文摘

我们试图成人神经干细胞移植(ANSCs)在自体静脉移植手术于后神经cruralis30毫米长差距在成年的猪。移植的细胞悬液是一个主要的文化neurospheres从成人猪subventricular区(SVZ)的标签在体外BrdU或慢病毒转移荧光蛋白。Lesion-induced损失的腿伸展大腿成为明确的控制,但逆转neurosphere-filled静脉移植后45 - 90天。肌电图显示stimulodetection复苏neurosphere-transplanted猪而不是控制。后期免疫组织化学显示neurosphere-derived幸存细胞静脉移植从10到240年乳腺肿块内天,所有显示神经细胞表型。新成立的神经元分布在沿切断静脉移植神经纵轴。此外,ANSC移植CNPase表达增加,指示激活内在的雪旺细胞。因此ANSC移植在自体静脉移植提供了一个有效的修复策略。

1。介绍

神经损伤中频繁的公民实践(1,2和灾难比如地震3,4)或海啸(5把联想病变与挤压症候群。战争的风险提高了差距,与弹道伤口治疗延迟的6),因为这些人不太可能发生紧急比血管损伤(7]。这种风险有关战争后剩余炸药(8]。功能性pronostic取决于类型的伤口:于,粉碎,或缺口,已进一步分类根据缺口的长度,类型的神经(敏感、电动机或混合),本地化,受伤的协会,和病人的老化,时间的手术和血管环境(9- - - - - -12]。

Neuroguides特别是静脉移植经常用于桥小神经差距小于3厘米;长期神经缺口,自体神经移植已成为黄金标准自第二次战争(13,14]。但神经修复的结果取决于束一致性(15)和疤痕的发展,因此预期长期替代神经差距仍然是一个挑战来改善复苏后这种类型的病变。改善神经修复手术试验主要针对多样化的嫁接neuroguides resorbable材料(16]。结果改善了neuroguide预压与细胞外基质成分17- - - - - -19),生长因子(20.),或培养regeneration-enhancing细胞。后者策略,或细胞疗法,一直试图与雪旺细胞的主要文化(21,22[],嗅球enshealting细胞23),或各种类型的干细胞24]。在这些研究中,进行移植干细胞主要是胶质细胞,这间接提高轴突再生(24]。

从成人的大脑神经干细胞(ANSC)几乎想要帮助postlesional修复周围神经的,尽管他们强烈的集成和潜在发展成神经元25]。目前的研究是基于假设ANSC移植静脉内neuroguide可能有效长神经桥梁在成人。我们测试这个假说的猪,这是non-primate动物物种人类最密切相关,并倾向于手术和麻醉条件非常接近人类的协议在诊所26]。这一目标,我们主要的文化特征成年的猪脑的神经干细胞,通过优化neurosphere化验subventricular区外植体(27]。在目前的研究中,我们将这样的主要标记ANSC扩大在体外BrdU或慢病毒绿色荧光蛋白基因转移,我们移植标记neurospheres成一个自体静脉手术后30毫米长桥梁在成年的猪神经cruralis。我们比较neurosphere-grafted和控制猪功能恢复和评估移植细胞在损伤神经的命运在不同乳腺肿块的间隔。

2。材料和方法

2.1。动物

24个成年人,4大白色长白猪猪被用于本研究。他们被安置随意水和标准食物颗粒,在小屋组成一个院子,一个硬infrared-heated避难所。所有在活的有机体内实验协议是经当地伦理委员会批准使用的动物保护科学活动的协议数量/ IMTSSA / UCPE 31/2006。个人协议号码为手术和实验猪是2007/29 / DEF / DCSSA (o .利亚德)。都是努力减少实验用动物的数量,他们的痛苦。

2.2。麻醉

深度麻醉是由肌肉的术前用药法30毫克/公斤氯胺酮(Imalgene 1000,梅里亚,法国里昂),0.1毫升/公斤乙酰丙嗪(普托Vetranquil Calmivet,拜耳,法国),和25μ克/公斤硫酸阿托品(Meram换防,法国)。动物就配备了外周静脉灌注提供铃声-乳酸- 5%葡萄糖血清5 - 7毫升/公斤/ h,在CM5-SpO2胶粘剂心电图电极(心电图监控S5, Datex Ohmeda,麦迪逊,WI,美国),和一个人工氧合器。麻醉诱导是由静脉注射异丙酚2毫克/公斤(曾拜耳)慢慢在30秒,并完成三次(Sufenta,拜耳)1.5μ克/公斤。当地声门麻醉用5%利多卡因喷雾(利多卡因,拜耳),气管插管仍与之前monolight插管(内部直径6.5毫米)。肺实质的通风与听诊器和机械辅助检查。全身麻醉与电动持续静脉输注异丙酚2毫克/公斤/小时(DCI曾)1。舒芬太尼μg / kg / h (Sufenta DCI)和溴化rocuronium 0.15毫克/公斤/小时(Esmeron DCI);curarisation是监督的S5监控(Entropie模块),但没有公布肌电图。Antibioprophylaxy管理。手术,cardioventilatory参数(心脏和通风率、心电图、血氧,通风压力和体积,MAC,温度,hemoglucotest)以及睡眠阈值不断注视着S5监视器。

2.3。脑组织抽样主要神经干细胞文化从成人猪

独立的动物为主要文化和专用在体外扩张的神经干细胞脑subventricular区(SVZ)如前所述27]。在每个深度麻醉猪,背的头骨被电锯和删除。15毫米厚的大脑进行冠状切片手术刀在中脑的合缝处的水平,手动移植和转移在4°C冰bed-laid无菌金属板,在本生灯火焰灭菌的气氛。因此实验动物是活着,直到移出大脑的组织切片。每个猪脑组织抽样的静脉注射后立即牺牲Dolethal (R)戊巴比妥(DCI) 1.5毫升/公斤。

2.4。主要的文化SVZ神经干细胞(“Neurosphere分析”)

如前所述(27],SVZ碎片很快就从厚microdissected中脑切片(上图)在低钙沿腹外侧的侧脑室人工脑脊液(氯化钾氯化钠aCSF: 124毫米,5毫米,3.2毫米MgCl₂,0.1毫米CaCl₂26毫米NaHCO₃、100毫米葡萄糖和pH值7.38)。组织样本与aCSF冲洗两次在40 U cystein-EDTA -和消化β-mercaptoethanol-preactivated木瓜蛋白酶(σ,L 'Isle D 'Abeau,法国)10分钟37°C,然后在250年μL稀释TrypLE表达解决方案(耐热微生物生产、纯化trypsinlike酶,Gibco # 12604 - 013,表达载体,- pontoise,法国)10分钟37°C。之后的750年μL为8分钟新鲜aCSF和离心400 g在室温条件下,细胞颗粒在1毫升培养基(resuspended DMEM(σ),1 x B27 (Gibco表达载体),200 U /毫升青霉素,和200年μg / mL链霉素(Gibco英杰公司)包含20 ng / mL表皮生长因子(EGF, Gibco英杰公司)和20 ng / mL基本成纤维细胞生长因子(bFGF, Gibco表达载体)。这些细胞被分离与26 G钢针轻轻无菌一次性1毫升注射器,指望Malassez幻灯片,播种在每毫升20000个细胞6-well板块(美国猎鹰,BD生物科学,贝德福德)。文化是每天监测遵守neurospheres形态增长;通过执行在大多数领域100 - 120μ米直径。对于通道,主球在无菌收集管,孵化45 - 60分钟250年37°CμL稀释TrypLE表达解决方案(Gibco英杰公司)6毫升而颗粒,和分离轻轻地26克钢1毫升无菌注射器针;分散的细胞被离心机、统计和播种。所有文化媒体被更换新的2毫升的介质/ 4毫升每2 - 3天。免疫细胞化学、盖玻片轴承分化球体在PBS冲洗,固定在4% paraformaldehyde-containing PBS 20分钟在4°C,并保持在4°C到化验PBS。

2.5。在体外标签Neurosphere细胞

在第一组实验中,三级neurospheres孵化与DNA合成前体bromo-2-deoxy-uridine 30μ米(BrdUσ)从2 DIV通道后8 - 10 DIV, BrdU添加新鲜每天从集中的股票。

在第二组实验中,血统标签是由感染的二级neurospheres绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体(LV-GFP) 4 - 5通道后DIV。LV-GFP刚形成,滴定,和测试如前所述28),存储在−80°C和解冻之前使用。Neurosphere文化preincubated 30分钟的1毫米聚凝胺(σ)和空白慢病毒颗粒(车牌区域,29)为0.1 x M.O.I.,进一步孵化2 h用新鲜培养基含有1毫米聚凝胺和LV-GFP 0.3 x M.O.I.;孵化中标准,取代它的是新鲜的培养基。LV-GFP-infected neurospheres被允许3天文化在标准条件最佳血统标签(图1);(28]。

BrdU后最优文化时期(5 - 6天,3天LV-GFP)和前移植神经病变网站(见下文),neurospheres收集,离心机4分钟800 g,在新鲜培养基resuspended 3×10³球每毫升。

2.6。Postlesional移植手术

手术方法是意识到大腿中间表面上隔离神经cruralis。神经损伤成立于正确的n cruralis通过创建一个30毫米的差距,然后用自体静脉段采样的桥接诉mammelian externalis。这种静脉neuroguide缝合两端的perinevre分段神经。在一些动物,一旦静脉轴的近端端缝合损伤神经,300μ刚做好的neurosphere悬挂(10 L³球体)轻轻地充满neuroguide微量吸移管到另一端,当时缝合到远端损伤神经。在其他动物(控制),静脉neuroguide缝合没有任何额外的操作。

在第一组实验中,进行头猪被因此移植与自体静脉轴是空的(控制,)或充满BrdU-prelabeled neurospheres ()。这些动物被允许8或损伤后45天的生存。

在第二组实验中,进行猪与静脉移植neuroguides要么是空的(控制,)或充满LV-GFP-labeled neurospheres ()。这些动物被允许损伤后8个月生存。

2.7。进行动物的功能分析

动物行为被评估评估肌肉萎缩,赤字的腿伸展大腿。每个动物都检查在周围神经损伤和45天之前,90年、180年和240年后手术桥接。

电动机化验了脚部的神经肌电图的函数,使用pregeled表面电极连接到便携式肌记录器(关键点(R) v6.01,美敦力公司,MN,美国)。双同心针(直径0.47毫米)应用于肌肉股四头肌femoristimulodetection分析以及n cruralis。刺激是单身100毫安的冲击,从0.1到1毫秒时间。肌电图进行动物之前,45岁,90年,180年,横断后240天。值记录的电压,可检测肌活动的振幅和时间延迟。

2.8。免疫组织化学

年底postlesional生存,经营的地区n cruralis每个实验猪解剖了大腿的麻醉和浸泡在4%多聚甲醛溶液固定的0.05米,pH值7.4,不₂阿宝₄/ Na₂HPO₄缓冲24 h在4°C,然后冲洗24小时在4°C 0.1米,pH值7.4磷酸盐(PBS)。当时cryoprotected 72 h在30%蔗糖溶液,flat-embedded 10月安装介质和snap-frozen液体异戊烷在−−40°C存储80°C。纵向20μ米厚的部分是在低温恒温器(徕卡2800),安装在商业预镀幻灯片(Superfrost-Plus,费希尔科学,加拿大),在环境空气干通宵,储存在−20°C。

为immunohistofluorescent标签,这些组织部分被带回室温和permeabilized 0.1 PBS triton - x - 100的0.5%。核抗原,组织部分也对15分钟10毫米柠檬酸钠溶液pH值(5.5)在95°C。PBS冲洗后,一切准备工作就绪孵化阻碍缓冲区(Triton 0.1 PBS, 0.1%, 3%的牛血清白蛋白,5%正常血清)1 h,然后一夜之间在与一个主要抗体(表4°C1)。经过三5-minute-rinses新鲜0.1 PBS,披露了免疫组织化学的标号2 h孵化在黑暗中在室温下与适当的alexa - 594 -共轭二次抗体(美国分子探针,尤金,或;1/400)。double-staining实验,alexa - 594显示幻灯片都冲洗三次新鲜0.1 PBS和进一步孵化一夜之间在4°C与另一个主要的抗体,这是显示与适当的alexa - 488共轭二次抗体(分子探针;1/200)。冲洗后,荧光染色细胞核是由5分钟在黑暗中孵化与DAPI (0.5μg / mL,σ)。标签幻灯片与水安装介质盖玻片(Vectashield、矢量、Abcys、法国),用荧光显微镜拍照。CNPase免疫组织化学标记被使用ImageJ量化这些显微照片的软件。

3所示。结果

3.1。临床结果

手术前,所有实验动物都是健康,并没有显示出行走赤字。手术后,没有一个动物显示任何疤痕感染或主机拒绝回应。

通过临床观察,失去右腿扩展在大腿是系统地观察手术后神经于。这汽车缺陷在动物维持240天脚神经缺损修复了空自体静脉桥。相比之下,腿部损伤扩展的大腿出现90年和180年之间在动物的脚由相同类型的神经缺损修复自体静脉主干外生neurospheres填满。

3.2。肌电描记术

在手术之前,m .股四头肌的肌动电流图巨大的内部振幅显示4.9到6.1 mV和poststimulus延迟0.89到3.7 ms。手术后立即实现n cruralis物质损失,m .股四头肌的肌电图呈阴性实验动物,无论他们的静脉桥是否装满neurosphere已被停职。

在损伤后180天(25周),neurosphere-transplanted猪显示积极和m .股四头肌的肌动电流图0.6到0.9 mV振幅和0.96到2毫秒延迟,而对照组仍负面的肌动电流图(图2)。

在损伤后240天(34周),m .股四头肌的肌动电流图neurosphere-transplanted头猪被提高到2.8 - -3.1和2.4 - -2.5 mV振幅女士延迟,而肌动电流图的控制仍然是消极的(图2)。

3.3。原位Neurosphere移植猪细胞的命运

在第一个实验中,嫁接neurosphere细胞标记了在体外移植前BrdU合并。在后期静脉移植,免疫组织化学组BrdU-immunoreactive细胞被发现在静脉管(图3)。在手术后8天移植采样,其中大部分BrdU +细胞聚集在sphere-like总成(数字3(一个)和3 (c)),而有些稀疏的静脉内管(图3 (b))。大多数BrdU +细胞也免疫反应性的doublecortin(克莱斯勒)这是一个特殊的标记(图未成熟神经元4)。在手术后90天,BrdU +细胞内还观察到静脉管NeuN并显示免疫反应性,即神经元分化的标志(图5)。

8点在第二个实验中,扩大二级neurospheres DIV被LV-GFP彩色转染前收集和postlesional移植的猪神经差距。所有neurospheres GFP荧光标记显示在大多数,但不是全部,细胞(图1)。45、90、180或240天病变后,球体移植,每个vein-bridged和LV-GFP sphere-transplanted神经段显示许多GFP-fluorescent细胞被完全本地化的神经神经束内(数字6(一)和6 (b)用nontransplanted控制桥梁(数字)和缺席6 (c)和6 (d))。结合immunohistofluorescent标签NeuN或神经丝的nf - 68显示大部分的GFP荧光与这些神经元标记(数据7(一)-7(c))。相比之下,GFP荧光没有colocalize与胶质标记评估:s - 100 b(数字7(d) -7(f))、GFAP CNPase。

有趣的是,在180年和240年天后神经病变和GFP-expressing neurosphere移植,CNPase immunohistofluorescent标签远远高于vein-bridged损伤控制它没有收到neurosphere移植(图8)。两个的数量CNPase-immunoreactive许旺细胞过程和他们的标记强度高neurosphere-grafted神经比控制。通过光密度量化ImageJ软件,免疫组织化学CNPase neurosphere-grafted损伤神经的标签,在损伤后240天,达到276±100±2.9%金额的2%的损伤控制缺乏neurospheres;这种差异是显著的通过方差分析。

4所示。讨论

变性的远端轴突段轴索显微外科术和神经修复的挑战的结果是将残端连接到远端部分。长期神经的差距,这是一个种族之间的轴突再生和远端退化雪旺细胞的表型变化(24]。自体神经移植的黄金标准,但结果不令人满意15]。任何替代目前认为需要neuroguide,提供一个宽松的微环境,增加了轴突再生和保护支持细胞和远端轴突。干细胞已经被研究过,但分化主要是对支持细胞。神经干细胞已报告成为集成和提供新的移植后神经元在中枢神经系统与宽容的微环境25]。为了测试的效率,这种类型的移植postlesional修复周围神经,我们建立了一个成人的主要文化猪神经干细胞产生神经元在体外在我们以前的报告(27]。在目前的研究中,我们首次展示在成人移植的猪在体外preexpanded成人神经干细胞为周围神经间隙内静脉桥导致纵向对齐的神经元的起源和提高功能恢复。

4.1。方法论的注意事项

目前的实验协议的神经病变:于30毫米长神经物质去除,一直选择模仿长神经损伤的常见情况下人类的诊所。确实在这些情况下,无论受伤的是最初的类型(部分,撕裂粉碎),神经的手术正规化树桩对应于的典范。

自体移植静脉段一样已经建立了一个神经导管修复的一种有效的治疗神经差距小于3厘米(29日,30.];用于手手术(31日)在儿科(32]。在最近的一项研究[33],histomorphological考试部分的近端,,和远端修复区三个多月透露epineural疤痕少,神经外膜薄,更多的再生轴突和更少的组织中炎症细胞静脉移植,因为静脉移植提供了额外的机械和化学支持在神经再生的大小差异。一个小静脉移植物保持财产end-to-side neurorrhaphy [34),但规模差异的供体和受体神经和长度旁路的另一个问题是崩溃的风险。静脉桥接也给优秀的忽视导致二次修复损伤(35]。本协议是经常意识到在成年的猪,作为普遍运作外科医生的一个方便的培训体系。

目前postlesional细胞疗法尝试使用一个在体外扩大成人猪脑的主要文化neurospheres特征已广泛在一项研究27]。我们确实表明,目前协议的成年猪subventricular区采样和neurosphere试验允许净化和与无限的增殖潜能,保持真正的神经干细胞自我更新能力,能力生成所有神经细胞类型(27]。特别是,这些neurospheres从成人猪SVZ显示相同的神经元的比例(25%),星形胶质细胞(70%),和少突胶质细胞(5%)从各种成人neurospheres啮齿动物的大脑结构(36- - - - - -38]。

荧光血统的过程标识使用的接枝neurospheres GFP的慢病毒载体已被验证之前(28]。刚做好的慢病毒粒子被感染复数量化(MOI)决心使用常规病毒学家化验,neurosphere标签的优化。我们检查这个在体外成人猪neurospheres程序允许广泛的标签没有改变的细胞动力学。它允许后续识别移植细胞的后代原位仅仅通过组织荧光,这很容易使执行表型特征,免疫组织化学显示不同的荧光团。

4.2。功能恢复增强Vein-Guided Neurosphere移植

肌评价由损伤神经支配的肌肉证明我们的协议venous-graft-assisted neurosphere移植强烈提高功能恢复在损伤后6个月,比控制。我们后续histofluorescent提供公认的细胞学分析接枝ANSC-derived细胞的基质等积极影响。

同时,临床评价是基于一个简单的观察。脚神经把不足的部分弯曲的大腿池塘。唯一的恢复正常的步骤是观察到移植的动物。知道这个复苏的主要问题是必然会加速轴突再生或创建一个功能性中间神经搭桥。事实上我们有双重的观察神经元和轴突的再生主机。

4.3。神经移植的结果Neurospheres内静脉桥

在目前的细胞疗法的尝试,嫁接neurospheres产生了专门神经元后代无论postlesional延迟。这一结果引人注目,因为成人SVZ神经干细胞的神经元收益率达到只有25%的神经元在体外和75%的嗅觉通路在活的有机体内(25,37,39]。目前的在活的有机体内结果表明,静脉移植物移植neurospheres环境提供了一个有效的基础上更上一层楼。按照最近的示威活动,血管壁赞成从成年神经发生神经干细胞(38,40,41),一些啮齿动物模型中介导的血管endothelium-derived生长因子(VEGF) [42]。我们的研究结果表明,选择静脉主干和人造neuroguide神经桥梁因为固有特性是一个有趣的解决方案。此外,所有医生都能够对浅静脉静脉主干网络,这在紧急条件下比neurotubes便宜得多。同时,了解内皮细胞之间的相互作用机制,移植神经干细胞将允许进步发展的新的人工neurotubes。更普遍的是,局部组织微环境正式展示了行列式在表型stem-cell-derived子孙的命运:例如,nonneurogenic从成人脊髓神经干细胞生成神经元只,一旦移植到海马体(43]。

这些新成立的神经元存活在原移植后长时间延误,这表明他们已经成功地集成在切断神经。进一步,这些神经元perikarya的线性分布,损伤神经的纵轴平行,表明新的神经元可能是相互关联的多突触网络桥接lesional差距既存的神经纤维。这多突触网描述了神经干细胞移植后(44,45]这个解释还支持通过移植细胞集群的演化在时间内静脉移植,即从球形组件损伤后第一周稀疏细胞较长延迟的线性链状的继承。这样的结果出现分离的周围神经修复策略已经制定了到目前为止,包括在刺激远端神经轴突再生成结束或remyelination额外的雪旺细胞(24]。

目前的结果与以往使用不同种类的移植细胞,像fœtal神经干细胞,触发许旺细胞增殖的损伤周围神经(46),反过来促进myelinisation和间接再生(47]。此外,从产后小脑无限增殖C17.2细胞移植,这被证明是不同的神经干细胞(48),据报道引发肿瘤的形成在坐骨神经受伤的老鼠模型49]。成人神经干细胞细胞疗法特别相关的从这个观点,因为他们证明显示异常高的抗肿瘤发生和衰老50]。

4.4。可能新的神经元移植到周围神经的差距

有两种方法,移植神经元,或者移植干细胞具有神经元分化的潜能。对于初级神经元,背根神经元可以做好准备在体外和他们的轴突突破性成长(20.]。此外,神经组织工程构建包括纵向对齐的跨越两个神经元的轴突束的数量,镶嵌在胶原基质和PGA管插入44]证明了神经元生存在112天后手术修复大鼠坐骨神经的。但是只是研究大型动物允许神经缺陷的研究条件良好。

4.5。同种异体的移植的存活率很高

在我们的研究中,成年神经干细胞是准备在体外从另一个猪SVZ细胞移植后,没有免疫抑制治疗和外源的移植细胞被集成。同样的观察发现胚胎大鼠对成年大鼠坐骨神经祖细胞(44)和异种移植胚胎大鼠神经干细胞的成胶原蛋白兔面神经损伤模型的管道(51]。在这些尝试,移植细胞被扩大在体外移植前,就像在目前的研究中。

4.6。激活Neurosphere内在雪旺细胞的移植

移植细胞子代的表型鉴定显示,移植neurospheres生成没有直接许旺细胞,但他们触发这个细胞的数量和活动人口的增加与控制。CNPase +细胞沿着轴突再生但总是LV-GFP——观察。这一结果是符合一个以前的报告显示,静脉移植后喜欢雪旺细胞增殖神经病变(52]。然而,由于在本研究控制收到了neurosphere-devoid静脉移植,我们的研究结果表明,neurosphere促进雪旺细胞的细胞发出扩散性的信号。Neurospheres确实被证明在体外分泌神经营养因子(53,54]。

5。结论

目前的积极影响细胞疗法协议可以归因于创世纪和集成新的神经元内损伤神经和/或间接激活内在许旺细胞的人口。然而,许旺细胞激活之前显示移植后发生静脉段在没有神经干细胞在损伤神经。因此,本程序的具体好处是可能造成neurosphere移植,因此《创世纪》的新神经元内损伤神经。LV-GFP是证实移植细胞在长期研究提供一个很好的标志。新神经元的起源和主机许旺细胞增殖导致再生新的轴突神经束的主机长神经桥梁,和这个组织修复的功能是由肌电图展示了在相同的动物和诊所。大型动物,尤其是猪,允许修复和长期的研究与临床神经差距条件接近人类。这些结果没有添加细胞外基质或外在的生长因子。因此本研究提供了一个希望改善人类的诊所。

确认

这些研究被代表团支持法国军备总局(DGA、法国;格兰特REPAR项目,08年co205)。作者表达他们的感谢教授安妮Duittoz (INRA Tours-Nouzilly)宝贵建议成人猪脑的表型标记免疫组织化学。