和近端肾小管坏死,和外髓损伤的形式广泛的肾小管坏死,沉积的碎片和小管圆柱与cisplatin-mediated安琪(图一致3)。受伤很严重,在切除肾脏严重出血性和正常组织坚定是柔软所取代。大鼠的肾脏管理BMSC-CM (),另一方面,持续的伤害更少。)分析显示肾小管坏死,减少损失刷边界,减少管状上皮剥露,和明显的减少或累积的碎片。

我们下一个试图分析细胞凋亡在顺铂肾毒性。TUNEL分析第五天肾部分暴露出大量的凋亡疫源地的髓质vehicle-treated肾脏,符合pars直肠损伤模式的近端小管所沉淀的顺铂(33)(,图4(一))。我们没有观察到显著的在这些动物的皮质TUNEL阳性染色。观察到髓细胞凋亡vehicle-treated动物并不是出现在BMSC-CM对待动物()。定期观察凋亡细胞的BMSC-CM治疗肾脏,但大约有十几倍vehicle-treated肾脏,显示更少的凋亡事件BMSC-CM-treated肾脏(图4 (b))。

然后我们看着的流行标志再生的肾脏来测试假设BMSC-CM治疗可能促进再生,这可能造成复苏的动物。PCNA表达得更广泛的BMSC-CM治疗肾脏(比健康控制肾脏()),只显示稀缺PCNA-positive细胞(不到一个平均每10 x领域,数据未显示)(图5)[34]。我们量化PCNA阳性细胞的数量在每个20 x字段,并发现阳性染色的程度vehicle-treated肾脏明显高于BMSC-CM治疗肾脏。

3.3。il - 10对阿基BMSC-CM治疗很重要

因为我们看到这样一个老鼠在阿基BMSC-CM强烈反应,我们研究了机械的影响BMSC-CM疗法,特别是BMSC-CM如何影响动物的免疫状态在阿基。以前的工作表明,在肝衰竭,大鼠的炎症状态处理BMSC-CM相比降低了车辆控制(24]:vehicle-treated老鼠发达高系统性il - 1的含量β肿瘤坏死因子-α、il - 6和IL-1ra,和低水平的il - 10,而BMSC-CM治疗大鼠开发高水平的il - 10和低水平的il - 1β肿瘤坏死因子-α、il - 6和IL-1ra。在其他模型,il - 10 upregulation BMSC疗法已被证明是一个标志(13,35),已被证明影响il - 1的表达β肿瘤坏死因子-α,il - 6在体外和在活的有机体内(16,36]。我们评估是否BMSC-CM治疗导致增强il - 10的表达。BMSC-CM治疗大鼠的血清il - 10水平(三天后)顺铂管理明显高于车辆控制(,图6(一))。确认的il - 10我们测量没有出现BMSC-CM注入,我们确定在BMSC-CM il - 10的数量。即使BMSC-CM是从人体细胞和il - 10我们测量的动物是老鼠,我们不过想确认没有大独立在BMSC-CM ELISA和测量。我们发现那一刻积极反应的BMSC-CM ELISA不能占il - 10的血清(图6 (b))。

最后,测试的il - 10可能负责治疗的有效性BMSC-CM治疗阿基,我们使用相同的生存模型的顺铂阿基(7.5毫克/公斤)和coadministered BMSC-CM中和抗体il - 10在4μ每剂g。图7显示了减少BMSC-CM对动物的生存的影响当coadministered中和抗体(il - 10)相比,生存数据呈现在图1:更少的动物当il - 10的抗体与BMSC-CM coadministered幸存下来。应该注意的是,当使用日志等级测试,测试的意义价值之间的区别BMSC-CM与il - 10和BMSC-CM抗体0.28,表明趋势而不是生存的显著增加或减少。因此,进一步描述的影响il - 10抗体BMSC-CM管理,他走时组织学表现了三个治疗组:生理盐水()、BMSC-CM (),或BMSC-CM 4μg il - 10的抗体()。肾损伤标记染色,KIM-1和血清分析肾损伤标记的包和肌酐也表现在同一组。包子和肌酐被选为常见的肾脏损伤的标志,和KIM-1被选为一个更具体的和敏感的标志直接肾损伤(27,37,38]。)强调了组织损伤的严重程度之间的差异由于il - 10中和(图8(一个))和肾脏组织学评分显示区别对待BMSC-CM和il - 10中和抗体(图8 (b))。在所有组中,外髓质损伤太严重,看到一个区别治疗武器;然而,在内部和外部皮层,BMSC-CM对待动物损伤表现出显著低于vehicle-treated BMSC-CM +中和il - 10抗体治疗。支持生存的结果,他走时的损伤明显染色的抗体治疗动物是那样严重处理。这些结果部分是主观的,未来的研究,量化损伤更完全可能会进一步阐明il - 10中和在组织损伤的影响。然而,这些结果反映在包子和肌酐水平(图9)和KIM-1染色(图10)。BMSC-CM对待动物表现出显著减少包和肌酐积累和最小KIM-1-positive染色相比,包子的显著上升,肌酐和肾的广泛积极KIM-1染色在汽车治疗和BMSC-CM + il - 10抗体治疗组。显然这些结果支持假设il - 10是一个重要的中介通过il - 10 upregulation BMSC-CM疗法和建议,在阿基BMSC-CM防止肾脏损伤。

4所示。讨论

我们已经表明,BMSC-CM孤独可以在阿基提供实质性的支持。多项研究表明,移植bmsc可提供生存受益阿基类似于我们观察到的东西。在一项研究中,静脉输液管理人类bmsc的(细胞/公斤)NOD / SCID小鼠在24小时后致命的顺铂政府增强生存从0%到40% (39]。另外,ip管理局(细胞/公斤)被证明是足够的NOD / SCID小鼠生存提供好处,增强生存从10%到47% (40]。在我们的研究中,我们使用了从相当于分泌的因素细胞/公斤,在同一个数量级与其他展示bmsc输液管理工作,这就是为什么我们可能期望一个类似的结果在阿基的保护。然而,这可能不是一个直接比较的BMSC-CM由分泌从只有24小时的调节因素,而永久性移植的bmsc移植和持续分泌道的因素随着时间的推移细胞(41]。但是应该认识到,在大多数情况下,细胞生存是非常短暂的。

我们的结果是一致的与其他BMSC-CM在阿基的研究显示,人类首次BMSC-CM可以提供一个生存在阿基中获益。Bi和他的同事们发现,除了BMSC移植赋予一种生存利益接受顺铂AKI的老鼠,老鼠BMSC-CM也提供了生存(增加60%42]。我们观察到显著改善生存,我们假设可以归因于物种差异的厘米11]。然而,由于研究的Bi等人被执行死刑比我们以不同的方式有不同的啮齿动物物种,BMSC-CM管理方式,治疗方案,和BMSC-CM收割方法,很难直接比较研究的结果。同时,肾损伤的保护已经从政府报道BMSC-CM离心器部分的老鼠接受rhabdomyolytic阿基(18]。作者提出证据,微泡的离心器部分通过水平基因转移提供好处是减少与核糖核酸酶的共同。保护,组织学,包/肌酐和电子显微镜。然而,作者没有探索超离心机分数是否提供了一个生存的好处,他们也没有报告整个条件培养基能否提供类似或卓越的效益。总之,我们的结果在这里展示了迄今为止最大的改善生存的BMSC研究据我们所知,和表明,分泌因素单独是充分的AKI的决议。

我们之前的研究表明,从bmsc分泌因素,要么管理形式的条件培养基(厘米)或交付不断从体外生物反应器,能够提供生存利益动物发生暴发性肝衰竭(22,24]。我们观察到的促炎细胞因子在这些动物,与抗炎细胞因子il - 10的显著增加。il - 10牵连BMSC治疗之前在脓毒症(13),被认为是一个影响因素的调节在BMSC-mediated t细胞抑制(9,43]。在脓毒症,bmsc显示移植il - 10在巨噬细胞通过前列腺素E2-mediated重组。其他组表明,某些因素由bmsc可直接导致分泌il - 10的生产(12),包括TGF -β(44)和il - 6 (45),两个蛋白高表达的bmsc [46,47]。显然有机械的差异区分肝衰竭和败血症和阿基,不明显,细胞因子表达的相同的模式将会出现在阿基老鼠BMSC-CM处理。然而,il - 10也被证明是有效的治疗当体内送到啮齿动物接受阿基(48),证实了il - 10在减轻疾病的重要作用。因此,这也就不足为奇了,我们观察到upregulation il - 10,并发现,阻断细胞因子对动物的生存造成减少BMSC-CM对待。

为了利用我们所学到的BMSC-CM并开始翻译临床使用,我们最近一直在努力扩大我们的体外生物反应器开发治疗暴发性肝衰竭在啮齿动物22),以适应人类AKI的透析期间使用(49]。在我们的肝衰竭的研究中,我们发现,持续交付MSC-secreted因素从生物反应器可以提供一个优越的疗效相比丸BMSC-CM管理局(22]。这个平台也可以应用于现有透析电路允许交付BMSC-secreted因素直接进入血液的AKI患者接受透析。当播种在生物反应器中,我们显示剩下的bmsc能够切实可行和功能,同时保留其未分化表型流条件下模拟临床操作(49),这表明扩大的原型设备从我们的肝衰竭的研究可能会导致类似的活跃设备供临床使用。这里我们报告的结果进一步支持假设的分泌因素从bmsc交在血液的动物遭受阿基可以从根本上改变那些阿基的结果。

未来的工作将被要求完全阐明现象的机械细节报道,将所需的严格的比较完整的细胞移植。我们的实验都集中在条件培养液通过集中BMSC上层清液3 kDa截止滤光片。小分子介质如prostaglandin-E2可能重要的BMSC治疗活动身体都排除在这些研究[13,50]。这些和其他介质分泌bmsc对衰减可能重要炎症以及提供促有丝分裂的和血管生成支持恢复肾功能,和未来的努力,揭示其影响将是有用的。我们也选择使用人类与人类bmsc bmsc保留相关试验。然而,为了避免潜在的xenogenicity,它也可能是信息重复这些研究老鼠bmsc的CM。

总之,我们已经表明,BMSC-secreted因素,独立于细胞移植,能够刺激内源性抗炎程序通过il - 10,导致一个重要的生存受益老鼠接受cisplatin-induced AKI。这些结果表明,综合治疗的主要机制是基于细胞的分泌的因素,这将有助于优化的治疗方案治疗阿基BMSC患者。它也表明,替代细胞移植的方法也可能证明成功管理企业综合治疗,包括政府的条件培养基直接注射,或持续交付这些分泌的因素从生物反应器为阿基患者的血液,从而绕过与移植相关的潜在风险(51,52]。总的来说,这些结果呈现一种很有前途的和创新的新方法治疗阿基,利用自然的优势去检查参与组成分泌腺的BMSC。

缩写

伴着:	骨髓基质细胞
il - 10:	白介素10
CM:	条件培养基
PBMC:	外周血单核细胞
弗拉维奥-布里亚托利:	纤维母细胞
):	苏木精和伊红。

的利益冲突

三个作者(j . m . Milwid b Parekkadan和m . l . Yarmush)是Sentien生物技术的联合创始人,Inc . j . v . Bonventre在Sentien生物技术拥有股权。t . Ichimura和j . v . Bonventre coinventors KIM-1专利分配给合作伙伴医疗和授权合作伙伴强生,Sekisui医疗、Idec,和一些研究试剂公司。其他作者不申报任何潜在的利益冲突。

作者的贡献

j . m . Milwid构思理念、设计和执行实验,解释数据,写了论文。t . Ichimura得分组织学和KIM-1进行染色。m·李设计和执行实验。y交通设计和执行实验。j·李协助在动物实验。j·s·Yarmush协助分析数据。b . Parekkadan构思理念、设计和执行实验,解释数据,写了论文,并提供资金。a . w .直到构思的想法,解释数据,审核结果和摘要。j . v . Bonventre构思的想法,审查结果和摘要。m . l . Yarmush构思的想法,审查结果和论文,并提供资金。

资金

这项工作的部分资金由格兰特数量T32 HG002295国家人类基因组研究所(NHGRI) (j . m . Milwid)。这项工作也是部分支持由美国国立卫生研究院:K01DK087770 (b . Parekkadan) R21DK085267 (m . l . Yarmush) DK39773, DK72381 (j . v . Bonventre)和北美洲的施赖纳斯医院儿童医院(m . l . Yarmush b . Parekkadan)。

确认

作者要感谢德拉帕特里夏·佩尔与组织学援助。他们也愿意承认大卫Yarmush和迈克尔Cima有用的讨论和见解。

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