文摘

本研究的目的是评估的影响骨髓间充质干细胞(msc)移植在化学认知赤字和age-induced阿尔茨海默病模型大鼠。岁第一次实验动物(30个月)在莫里斯水迷宫测试(微波加工),分为两组:记忆受损和未受损伤的记忆。受损组织分为两组和空心双边海马的CA1交付的间充质干细胞()和PBS(磷酸缓冲盐)。在第二个实验中,Ibotenic酸(伊博语)双边注入下橄榄核magnocellularis(现)的年轻老鼠(3个月)和动物在微波加工测试。然后,动物记忆障碍收到以下治疗:msc ()和PBS。两个月的治疗后,恢复认知评估通过再学习范式中微波加工实验。结果表明,msc治疗显著提高学习能力和记忆力在年龄和Ibo-induced记忆障碍。成人骨髓间充质干细胞有希望治疗认知功能减退与衰老和非病变有关。

1。介绍

阿尔茨海默病(AD)的疾病被称为世纪重要的临床和社会经济影响。流行病学研究指出,广告影响5%的人口超过651),增加寿命的同时,疾病的发生率将大幅度上升。临床上广告的特点是渐进学习能力障碍和记忆丧失,特别是最近发生的事件的记忆(2- - - - - -4]。的一个主要老化和老年痴呆症的病理结果是基底前脑神经元和损失函数(5- - - - - -7]尤其是现化,主要输入大脑皮层(胆碱能8- - - - - -10]。很明显,古典病理特点的广告是斑块和神经元纤维缠结,动物都是非常罕见的,尤其是在小型实验室啮齿动物。在动物种群和人类,与年龄有关的认知能力下降与基底前脑的退化核(1,10]。实验excitotoxic病变非引起记忆障碍的几个任务(11- - - - - -13),它被认为是一个合适的方法来研究认知赤字和痴呆动物(1,12]。

目前的药物治疗AD治疗是阻碍由于贫穷的功效和副作用14,15]。成人神经组织的干细胞来源有限,使大脑的神经发生的可能性。干细胞移植治疗似乎是一个有前途的战略中枢神经系统(CNS)的退化性疾病,如广告、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS),和帕金森病(16,17]。

骨髓干细胞自我更新的一个例子multipotential细胞与发育能力产生特定的细胞类型(18,19]。似乎这些细胞能够分化成肝细胞(20.),骨骼肌(21),心肌细胞(22),和神经细胞23- - - - - -25体外。研究表明,移植间充质细胞的损伤能够生存和整合在宿主的大脑1,23,26]。在这种背景下李和同事(27]人类脐带血间充质干细胞用于广告老鼠和证明认知救援与恢复学习和记忆功能。还Nivet和同事(28]表明,人类嗅觉间充质干细胞能够恢复学习和记忆的海马损伤模型。

细胞疗法的终极目标广告的功能。很少有研究认知功能与相互矛盾的结果:改善(29日,30.和没有变化31日,32]。关于使用自体移植细胞绕过了伦理和免疫的问题,本研究旨在评估msc在恢复认知功能的疗效在两个不同的模型大鼠的广告。

2。材料和方法

2.1。动物

所有的这些实验中使用的动物被安置在细胞和分子研究中心动物设施。动物与免费的食物和水被安置在一个12 h光/暗周期和恒定的温度22°C。他们保持4 - 5关在笼子里。动物护理相关的程序都是按照Guilan大学医学伦理委员会。

实验1。四十岁年轻(30个月)和10(3个月)雄性Wistar鼠被用于实验。平均重量是老和g为年轻。动物收到四个试验每天连续4天的莫里斯水迷宫(微波加工)33),使用20分钟intertrial区间。探针试验期间进行平台被第五日。老鼠高于均值的平均延迟为受损被分成嫁接()和nongrafted对照组()。动物被放置在一个计算机立体定位器(Neurostar、德国)和插管在CA1区(坐标美联社:−3毫米,李:±2毫米前囱和V:从头骨表面−2.8毫米)(34]。岁年龄嫁接动物的性能与nongrafted和年轻的对照组。

实验2(非病变)。四十雄性Wistar鼠(3个月大的时候,称重g)被用于这个研究的一部分。建立认知赤字,我们注入伊博人非。手术那天,动物与氯胺酮麻醉/甲苯噻嗪(50毫克/公斤,i.p。)和放置在立体定位器。门牙栏被设定为−1.14毫米后7.9±2.46毫米外侧前囱和下面头骨到达顶部的下橄榄核magnocellularis [12),然后引导插管植入双边进一步注资。干细胞的另一个套管输血是植入在CA1坐标中提到的实验1。老鼠收到双边注入0.5μL的伊博人(10μ克/μ使用5 L)μL汉密尔顿注射器。14天后,老鼠测试微波加工为了测试学习能力。动物显示记忆障碍分布分成两组:(),()。

2.2。骨髓干细胞隔离

老鼠从胫骨骨髓是渴望得到的。本研究机构伦理委员会批准Guilan大学医学科学。骨髓是收集和离心机与聚蔗糖在1500 xg 10分钟;白细胞淡黄色的外套是恢复和镀75厘米烧瓶包含与杜尔贝科的修改鹰的介质(DMEM)和10%胎牛血清的边后卫。细胞培养在37°C调湿大气中含有95%的空气和5%的有限公司₂。达到融合,贴壁细胞分离0.05%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA) 5 - 10分钟37°C,收获和洗DMEM和resuspended中含有10%的边后卫。第一段后,形态均匀MSC的人口进行了分析使用流式细胞仪进行细胞表面分子的表达程序CD105, CD90、CD44 +。msc分化的脂肪形成的血统是化验使用脂肪形成的媒体(抗坏血酸50μg / mL, dexametazon 100海里,indometacin 5μ5 g / mL,和胰岛素μg / mL)。细胞的生存能力是由台盼蓝染料排除测试。简单地说,细胞被孵化和台盼蓝染料1分钟。蓝白积极和消极的细胞数在十20×字段,和可行的细胞的百分比计算。

两种接枝组收到注入1μL (500×10³/μL)细胞通道2,控制收到同样体积的海马的CA1 PBS。注射器被允许保持在5分钟后注入允许扩散到周围组织。

2.3。行为测试

移植两个月后,大鼠进行再学习任务(平台的不同于以前的实验)在莫里斯水迷宫。莫里斯水迷宫由黑色池(直径148厘米)装满水(°C)。一个圆形黑色平台水下2厘米到水面以下,中间的目标象限。池中老鼠的行为与相机连接到Ethovision系统可以跟踪(Noldus inc . Ethovision XT 7日,荷兰)让我们来测量游泳速度,距离,和延迟找到平台。老鼠每天培训协议的四个试验,间隔20分钟,连续4天。调查审判管理的第五天,每个主题放入水中时对角的目标象限和允许90秒搜索,从这个平台已经被移除。

2.4。统计分析

数据表示为±SEM手段。组差异逃脱延迟莫里斯水迷宫的探针任务进行了分析使用单向方差分析(方差分析)其次是图基的事后测试。方差分析重复测量多组比较用于分析组训练时期收集的数据的差异。

3所示。结果

3.1。干细胞的特征

间充质干细胞成功培养和扩展。一个形态均匀的纤维母细胞(图1)超过90%汇合后14天。第一段后细胞指数级的增长,要求每周的段落。流仪分析被用来评估MSC文化的纯洁性,出现均匀CD44阳性,CD105, CD90(图2)。

4所示。行为测试

4.1。Age-Induced记忆障碍

在微波加工的训练,没有,,组织学习过程中表现出了重大的审判影响(,)(图3)。因为没有组织不同的游泳速度(与cm / s;使用),延迟发现平台作为学习的性能指标。之间没有交互试验和组()。老鼠学会了更迅速找到这个平台(,,图3)。一个从细胞移植组大鼠死亡一个月后由于大脑感染。

受损之间有显著差异在探测延迟+ msc和受损+ PBS动物(与年代,,数据4和7)。虽然受损+ msc组显示改善延迟目标象限,他们没有达到年轻组分数(与年代)。

4.2。Ibo-Induced记忆障碍

收购莫里斯Ibo-lesioned组水迷宫任务是显示在图5。在实验过程中,延迟时间随时间逃离减少损伤和虚假的经营组织(,)。没有相互作用组和试验(,)。Ibotenic酸严重受损的延迟在探测试验平台相比,虚假的集团(与年代)。Ibotenic酸对游泳的速度没有显著的影响(与厘米/秒)。两个月后移植msc,老鼠学会了快速找到平台。正如所料,老鼠显示更少的时间需要找到平台( )。图基的测试表明,事后显著降低延迟发现平台相比集团(与,年代,图6)。总目标象限的时间也显著增加相比之下,(与年代,)。

结果表明,干细胞治疗减毒Ibo-induced学习和记忆障碍的莫里斯水迷宫测试。

5。讨论

本研究的目的是评估移植msc的治疗效果在衰老和excitotoxic病变引起的记忆障碍现。年老的动物用于我们的实验显示,空间学习严重障碍,关注,和记忆。根据先前的发现,在这些动物认知赤字与基底前脑核的退行性下降8,9]。使用年龄动物似乎是适当的评估记忆功能。

在第二部分的研究中,注入伊博人的现化产生显著破坏工作记忆,在协议与其他研究表明这个核与工作记忆协会(35- - - - - -37]。胆碱能神经元现预计海马体在注意力等认知能力扮演主要的角色,学习和记忆。它已经表明,注入伊博人减少海马和额叶皮层胆碱能活动38)通过过度刺激的n -甲基- d受体(39,40]。

我们的数据来自动物模型表明,有一个显著的改善msc移植后学习和记忆。这些结果证实干细胞移植的最终目标,是实现认知功能恢复。伊博语导致特定损失的somata以来各种神经元类型而不影响其他周围的细胞,如神经胶细胞和内皮细胞,甚至神经轴突(39,40),我们的数据表明,移植的干细胞分化可能在海马神经元。我们已经了解到,大脑的这个区域是一个非常敏感的地区,在编码中起着关键作用,巩固,学习和记忆和检索41]。提高学习和记忆的研究与之前的研究结果相一致使用其他来源的干细胞包括神经(42- - - - - -44],嗅觉[28],脐带血干细胞(27]。Nivet et al。28)表示,嗅觉msc移植不仅刺激内源性神经发生,而且恢复突触传递,提高长期势差。一项由李等人。27]表明,人类脐带血间充质干细胞移植减少胶质激活,氧化应激和细胞凋亡在广告老鼠大脑,因此改善记忆和学习。

尽管目前的研究并不旨在改善记忆力研究机制,几种机制可能有助于改善学习和记忆干细胞移植后在我们的实验。一个是这些细胞的功能添加到池中神经元的功能(24,45- - - - - -48与周边细胞[]和集成1,23,26]。这种机制需要支持在将来电生理学的研究干细胞进入主机电路的集成。我们发起行为测试移植两个月后,为间充质干细胞提供足够的时间来开发基于观察突触和电生理反应在先前的研究在其他神经退行性疾病和体外研究[45,48]。第二个可能性是,干细胞可以治疗效用增强现有的神经元的生存和活动(46,49]。吴et al。17)在他们的评论文章指出,神经干细胞释放扩散因素,可以提高年龄和退化的神经元的生存在人类的大脑17]。

间充质干细胞是非常具有吸引力的一个可能的细胞疗法在神经退行性疾病,因为他们的伟大的可塑性。最近,msc治疗已经转移到被用于一些临床试验模型像肌萎缩性侧索硬化症48,49]。第一阶段临床试验由马志尼证实,msc移植入脊髓的ALS患者是安全的,msc可能有临床使用未来的ALS细胞临床试验(48]。

总之,MSC移植反向渐进认知能力下降与衰老和伊博人损伤动物模型。

从临床的观点来看,考虑低风险tumourigenesis [48,50,51)和更少的伦理问题与骨髓间充质干细胞,这些细胞代表作为有价值的候选人来源用于移植治疗阿尔茨海默氏症。

补充材料