红色的细胞的生成和特征从人类胚胎干细胞和诱导多能干细胞:概述gydF4y2Ba

文摘gydF4y2Ba

由于供需失衡的红细胞(红血球),特别是对于alloimmunized患者或患者罕见血液表型,广泛的研究已经完成生成治疗大量的成熟的红细胞表面从各种来源的造血干细胞,如骨髓、外周血、脐带血。自从人类胚胎干细胞(为)和诱导多能干细胞(万能)在体外能够一直维持下去,它们代表了潜在的无穷无尽的donor-free红血球的来源。相比其他体外stem-cell-derived细胞治疗,肿瘤发生并不是一个问题,因为红细胞表面可以辐射没有显著影响体内的功能。在这里,我们提供一个全面审查最近的出版物相关的生成和表征hESC——iPSC-derived红细胞细胞并讨论挑战之前遇到的最终实现临床使用这些细胞。gydF4y2Ba

1。介绍gydF4y2Ba

医学进步,特别是在血液学/肿瘤学和移植手术,以及整体老龄化,导致一个不断增长的需求为红细胞输血目前大约有五万加拿大皇家银行每年每百万人口集中的国家高标准的卫生保健。目前,独家源为这些志愿捐髓者,显然是谁一样受到社会变革作为接受者,也就是说,他们衰老。招聘新的捐助者的合格的个人挑战和减少另外受到越来越多的限制,主要为捐助者recipient-directed排除标准。缺乏安全的血液制品也在人群中是一个非常敏感的问题,特别是艾滋病毒的出现的年代,由于一代血友病患者感染。应对这些挑战的欲望导致了广泛的努力的一代体外红细胞(红血球)从各种各样的来源,如骨髓、外周血、脐带血。最近,利用胚胎干细胞(为)和诱导多能干细胞(万能)生成红细胞表面万能供血者一直设想[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

为多能干细胞是来源于囊胚的内细胞团gydF4y2Ba3gydF4y2Ba),和万能ESC-like细胞重编程体细胞产生的,通常通过强制表达的转录因子的结合,如Oct3/4 Nanog, KLF4,原癌基因,LIN28, SOX2 [gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。为和hiPSCs文化能够一直维持下去,可以诱导进行分化产生任何细胞类型的所有三个胚芽层。这些特征使他们不仅是一个有价值的工具,用于发育生物学的研究,但也提供一个潜在来源无限数量的细胞,细胞替代疗法。虽然我们实验室曾表明,当时的现有hESC行是不利于培养红细胞表面万能供血者(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba],许多额外的hESC线路已经生成。此外,最近的进步hiPSCs部分这个障碍进行削减,以生成hiPSCs从孟买人的红细胞表面缺乏ABH抗原表达由于缺乏H基因(FUT1)和分泌腺(FUT2)编码基因gydF4y2Ba1、2 fucosyltransferase活动(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。法国研究人员提出,基于他们的数据库,只有15 hiPSC克隆将覆盖100%的所有白人患者罕见的血液的需要在法国表型和基因型(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。此外,他们建议一个hiPSC克隆能满足73%的需求在alloimmunized镰状细胞病的患者来说,罕见的低温贮藏RBC单位要求(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。在这次审查中,我们总结的最近发展红细胞细胞的体外生成和特征为其或万能,并指出进一步研究领域需要使用之前用于临床。gydF4y2Ba

2。方法红细胞的生成细胞为,则gydF4y2Ba

为和hiPSCs代表可再生,潜在无限的细胞来源,与来自骨髓的造血干细胞、脐带血,或外周血,需要不断地获得,捐助者的体外代的红血球。自体的潜在魅力的上下文中hiPSCs红细胞生成细胞和收件人之间的相同的遗传同一性血型抗原,由于普遍的临床问题是polysensitization对外国红细胞抗原,这些病人的风险获取额外的抗体。几个实验室建立了协议获得为其和hiPSCs红细胞细胞。在技术细节而每个协议不同,他们通常可以分为两大类:那些coculture诱导造血干细胞与间质层分化,和那些文化干细胞悬浮形式拟胚体(EBs)(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。一个例外是最近的一份报告Salvagiotto同事绕开EBs和基质coculture利用基质蛋白生成2-dimentioinal文化系统支持从为造血细胞的生成和hiPSCs [gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

2.1。基质CoculturegydF4y2Ba

几种类型的基质层coculture系统已报告,包括小鼠骨髓(BM)细胞株肌力(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]和OP9 [gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba),卵黄囊内皮细胞系C166 [gydF4y2Ba9gydF4y2Ba),小鼠胎儿liver-derived基质线(mFLSC) [gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba),小鼠aorta-gonad-mesonephros (AGM)基质行gydF4y2Ba12gydF4y2Ba),主要从AGM和FL小鼠基质细胞gydF4y2Ba12gydF4y2BaFH-B-hTERT[],永生的人类胎儿肝肝细胞行gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba),而人类基质细胞主要来源于主动脉- AGM FL,胎儿BM (FBM) [gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。并排比较发现FH-B-hTERT细胞比肌力刺激CD34细胞更有效gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞从为代gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。直接接触基质层增加造血分化效率(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba),尽管它不是一种绝对的要求(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。一般来说,当培养基补充胎牛血清(的边后卫),不需要额外的生长因子在coculture [gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。相对纯红细胞生成大量的细胞,通常CD34的进一步净化gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba播种前细胞执行coculture人口在媒体补充红细胞扩张生长因子(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba),或coculture细胞的混合物放在甲基纤维素文化造血集落化验,然后提取单个红细胞殖民地从半固体的文化进行进一步分析gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。虽然这些研究提供了重要的见解的红细胞发展为hiPSCs和有潜在的大规模生产gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba),利用小鼠细胞coculture一些协议可能会使他们在未来不适合临床应用。gydF4y2Ba

2.2。EB形成gydF4y2Ba

另外,成功造血诱导可以通过EB的形成,通常通过将团为或hiPSCs nontissue culture-treated盘子,或超低附件盘子。据报道在鼠标EBs细胞进行自组织建立前后的极性和形成一个原始streak-like地区通过Wnt信号通路(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。健壮的造血分化,优质EB的形成是至关重要的。而陆等人观察到必须使用高质量的为以最小的分化和统一的干细胞标记表达式的迹象EBs形成和高效的红细胞生成(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba],Ungrin和他的同事们发现,聚集形成的细胞的数量水平最高的Oct4实际上表现出最稳定的EB形成(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba]。我们发现为其或hiPSCs培养小鼠胚胎成纤维细胞(MEF) feeder-free条件matrigel-coated MEF-conditioned媒体或化学定义媒体板块,如mTeSR(干细胞技术),还可用于EB形成,尽管他们更倾向于气质不一致的EB的形成原因不明(未发表的数据)。EB形成可以进一步控制电镀定义数量的细胞治疗U底部或V, 96 - 386 -孔板或AggreWells,迫使聚集形成的离心(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba]。因为被迫聚合定义为其或hiPSCs需要一代的单个细胞悬浊液聚合之前,我们发现添加p160-Rho-associated卷曲螺旋激酶(岩石)抑制剂y - 27632之前和期间的第一个24小时内EB形成对这些干细胞的生存至关重要,与先前的报告相一致(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。然而,尽管迫使聚合导致均匀大小的EBs,它已经表明,事实上,把团的传统悬浮培养为其直接进入low-attachment板块产生EBs造血分化水平较高的比强迫聚合或悬滴文化(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。不管EB的形成方法,重要的是要注意,应该小心避免个人EBs积极迁移的细胞之间的融合和转录因子的表达Cd×2,闻名的作用影响细胞命运的决定(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba),已观察到细胞融合EBs交界处的一个子集(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba]。虽然住房个人EBs在不同井可以防止聚合,不推荐,EBs的旁分泌增强造血分化的影响gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。封装尺寸的琼脂糖胶囊(gydF4y2Ba35gydF4y2Ba)可能提供一个选择,尽管封装EBs的造血分化尚未完全检查。gydF4y2Ba

媒体被用于数组EBs的一代。我们实验室经常使用媒介本质上由Iscove修改杜尔贝科的媒体、胎牛血清(的边后卫)和无蛋白杂种细胞介质。最初,我们包括基本的纤维母细胞生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF)在中gydF4y2Ba17gydF4y2Ba),后来发现他们是不必要的FBS-supplemented媒体,尽管vegf - 165 EB(形成期间增加红细胞生成报告gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。很多具体的边后卫在造血分化的影响已注意到EB的形成,因此需要预先筛分的边后卫的EB化验(未发表的观察)。几个实验室建立了血清媒体的EB的形成,生长因子的补充是必需的(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。骨形态发生蛋白4 (BMP4)、VEGF、粒细胞集落刺激因子(g - csf) interleukin-3 (IL-3)干细胞因子(SCF), Flt3配体,il - 6,胰岛素样生长因子2 (IGF-II),促血小板生成素(TPO)和bFGF用于各式各样的组合来实现诱导造血分化EBs (gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba,gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]。最近出版利用人血浆发现BMP4和VEGF是不可或缺的,一致的发现田和他的同事们(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,包含自洽场、传真照片,Flt3配体,促红细胞生成素(EPO), IL-3, il - 6在EB介质提供最佳的红血球生成的刺激(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

2.3。从EBs红细胞细胞gydF4y2Ba

不同的实验室收获EBs在不同时间点进行进一步的红细胞分化。我们的最初协议包括红细胞诱导的贴壁培养步骤,但后来流线型播种的第七天EBs直接进入无血清红细胞诱导培养基中大量的相对纯红细胞细胞(> 90%)可以获得总文化时间的21天(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。我们发现促红细胞生成素和自洽场绝对是需要在EBs红细胞祖细胞的存活和分化;IL-3和il - 6增加红细胞细胞的扩张,但是g - csf和gm - csf可有可无的(未发表的数据),类似于他人的结论(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。如果添加的边后卫具有显著的抑制作用在这些红色的祖细胞的增长和扩张EBs,如前所述,Zambidis et al。gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。此外,虽然分离第七天EBs产生几乎完全红细胞细胞无血清培养系统(> 90%),红细胞诱导介质,第14天EBs生成红细胞和髓细胞的混合物gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。有趣的是,虽然gydF4y2Ba~gydF4y2Ba5 - 10%的细胞hESC线H1-derived EBs表达glycophorin-A FBS-based系统[7和14天之间gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba),很少glycophorin-A表达检测,H1-derived EBs 20天的人类plasma-based文化尽管补充造血细胞因子在中(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。文化的差异时间和细胞因子补充剂,但Lapillonne unpurified等人也发现,从人类分离EBs plasma-based文化时只生成红细胞细胞放置在一个红色的扩张中,还包含人类血浆。鲁和他的同事们采取一种不同的方法将分离天- 3.5 EBs blast-colony增长媒体bFGF和tPTD-HoxB4重组融合蛋白转移到一个之前扩大hemangioblasts红细胞分化和扩张的文化gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。红细胞和nonerythroid细胞显然是得到了,这需要一个一夜之间消除nonerythroid细胞粘附文化。gydF4y2Ba

2.4。从成红血球细胞红细胞表面gydF4y2Ba

延长细胞体外传播与收购相关的基因改变,包括转换。安全担忧体内使用这种细胞因此提高了,特别是在自体设置。终末分化(和生理上阐明)细胞,在这方面,红细胞具有相当大的优势移植未成熟的细胞或细胞的增殖能力,尽管他们的成熟度,如T细胞。几项研究表明,hESC——hiPSC-derived成红血球细胞能够摘出术,成为完全成熟的红细胞表面。长期的文化似乎是一个重要因素有或没有基质细胞的参与。,和他的同事们发现摘出术可获得CD34的连续曝光gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞分类从FH-B-hTERT / H1 coculture两组细胞因子,其次是一个两步10天coculture MS-5基质细胞(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。去核效率从1.5%变化到16% day-35 H1 / FH-B-hTERT coculture,和0%的第14天H1 / FH-B-hTERT coculture。3步文化涉及到15天coculture H1 / mFLSC coculture,紧随其后的是一个14天红细胞集落形成,然后7天液体培养扩张也生产集群无核红细胞表面的去核效率从1.3%到11.4%不等(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。更高程度的摘出术是通过陆等人与他们hemangioblasts协议由EB形成,hemangioblast扩张,连续的细胞因子暴露的细胞,然后与人类间充质干细胞(msc), coculture OP9鼠标基质细胞,或没有基质细胞(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。去核效率10% - -30%无基质细胞,gydF4y2Ba~gydF4y2BaMSC基质细胞30%,30% -65% OP9细胞,表明基质细胞的存在大大促进了摘出术的过程。另一方面,Lapillonne和他的同事们最近的一项发现表明,通过与人血浆补充培养基,摘出术的一个重要程度达到无基质细胞在H1 hESCs-derived红细胞细胞(52% - -66%)gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。然而,更低程度的摘出术(4% - -10%)与红细胞细胞得到来自2单独hiPSC线使用相同的协议,这表明重组过程或表观遗传记忆留存,可能影响的能力hiPSC-derived红细胞细胞阐明。考虑到目前仍不完整的去核效率成红血球细胞和不完整的谱系测定体外,如果这些体外红细胞生成细胞用于输血,这可能是合理的过滤通过常规白细胞过滤器,与3000 cGy,其次是辐照红细胞容忍辐照没有关键功能丧失。gydF4y2Ba

2.5。大规模生产的红细胞表面成红血球细胞或为其或hiPSCsgydF4y2Ba

一些出版物已经声称,他们各自的协议导致大规模的一代又一代的红细胞细胞为其或hiPSCs,这是一个先决条件的任何潜在的临床使用。H1 / FH-B-hTERT coculture系统,秋等人获得大约80红细胞细胞/ hESC尽管据估计,50×10gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba是通过一个单一的CD34倍扩张gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞从coculture [gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。使用H1 / mFLSC coculture,马和同事产生大量红细胞破裂组成的gydF4y2Ba~gydF4y2Ba0.2×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba红色的细胞/破裂(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。考虑到集落形成单位频率和进一步扩张潜力在液体培养,大约1200每hESC红细胞细胞生成。略高生产效率的实现是通过使用EB形成和人血浆补充显示1500 - 3500每hESC红细胞细胞产生,但只有200 - 400每hiPSC红细胞输出(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。使用tPTD-HoxB4重组融合蛋白和hemangioblast方法,鲁和他的同事们报道了一代的8000每hESC红细胞细胞(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。最高生产效率报告,迪亚斯和他的同事们雇佣OP9 coculture系统,其次是离解和reaggregation低依恋板块的细胞因子,然后coculture MS-5喂食器(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。200000每hESC红细胞细胞生成报告,和一个类似水平的扩张也获得hiPSCs,尽管小鼠细胞的要求coculture整个分化过程,除了大大延长培养时间(70 - 120天),仍然是一个挫折的潜在临床应用。这些数据表明,在没有重大进展从为其生成红细胞或hiPSCs更有效成本,成本的大小和更换donor-derived与这些体外红细胞生成的红细胞表面将被禁止,因为一个加拿大皇家银行集中包含大约2×10gydF4y2Ba^12gydF4y2Ba红细胞,也就是说,在一个像德国这样的国家,8×10gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba(10gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba人口的人均)红细胞输血在任何一年。gydF4y2Ba

3所示。描述hESC——hiPSC-Derived红细胞细胞gydF4y2Ba

3.1。球蛋白链表达gydF4y2Ba

在所有erythroid-associated特点,球蛋白表达表型研究最广泛hESC, hiPSC-derived红细胞细胞。我们实验室发现的gydF4y2Ba球蛋白,而不是胚胎gydF4y2BaζgydF4y2Ba球蛋白,是主要的gydF4y2Ba轨迹球蛋白表示,尽管表达gydF4y2BaζgydF4y2Ba球蛋白可以从H1 hESC所有红色的细胞中发现的蛋白质水平,表明低,但pancellular胚胎的表情gydF4y2BaζgydF4y2Ba球蛋白(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba),不同于Cerdan等人的发现显示gydF4y2BaζgydF4y2Ba球蛋白表达的不是hESC-derived成红血球细胞(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。的表达gydF4y2BaζgydF4y2Ba球蛋白也证实了研究红细胞细胞产生其他hESC线以及H1线(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba],hiPSCs起源于胚胎或成人组织(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。我们找到了gydF4y2Ba/gydF4y2BaζgydF4y2Ba球蛋白比例不会改变红细胞细胞是否来自第七天、第14天EBs (gydF4y2Ba17gydF4y2Ba裘),虽然和他的同事们发现,通过扩展coculture间隔时间为和人类胎儿肝肝细胞永生化线FH-B-hTERT从14天到35天,血统切换和这些hESCs-derived红细胞细胞表达gydF4y2Ba轨迹球蛋白增加gydF4y2Ba/gydF4y2BaζgydF4y2Ba球蛋白比例(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。此外,个体克隆红细胞扩张和成熟显然是伴随着一个成熟开关,其特征是越来越gydF4y2Ba/gydF4y2BaζgydF4y2Ba球蛋白比例随着时间的推移hESC-derived红细胞细胞从原红细胞的阶段的阶段正色的成红血球细胞(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

除了前两个研究造血/ hESC宣称成人红细胞分化gydF4y2Ba球蛋白是主要表达的球蛋白hESC-derived红细胞细胞(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba),所有其他研究发现胚胎gydF4y2Ba和胎儿gydF4y2Ba球蛋白是主要的gydF4y2Ba轨迹球蛋白表达的这些细胞,至少在最初阶段,无论微分方法或hiPSCs的个体发育的起源gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。虽然一些研究发现小的变化gydF4y2Ba/gydF4y2Ba比成熟的红细胞细胞来源于不同文化的时间点(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba),秋等人报道,类似于他们的发现变化gydF4y2Ba/gydF4y2BaζgydF4y2Ba球蛋白比例,增加coculture时间也会导致红细胞的生成主要胎儿细胞表达gydF4y2Ba球蛋白(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。成人的增加gydF4y2Ba球蛋白表达随着时间延长coculture也观察到尽管其表达水平很低(gydF4y2Ba~gydF4y2Ba2%的gydF4y2Ba轨迹球蛋白),与他人的研究结果一致(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。有趣的是,马等人表现出更多的急剧增加gydF4y2Ba球蛋白表达与红细胞细胞来源于H1 / coculture mFLSC细胞。球蛋白表达个人的红细胞细胞克隆改变时间的方式:胚胎gydF4y2BaεgydF4y2Ba-globin-expressing红细胞从个体克隆细胞减少gydF4y2Ba~gydF4y2Ba100%,至gydF4y2Ba~gydF4y2Ba50%,而成人型gydF4y2Ba-globin-expressing细胞增加~ 100%在所有克隆研究gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。然而,尚不清楚是否成年人gydF4y2Ba球蛋白是主要的gydF4y2Ba轨迹球蛋白表示,考虑到100%的细胞也表达gydF4y2Ba球蛋白,gydF4y2Ba~gydF4y2Ba50%的细胞表达gydF4y2BaεgydF4y2Ba球蛋白。然而,这些研究提供支持的证据,在长期coculture,和/或延长红细胞扩张,红细胞细胞适应发展先进的球蛋白表达模式。gydF4y2Ba

球蛋白表达的转录控制尚未研究这些细胞,但数量有限的研究已经完成分析的表观遗传景观gydF4y2Ba球蛋白的轨迹hESC-derived红细胞细胞。发现DNA域hypomethylation跨越数千个碱基对的域内建立了乙酰化组蛋白在最高度表达基因在每个发展阶段当比较hESC-derived成红血球细胞无教养的FL和骨髓细胞(gydF4y2Ba38gydF4y2Ba,gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]。此外,我们实验室还发现,在发展,人类主要成红血球细胞采用相似的组蛋白密码包括H3K4me3浓缩和选择性H3K27me1损耗,以确保适当的时态表达特定的球蛋白基因(未发表的数据)。此外,也在发挥循环机制的高度敏感网站LCR物理接触gydF4y2Ba球蛋白启动子,大概是为了启动转录通过积极的形成染色质中心,gydF4y2Ba球蛋白产生hESC-derived红细胞细胞。gydF4y2Ba

3.2。血红蛋白分析和功能gydF4y2Ba

球蛋白链相比,很少有研究进行研究的血红蛋白四聚体hESC——或者hiPSC-derived红细胞细胞。使用CE-HPLC,发现成熟的红细胞细胞,来源于为和万能基于人类血浆EB /文化系统,表达主要住宅(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba2)与小Hb高尔半岛我(gydF4y2BaζgydF4y2Ba2gydF4y2Ba2)或高尔半岛二世(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba2)(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。此外,CO-rebinding动力学,探针R和T的变构均衡状态,hESC——hiPSC-derived红细胞血红蛋白的细胞,几乎完全相同的脐带血,有或没有的别构效应肌醇hexaphosphate,表明住宅在这些红色的细胞功能(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。此外,氧解离曲线hESC-derived红细胞细胞是流离失所的左边,类似于人类脐带血,相比成人红细胞表面,符合住宅对氧亲和力高于HbA (gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。减少响应,3-diphosphoglycerate (2, 3-DPG)损耗比成人红细胞表面符合住宅和2之间缺乏互动,3-DPG [gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。此外,hESC-derived红细胞细胞也有高glucose-6-phosphate脱氢酶活性,证实它们免受氧化损伤(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。在一起,这些数据表明hESC——hiPSC-derived红细胞细胞将函数作为氧载体脐带血或胎儿的血液。相比之下,最近的一项研究使用hemangioblast方法表明hESC-derived红细胞细胞产生主要Hb Gower1 (gydF4y2BaζgydF4y2Ba2gydF4y2Ba2)与低水平的住宅,Hb波特兰(gydF4y2BaζgydF4y2Ba2gydF4y2Ba2)、Hb Gower-2 (gydF4y2Ba2gydF4y2Ba2),每个代表总数的不到5%血红蛋白(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。此外,这些hemangioblast-derived红细胞细胞也有升高的Hb巴(gydF4y2Ba^GgydF4y2Ba 4)血红蛋白总量的-18%,占12%。Hb Barts有极高的亲和力氧气,这个发现似乎与以前的报告由同一组hESC-derived红细胞细胞只有一个氧解离曲线略流离失所的左边的成人红细胞表面,并显示一个类似玻尔效应在生理pH值(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。除了不释放氧气到组织由于极高的氧亲和力,Hb巴特斯是一般不溶性,因此在红细胞积累。因此,本研究认为hESC-derived红细胞细胞,尽管大规模生产使用hemangioblast协议(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba),不能用于输血。作者做报价,进一步成熟,导致发展更先进的成红血球细胞或无核的红血球,巴兹医院Hb水平可能会减少在这些hESC-derived红细胞细胞。gydF4y2Ba

4所示。未来的挑战gydF4y2Ba

的大小和成本取代donor-derived与体外红细胞生成的红细胞表面是禁止的,需要重大进展的扩张,成熟,和终端分化/摘出术的红细胞输血产品成本效益。最近发表的方法培养为悬架和hiPSCs可能帮助为其扩大生产规模和hiPSCs [gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]。此外,提出了利用合成3 d结构模仿骨髓结构(gydF4y2Ba41gydF4y2Ba)和转录的操作环境,如异位表达工程Nup98-HoxA10融合蛋白(gydF4y2Ba42gydF4y2BamicroRNAs-126/125 *(差别),对这些gydF4y2Ba43gydF4y2Ba),可改善红细胞生产效率。gydF4y2Ba

然而,即使一个具有成本效益的方法从为其生成红细胞或hiPSCs实现,重大挑战有待见过这些细胞的治疗用途。虽然不是表达HLA,成熟红细胞表面表达许多表面抗原对常规(出现在所有个人不表达抗原)或不规则(后获得接触抗原)抗体可以直接。三十血型系统或抗原的家庭,几乎400抗原被记录,描述了所有这些抗原的抗体。如果忽视,这种抗体引起急性,可能致命,或者推迟溶血性输血反应。因此,这种抗体的存在需要选择前的红血球。自抗原表达的基因位于整个基因组,血型抗原可能发生的任何组合,因此从理论上讲,一个几乎无限数量的hESC或iPSC行必须为所有个人生成兼容的红细胞。代零变异的血型抗原通过基因操纵不利于零变异已经描述了许多血型抗原,但所有相关的结构性缺陷和/或代替代抗原,除了Rh dd(阴性,零代表变体柜台抗原Rh D)和O(没有A和B都转移酶)。可能是概念上合理生成单个hiPSC行从一个O Rh - ccddee K -捐赠杂合的尽可能多的抗原(减少外国抗原剂量和因此,抗原性)和传播在巨大biogenerators来源没有免疫的病人。喂——(聚)敏化或面临风险,长期transfusion-dependent患者,特别是那些罕见的血型,自体iPSC线可以建立,从个性化的红细胞生成和存储。然而,必须要强调的,红细胞表面的膜蛋白和糖基化产生了体外,甚至从自体iPSC行,可能会改变体内红细胞表面产生的相比,由于缺少发现体内的复杂环境中,或一个不平衡的转录因子表达(gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]。重要的发现和他们的后代被拒绝在自体的细胞则设置(gydF4y2Ba45gydF4y2Ba)适当的前沿抗原性的问题带来了体外生成的细胞由于neoantigens表达式。它可能是合理的酶去除表面抗原。然而,这些方法没有实现除了A和B物质(gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

此外,严格的研究必须充分描述这些体外红细胞表面包括膜表面生成潜力,柔软,体内半衰期,除了分析他们的血红蛋白包装、气体交换特性,和免疫原性。系统的灵敏度也说明了最近的证据表明,出来效果的治疗benefit-free衰老红细胞的血红蛋白,膜刚度增加,膜损伤,和改变OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba的亲和力红细胞存储都涉及不良结果观察与老红细胞(gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]。因此,即使所有的挑战设计合适的体外系统扩张,红细胞的成熟和终端分化/摘出术已经掌握了原始细胞来源,所有这些生物物理参数相比仍然需要小心地在体外和体内红细胞生成之前就可以用于临床。gydF4y2Ba

5。结论gydF4y2Ba

已经取得了显著的进展在从为其生成红细胞细胞和hiPSCs。生产效率高达200000细胞/ hESC或iPSC取得gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。不幸的是,这个方法能产生最多的红细胞细胞每hESC至少定义和严重依赖小鼠基质细胞的存在:首先OP9,然后MS-5。血红蛋白表达模式和去核效率也不太清楚与红细胞细胞来源于这个特定的方法,比从其他大规模生产协议(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。进一步调查的血红蛋白四聚物成分是至关重要的,因为它是显示红色的细胞产生的协议与第二高的生产效率(8000每hESC红细胞细胞)大多Hb高尔半岛我,其次是Hb Barts升高,不会适合输血(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。Lapillonne和他的同事们提出的方法,不使用动物产品或基质细胞系,产生温和的红细胞细胞数量为(1500 - 3500每hESC红细胞细胞),阐明有效(gydF4y2Ba~gydF4y2Ba60%)与功能住宅四聚体作为主要的血红蛋白(gydF4y2Ba~gydF4y2Ba93%)。不幸的是,这种方法似乎与hiPSC少工作有效,这非常重要,因为生成红细胞表面的主要目标之一是对患者的输血需求罕见血液表型或那些alloimmunized。红细胞生成的减少效率可能会抵消试销hiPSC线和红细胞分化倾向增加,随着两线间变异记录(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba),或通过增加输入hiPSCs的数量。另外,生成不朽的红细胞祖线终端分化和摘出术的能力,已被证明是成功的在小鼠ESC-derived细胞(gydF4y2Ba48gydF4y2Ba),可能是一个可行的选择。最后,对这些hESC——和hiPSC-derived红细胞细胞其他比他们的血红蛋白组成、气体交换特性,及其增长和扩张模式,以应对各种方法。薄膜成分、表面抗原表达,免疫原性,可变形性,体内半衰期都需要进一步和有力的调查之前,会发生从基础研究到临床应用的过渡。gydF4y2Ba

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