派生的两个新人类胚胎从不能存活的人类胚胎干细胞系

文摘

我们报告的推导和描述两个新人类胚胎干细胞(hESC)线(CU1和忍耐力)从胚胎集成机体功能的不可逆损失。此外,我们回顾性分析了形态发展的数据从胚胎(ED) 5天2480年ED6胚胎不适合临床应用评估分级标准ED5亦失去生存能力的指标。我们的分析表明,很大比例在体外受精胚胎不适合临床使用可用于hESC推导。基于这些研究结果相结合,我们建议标准常用在体外受精诊所来确定最佳胚胎的子宫转移可以用来预测潜在的hESC派生从质量差没有至关重要的人类胚胎的破坏胚胎。

1。介绍

人类胚胎干细胞(为其最终的模型在体外研究细胞生长和分化和再生医学中最有希望的候选细胞疗法由于其高增殖能力和分化成血统的能力这三个胚胎胚芽层(1]。为正在迅速成为有价值的药物毒性筛选平台和工具,用于药物发现2- - - - - -4]。

最近的进步一代的诱导多能干细胞(iPS)细胞(5- - - - - -8)重点从hESC转向“诱导多能性”细胞作为临床使用的更可能的候选人,因为他们有可能生成特定的治疗,避免不必要的免疫反应在宿主(5]。然而,在最近的一项研究中发展的问题等价hESC与人类“诱导多能性”细胞之间。使用基因表达分析,表明尽管hESC和人类“诱导多能性”细胞多能性标记,他们的签名不同的表达9]。这是未解决的一小部分基因是否差异表达可能导致一个生物学上的显著差异5,10]。重要的是,最近的两项研究表明,“诱导多能性”细胞保留一个后生记忆有关的细胞来源,限制其分化潜力(11,12]。虽然“诱导多能性”细胞技术似乎非常有前途的途径将干细胞疗法的床边,继续学习hESC是很重要的,因为很难预测是否hESC iPS细胞治疗应用程序将会更加有效。

hESC行是传统来源于内细胞团(ICM)的可行的人类早期胚胎。我们小组提出了若干策略之一的推导hESC没有可行的胚胎的破坏(13]。在常规在体外受精过程,胚胎不能正常发育的一大部分14- - - - - -16)和被丢弃,因为他们不适合胚胎移植(17,18]。我们和其他人发现,这些胚胎遭受集成机体功能的不可逆损失,他们在此基础上定义为不能存活的或organismically死(19,20.]。在我们的研究中,这种ED6胚胎没有进展在扩展在体外文化虽然有超过80%的含有活细胞所评估的使用至关重要的染料(20.]。因此,我们建议hESC行可能源于这些不能存活的胚胎和表明,道德准则基本器官捐赠可以用于临床应用这种模式的13,20.- - - - - -22]。到目前为止,两组已经成功hESC来自胚胎质量低劣,被我们的标准不能存活的。在第一个报告,一个单一的、稳定的hESC线源自132年逮捕胚胎(23),第二,11个来自413行质量差胚胎拒绝为临床使用(24]。所有12 hESC行karyotypically正常和多能性及其分化潜力了在体外和在活的有机体内。

我们的目标都是第一个扩展这项工作通过派生新的hESC线从废弃,不能存活的胚胎在ED6其次定义形态标准nonviability一天前,ED5,为了让前面的推导hESC当更多的可行的细胞可能会出现。在这里,我们描述了两个新的hESC行来源于不能存活的ED6胚胎和回顾性研究确定不能存活的一个工作小组,形成空洞的胚胎有可能产生hESC线。推导出来的目标,努力在这个小组,推导成功率可能会增加。

2。材料和方法

2.1。给料机细胞和培养基

商业辐照CF1小鼠胚胎成纤维细胞(mef)(位于马里兰州Rockville全球干细胞)镀0.1%明胶(西格玛奥德里奇,密苏里州圣路易斯)涂4菜(NUNC,罗彻斯特,纽约)150000细胞。MEF培养在MEF媒体组成的DMEM(表达载体,卡尔斯巴德,CA), 10%的边后卫(Hyclone,洛根,UT), 100毫米谷酰胺(表达载体),和1%的青霉素和链霉素(表达载体)。

hESC推导媒体由淘汰赛的DMEM(表达载体),17%击倒血清替代(KSR,英杰公司)与3%的边后卫(Hyclone), 10 ng / mL bFGF(表达载体),100年μM beta-mercaptoethanol(表达载体),100毫米不必要的氨基酸(表达载体),1毫米谷酰胺(表达载体),和1%的青霉素和链霉素(表达载体)。为培养在同一媒体除了KSR 20%, 20 ng / mL bFGF,没有的边后卫。奎因的消息灵通的介质(Q-HEPES)和奎因的优势蛋白+囊胚中(QBlast)(从圣人媒体,库珀手术,帕萨迪纳市,CA)被用于胚胎复苏或洗和短期文化,分别。

2.2。胚胎

获得批准的机构审查委员会(IRB)和胚胎哥伦比亚大学研究委员会收集不能存活的胚胎。产生的胚胎体外受精的目的用辅助生殖治疗不孕不育夫妇妇女生殖保健中心(CWRC)。所有胚胎在这项研究中,使用患者的书面同意前获得了体外受精程序和病人的记录被鉴定。病人同意研究被执行在所有不能存活的胚胎注定要被丢弃。总的来说,375年从87名患者被宣布不能存活的胚胎用于这项研究。只有胚胎会议标准nonviability hESC推导未遂。

所有患者接受常规控制与人类促性腺激素卵巢过度刺激卵泡生长发育的影响。摘取卵母细胞、受精和胚胎发展的评估由CWRC如前所述[20.]。6 (ED6)胚胎天,胚胎逮捕了通常被拒绝或未能分为临床CWRC实验室使用。他们被运到实验室如前所述20.)和用于hESC推导。

2.3。胚胎电镀和文化产物

胚胎复苏如前所述[20.),放置在20μL下降与QBlast文化。评估在执行阶段和brightfield光学确定形态类别(20.),为推导分流胚胎。推导未遂只是159年胚胎显示压实和/或空化的迹象。这些胚胎处理酸Tyrode(在)(σ)解决方案去透明带(ZP),清洗简单Q-HEPES和镀上菜肴的灭活mef hESC推导媒体,在37°C和孵化有限公司5%₂在空气中。媒体改变了每隔一天。postplating扩展显示hESC-like形态学观察2 - 14天。hESC行成功建立时,hESC推导媒体交换hESC防止自发分化培养基。最初的扩展和随后的建立使hESC线是由显微解剖(“剪切和粘贴”亚文化)。通常,每5 - 7天进行显微解剖;囊性和分化材料被和未分化的地区的殖民地被切成几块,收集的愿望和转移到新鲜的喂食器。

2.4。免疫荧光

hESC殖民地和坚持拟胚体固定在Formalin-Free固定剂(σ)或3.7%甲醛在PBS 20分钟,permeabilized 0.1% Triton PBS十分钟对于细胞内的污渍和屏蔽10%山羊/马血清45分钟。细胞被孵化主要抗体室温1小时,洗,孵化一个适当的二次抗体30分钟。洗后,细胞核被沾染了4,6-diamidino-2-phenylindole dilactate (DAPI英杰公司)2分钟,和文化观察荧光显微镜(IX81,奥林巴斯,中心山谷,PA)。Oct3/4抗体,特异性神经元beta-III微管蛋白(TuJ-1)抗体和山羊免疫球蛋白二次抗体来自研发系统(明尼阿波利斯、锰)。SSEA-4 Stage-specific胚胎antigen-3 (SSEA-3),肿瘤排斥抗原1-60 (TRA 1-60),交易1 - 81抗体,和鼠标免疫球蛋白/ IgM二级抗体来自Chemicon /微孔(Billerica, MA)。从DakoCytomation Alpha-1-fetoprotein(法新社)抗体(斯特鲁普、丹麦),和平滑肌肌动蛋白(SMA)抗体表达载体。

2.5。定量实时逆转录聚合酶链反应(存在)

总RNA提取hESC和拟胚体使用RNeasy mini-kits(试剂盒,瓦伦西亚,CA),其次是治疗DNase(表达载体)。总RNA reverse-transcribed六聚体与随机互补使用上标三世第一链合成系统(表达载体)。的表达POU5F1 / OCT4,SOX2,NANOG,BRACHYURY,法新社和PAX6是量化使用ABI棱镜7900实时系统(应用生物系统公司,培育城市,CA)和规范化的看家基因的表达glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase (GAPDH)。标准循环条件用于所有化验(TaqMan化学、应用生物系统公司)。引物序列的人类NANOG基因(25]5′-TGAGCTGGTTGCCTCATGTTAT-3′(正向引物),5′-GAAGGAAAAGTATCAAGAAATTGGGATA-3′(反向引物),5′-ATGCAGGCAACTCA-3′(FAM /荧光饮料标签MGB探针)(应用生物系统公司)。引物和探针POU5F1 / OCT4(Hs00742896_s1),SOX2(Hs00602736_s1),T / BRACHYURY(Hs00610080_m1),法新社(Hs00173490_m1),PAX6(Hs00240871_m1),GAPDH(4310884 e,维克/ TAMRA标记)从应用生物系统公司购买。

2.6。在体外分化分析

附近支流为所述microdissected,转移到不依从盘子中,可以区分身体胚状体形成自发的淘汰赛DMEM(表达载体),补充20%的边后卫(Hyclone), 100年μM beta-mercaptoethanol(表达载体),100毫米不必要的氨基酸(表达载体),1毫米谷酰胺(表达载体),和1%的青霉素和链霉素(表达载体)。拟胚体与媒体改变培养5周每周两次。对基因表达分析,拟胚体收获4天,8、14和21。免疫荧光,被转移到gelatin-coated拟胚体的玻璃培养皿中(MatTek,亚什兰,MA)后3周,培养另一个星期达到分化细胞产物。组织学,拟胚体收获5周后,用PBS,固定在3.7%甲醛在PBS,嵌在石蜡中。十μ米厚的部分是沾hematoxylin-eosin马森(他)或三色的。

2.7。在活的有机体内分化分析

一代的畸胎瘤、内容的两口井subconfluent 6-well菜(大约10⁵-10年⁶细胞)皮下注射/老鼠的脖子区域4 - 6周大SCID米色老鼠(哈伦,印第安纳波利斯)(每个实验组)。动物被触诊每周对肿瘤的发展。12到14周接受,怀疑是肿瘤移除,固定在4%多聚甲醛或Bouin固定剂的解决方案和嵌入式的石蜡。十μ米厚的部分是沾染了他,马森的三色的,或为免疫组织化学处理。涉及实验动物的实验都是在哥伦比亚大学批准的协议执行机构的动物保健和使用委员会。

2.8。核型分析

标准G-band核型分析是由哥伦比亚大学细胞遗传学实验室。

2.9。回顾ED5 / ED6数据

IRB批准,去除了识别信息的人类胚胎为体外受精检查生成的记录。从ED5形态发展到ED6回顾性分析在不适合临床使用的胚胎ED5 ED6,被重新评估。胚胎转移或低温贮藏ED5也包括在分析中。分析了胚胎大多是在组织文化中,因此从ED5形态分类和ED6队列人群进行比较。形态分类中使用的临床分级CWRC ED5和ED6度=退化(胚胎表现出明显的变性),破片=支离破碎,1 c =单细胞胚胎(1 c) MC =多单元的(含2个或更多的胚胎卵裂球有或没有细胞分裂),薪酬=胚胎显示出一些压实的迹象,EB =胚胎小腔,胚泡形成的第一个迹象,B =胚胎大腔和HB =孵化囊胚胚胎大腔和至少一个细胞通过ZP突出。所有胚胎类别B和HB,代表胚泡形成,给出了总体成绩的好,公平,或者贫穷,此外,内细胞团的质量(ICM)和滋养外胚层(TE)的等级从A到d这是依照美国生殖医学协会/部分辅助生殖技术囊胚评分系统,每标准CWRC实践。

3所示。结果

3.1。推导和表征的新hESC线

在我们之前的研究中,我们不能存活的分类ED6胚胎形态和生产总值(gdp)的基础上,确定重要的数量和每个胚胎中包含nonvital细胞(20.]。虽然形态分类一般在预测细胞数量有限的价值,更多的活细胞与空化,表明空化可能预测更大潜力hESC推导的成功。这是符合的一项研究,推导效率是降低cleavage-arrested胚胎比胚胎逮捕后空泡(26]。在初步实验(数据未显示),我们观察到的很少或没有附件当early-arrested mef镀不能存活的胚胎。因此不能存活的ED6胚胎筛选使用形态类别如前所述[20.),只有胚胎的迹象压实和/或空化没有或异常ICM(159/375)上镀mef尝试hESC推导。最初的胚胎发展观察mef电镀后从2到14天。总共83个胚胎了主要殖民地(p0);这些69年发展恶化之前,首先使,14第一段中幸存下来,三个幸存下来第二通道,和两个幸存第三通道,导致hESC线路CU1, CU2(图1)。CU1和忍耐力hESC殖民地显示典型的癌形态。核型分析核型正常女性CU1,通过9。忍耐力显示正常女性核型8通道(46,XX)与低水平的镶嵌性染色体18染色体(3/31细胞;补充图网上S1, doi: 10.4061 / 2011/765378)。自我更新能力是证明了成功传播hESC线超过30的段落。

描述CU1, CU2 hESC行显示特定hESC标记的存在的未分化状态25),如转录因子POU5F1 / OCT4、角质素表面抗原TRA-1-60和交易- 1 - 81,醣脂类抗原SSEA-4,以及缺乏醣脂类抗原SSEA1,通常表示hESC分化(图2和补充图2)。类似的细胞表面抗原的表达是以前CHB1线特征,指出建立从cleavage-arrested胚胎质量差(26]。实时定量rt - pcr用于评估基因的表达在未分化CU1, CU2 hESC线和分化拟胚体来自他们。CHB1行被用作控制比较基因表达水平在未分化hESC和有区别的拟胚体(图3)。实时定量rt - pcr分析表明类似的或更高的多能性基因的表达水平POU5F1/OCT4,NANOG,SOX2在未分化CU1和忍耐力细胞相比,未分化CHB1线(图3)。在分化成胚状体的身体,的表达POU5F1/OCT4,NANOG,SOX2表达下调,而分化的标志吗BRACHYURY(中层血统);阿尔法胎蛋白(法新社;内胚层的血统),PAX6(外胚层的血统)调节CU1和忍耐力hESC线(图3)。同样,差异化表达特异性神经元beta-III拟胚体微管蛋白(TUJ-1),法新社,平滑肌肌动蛋白(SMA)作为评估免疫荧光(图2和补充图2)。CU1和忍耐力行分化成衍生品的所有三个胚胎胚芽层在体外。CU1, CU2 hESC注入SCID米色老鼠(每个实验组),未发现明显的肿瘤从12到14周接受。怀疑肿瘤的分析揭示了存在蛰伏脂瘤(3 8)在注射部位出现的虽然没有畸胎瘤被确定在组织学检查(数据未显示)。

3.2。回顾性分析胚胎的发展

建立,不能存活的ED6胚胎产生hESC行保留能力,尽管在低频率,我们进行了回顾性图表分析胚胎的形态类别生成供临床使用。我们的目标是提高效率的早期识别(ED5) hESC推导的胚胎不进一步改善,但仍有能力产生hESC线。胚胎评分作为预测工具用于体外受精;这里我们比较胚胎在ED5分数成绩ED6形态学评估标准将表明nonviability ED5。我们分析和比较形态学分类从ED5 ED6队列人群因为胚胎在组织文化,而不是个人。从3554年开始的胚胎,446被转移或低温贮藏ED3和没有进一步分析的一部分。3108 ED5胚胎评估,628年被转移或低温贮藏(所有优质胚胎转移会议标准)(图4)。剩下的2480个胚胎被认为不适合临床使用ED5 ED6,被重新评估。在重新评估ED6, 192 transfer-quality胚胎冻存,而剩下的2288被丢弃的胚胎是不适合临床应用。其中,915被分级为囊胚孵化囊胚的传输质量,因此得到的成绩不是整体质量和ICM / TE(表质量1)。大多数这些胚胎被归入穷人的行列(898/915;> 99%),只有17/915(少于0.02%)在ED6分级或公平的质量一样好。因此,胚胎质量ED5高度与胚胎质量ED6表明ED5 nonviability可以建立标准。

4所示。讨论

在这项研究中,我们推导出两个新的hESC台词ED6不能存活的胚胎与整体推导为压实效率为1.25%(2/159)和/或形成空洞的胚胎。这是符合推导效率不能存活的之前报道,organismically胚胎死亡或质量差:0.75 - -2.66%。毫不奇怪,这些推导效率略低于推导成功率从可行的囊胚(6 - 50%取决于培养条件)27,28]。

证明CU1, CU2 hESC的行显示属性和分化成衍生品的所有三个胚胎胚芽层在体外。然而,分化在活的有机体内失败没有畸胎瘤是孤立的。这与先前的报道hESC行来源于不能存活的胚胎被证明产生差异化的组织在活的有机体内(23,26),但在协议与其他一些研究报道缺乏畸胎瘤形成或缺乏在活的有机体内行来源于胚胎分化的低质量(29日- - - - - -31日]。在我们的例子中,形成畸胎瘤的失败可能是由于技术上的限制或将是限制发展的潜力,虽然在体外分化研究将反对后者的解释。需要额外的调查以确定是否失败了在活的有机体内分化或较低的成功畸胎瘤的形成是一个属性hESC来源于不能存活的胚胎。然而,hESC行来源于逮捕不能存活的胚胎,包括这里展示特点和报道在体外分化潜能与hESC源自盈余可行的胚胎(23,26]。

异常分析报告在hESC经过长时间的文化中,经常涉及染色体12日17日和X以及其他染色体,包括染色体18日频率更低(32,33]。这些染色体异常被认为是自适应改变的结果发生的与长期的文化。低水平的镶嵌性染色体18中观察到的忍耐力可以出现在文化,而是因为它在细胞在早期通过数字,它也可以出现在胚胎用于推导出细胞系。尽管高水平的非整倍性可能会逮捕或异常的胚胎,这通常不是在hESC来源于他们(见[26];这项研究),这表明有胚胎正常的分析,或者至少包含一些细胞与正常核型形成胚胎,胚胎质量差。

推导的CU1,我们已经证明,质量差直流囊胚ED6可以保持他们产生hESC(图的能力1(一))。忍耐力行起源于质量差ED6胚胎与一个小空腔(图1 (b)),不是给ICM / TE质量分数。从我们之前的研究中,我们可以估计质量差形成空洞胚胎之间的5和64在ED6活细胞(20.]。在我们的回顾性分析,我们进一步关注定义标准发展逮捕ED5胚胎提高推导效率从不能存活的胚胎。我们的分析表明,只有一小部分的胚胎被认为不适合在ED5提高胚胎移植可转让的质量由ED6 (192/2480;7.7%)。这表明大多数胚胎可以被认为是不能存活的胚胎,如果单独培养,最低临床级可以确定ED5与ED6缺乏可行性。通过瞄准推导努力的子群不能存活的胚胎没有潜在的改进与扩展在体外文化又能产生hESC线,可以增加成功率。

我们发现,公布标准认为胚胎质量差很变量(31日,34- - - - - -37]这些报告缺少足够的信息得出的几个胚胎用于推导是否集成机体功能的不可逆损失。两项研究报告hESC派生从废弃第三天胚胎形态得分较低(34)或质量差的第三天胚胎(36],发育成胚泡后48小时内文化。最近,一个普遍的最小信息(MI)公约报告hESC推导提出了(38,39),用于研究分类质量差胚泡,随后获得17 hESC线(37]。然而,目前尚不清楚从乳沟17囊胚的胚胎培养48小时和解冻胚泡,从而从逮捕和剩余的胚胎。而胚胎的质量信息用于建立hESC线应该是现成的,这将是实际如果囊胚分级系统提出了MI公约包括整体胚胎质量分数如体外受精诊所使用的。信息质量的胚胎用于hESC推导将相关的最终治疗应用,患者可以充分了解源的细胞用于治疗。

总之,我们和两个新的hESC特征线来自丢弃,不能存活的ED6胚胎。我们回顾性研究表明,当前使用的评分系统可以用于不可逆转地逮捕了胚胎的早期识别适合hESC ED5推导。胚胎的特点可用于大规模推导hESC没有至关重要的人类胚胎的破坏。

5。结论

以前,我们提出的道德标准应用于重要的器官捐献可能会延长推导hESC行从胚胎集成机体功能的不可逆损失在常规生产在体外受精。这项研究显示了这样的可行性推导hESC行胚胎使用标准的分级系统的识别合适的胚胎。伦理性考量和当前立法气候使基因推导多样化替代来源hESC线用于研究和治疗。

确认

这项研究是由一个从纽约州NYSTAR奖,卫生部d·w·兰德里。d . Marolt是纽约干细胞Foundation-Stanley和菲奥娜Druckenmiller研究员。作者要感谢赵,e·瑟瑞娜和技术援助美国Mackie hESC文化和特性。

补充材料

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