人类胎儿肝:一个在体外红细胞生成的模型

文摘

我们先前描述红细胞表面的大规模生产不同来源的造血干细胞(hsc)。我们现在的努力是集中生产红细胞表面由于无限的干细胞来源。人类胚胎干细胞(ES)细胞或诱导多能干细胞(iPS)是自然的候选人。即使红血球生产从这些来源的证明已经完成,他们的放大能力是不够的输血申请日期。在这项工作中,我们的协议红细胞生产应用于HSC隔绝胎儿肝脏(FL)作为中间胚胎和成体干细胞来源。我们研究了红细胞的潜力FL-derived CD34⁺细胞。在这个在体外模型,成熟摘出术达到一个较低的水平相比,成人来源作为胚胎或iP的观察,但是,有趣的是,他们(i)显示一个戏剧性的在体外扩张(CB CD34相比100倍以上⁺)和(2)100%克隆效率造血祖化验后3天的红色的感应,相比10 - 15%对于成人CD34克隆效率⁺细胞。此项工作支持了我们这样一个想法,FL仍然是一个模型的研究并不是一个候选人体外红血球生产输血作为直接来源的干细胞,但可能有助于理解和加强等原始细胞的增殖能力胚胎干细胞或iPS。

1。介绍

细胞疗法的方法由生成的红细胞(cRBC)在体外放大后的干细胞(SC)有意义的上下文获取血液供应的长期困难。超过血液供应,人类干细胞的造血分化成红细胞具有重要的治疗意义,包括病毒脱毒生产单位或您表型进行输血。我们的团队建立了一个实验过程来繁殖在体外终端红细胞生成从成人造血干细胞(HSC)从不同来源(外周血(PB),骨髓(BM)和脐带血(CB)) (1,2]。这个协议,使用适当的细胞因子和一个特定的微环境(包括基质小鼠5级或间充质干细胞(MSC))在无血清培养基,允许HSC增殖和终端分化成熟和功能的阐明包含成人红细胞血红蛋白(2]。允许向的重大进步在体外红细胞表面的生产从不同来源在几年。然而,他们transfusional未来只会变成现实,如果我们能够在大规模生产功能性transfusable红血球。当然这将不仅需要适当的工业的概念工具,但也发现干细胞的最佳来源。到目前为止,最容易和HSC的增殖来源量化方面是脐带血(CB) [3]。

然而,这依赖于捐赠和细胞来源体外生产红细胞被限制为一个批次的生产系统,使用有限数量的HSC CB单元。这就是其局限性。

因此,我们目前工作的重点是建立条件产生红细胞使用永久和取之不尽的干细胞来源。人类胚胎干细胞或最近发现诱导多能干细胞(iPS) [4,5是自然的候选人。当其他球队,我们已经证明重组的可能性在体外红细胞生成从非常原始的干细胞(6- - - - - -13),我们是第一个报告的红细胞分化和成熟iPS行(从胎儿和成人成纤维细胞)为成熟无核的红细胞(4% 10% 52%到66%从人类ES细胞系(H1)),而合成功能性胎儿血红蛋白(9]。

原始细胞可以分化的示范在体外细胞类似于他们的自然对应为一个潜在的治疗应用程序的第一步。但仍然是一个主要问题为假设应用程序在输血:放大。的确,在我们的条件下,1 ES或iPS细胞能产生5000年或1000年加拿大皇家银行,分别,91)而CD34⁺从CB可以放弃红细胞表面(2]。这放大的关键困难ES或iPS任何团队尚未解决。

Rollini等人已经证明,胎儿肝脏(FL)可能是一个替代来源的HSC尽管有限的总细胞数/组织,由于其高增殖能力[14]。事实上,在开发过程中红细胞生成的网站迁移。它首先发生在卵黄囊和para-aortic地区。红细胞生成然后迁移到胎儿肝脏在8日和22周妊娠最后在大英博物馆(15]。在目前的工作我们调查CD34的能力⁺从人类FL细胞分离,中间一个个体发育的来源非常原始的细胞间(ES和iPS)和成人干细胞,扩大和分化成红细胞细胞谱系。

我们cocultured FL-derived CD34⁺细胞在一个在体外重组骨髓(BM)微环境。作为他的观察或iPS,只有一小部分红细胞细胞达到终端分化成成熟的红细胞(15%)。这几个红血球中几乎完全胎儿血红蛋白的蛋白质水平。然而,随着成人HSC相比,我们可以观察一个戏剧性的扩张FL-derived红细胞细胞CB CD34相比高出100倍⁺。

FL是另一种模型的相关理解机制都隐含在红细胞生成HSC的增殖和分化,可以作为一个模型对于其他分化途径。

2。材料和方法

2.1。胎儿肝脏

胎儿肝脏手术获得6流产胎儿(12 - 14周后闭经)后患者的知情同意。实验和程序都是符合法国卫生部的指导方针和法新社(de la Biomedecine。脂肪肝的收集和刷新后不到4个小时内通过一个70m过滤和保存在PBS / BSA 10% (v / v)(西格玛奥德里奇,里昂,法国)解决方案,直到CD34细胞immunomagnetic分离,最大延迟1小时内执行。

2.2。CD34细胞隔离

FL CD34⁺细胞被immunomagnetic孤立分离根据制造商的指导方针(Miltenyi生物技术,Bergisch格拉德巴赫,德国)。CD34⁺纯度被流式细胞术进行评估。

2.3。FL-Derived间充质干细胞(msc)

CD34 -分数被用于MSC代根据Doucet描述的技术et al。16]。简单地说,细胞密度板细胞/厘米²和培养alpha-MEM介质(生物产业、ATGC生物技术、噪声大,法国)补充5% (v / v) platelet-enriched等离子体溶解产物(PL)和2个国际单位/毫升肝素(罗氏诊断、巴塞尔、瑞士)。文化被喂以每3 - 4天新鲜培养基。在融合细胞被山肩/厘米²。有纤维母细胞生长形态。immunophenotyping 2通道后,细胞被评估,和他们的表型与msc、CD73⁺CD105,⁺,CD90⁺、CD45⁻。

2.4。代的红细胞体外

CD34⁺细胞无血清培养系统在三步过程如前所述[2)与血清的来源等一些修改或使用FL间充质干细胞(msc)为基质。CD34⁺在IMDM培养基培养细胞/毫升首次(生物产业,ATGC生物技术)补充人类AB等离子BSA为1%或1%,10g / mL胰岛素(σ),和120年g / mL iron-saturated人类转铁蛋白(σ)。在第一步(主/天),/毫升CD34⁺细胞培养的10⁻⁶氢化可的松(σ),100 ng / mL干细胞因子(SCF, Peprotech,纳伊苏尔塞纳河,法国),5 ng / mL IL-3(研发系统),和3个国际单位/毫升红细胞生成素(由Janssen-Cilag Eprex,请提供)。的细胞培养4天,一个卷四卷含有氢化可的松的新鲜培养基稀释,自洽场,IL-3,促红细胞生成素。在第二步(天8 - 10),这些细胞被山肩/毫升和cocultured附着基质层与促红细胞生成素在新鲜培养基补充。在第三步(10 - 18天)、细胞培养在新鲜中没有一个附着基质层细胞因子。文化是维持在37°C公司5%₂。粘附细胞层由要么MS-5基质细胞系(由k . Mori)或胎儿间充质基质细胞(msc)建立的CD34 -分数FL肝脏样本。

2.5。殖民地化验

粒细胞巨噬细胞克隆形成单位(CFU-GM),红细胞细胞克隆形成单位(CFU-E) Burst-Forming单位(BFU-E)和红细胞细胞克隆形成单位混合(CFU-Mix)化验在半固体的甲基纤维素中如前所述[17]。

2.6。流式细胞术分析

所有使用FACScalibur immunophenotyping分析流式细胞分析仪(美国新泽西州,正欲富兰克林湖)使用CellQuest Pro软件。Immunophenotyping胎儿msc进行以下抗体:FITC-conjugated anti-CD45(贝克曼库尔特,Imunotech Roissy在法国,法国),anti-CD105 (Serotec、Cergy圣克利斯朵夫、法国),PE-conjugated anti-CD90,和anti-CD73(美国Pharmingen-Becton迪金森富兰克林湖)。Immunophenotyping胎儿红细胞表面进行了以下抗体:FITC-conjugated anti-CD36和PE-conjugated anti-CD71(贝克曼库尔特,Imunotech)。Immunophenotyping胎儿单核细胞进行了以下抗体:FITC-conjugated anti-CD38 (DAKO、斯特鲁普、丹麦),anti-Glycophorin, anti-CD36, anti-CD71, anti-CD45, PE-conjugated anti-CD117, anti-CD33, anti-CD34, anti-CD2, anti-CD3, anti-CD8,(贝克曼Coulter-Imunotech) anti-CD19, anti-CD4, anti-CD14, anti-CD56(正)。适当的负控制(鼠标反无关控制)为每个流式细胞仪进行分析。

2.7。细胞和血红蛋白描述

血液染色
细胞分化是监控整个文化形态分析的细胞在cytocentrifugation和May-Grunwald-Giemsa(“万人迷”女友)染色。

血红蛋白分析
血红蛋白(Hb)合成的模式分析了高效液相色谱法(HPLC) (Biorad变体II, Biorad实验室,慕尼黑,德国)与高分辨率betathalassemia程序。

2.8。半定量的实时反向Transcriptase-Polymerase连锁反应(rt - pcr)

使用上述协议的红细胞分化,我们从CD34红细胞表面生成⁺从不同的个体发育的来源(即细胞分离。,from CB, BM, and FL) in order to compare the kinetics of the transcriptomic profile of genes known to be involved in erythroid differentiation (GATA-1, FOG 1, SOX6, GFI 1b, STAT5a, FOXO3a, and球蛋白链)。

总RNA制备从红细胞表面收集在不同时期的文化(天8、11、15、18)。使用试剂盒法提取RNA根据制造商的指示(表达载体、佩斯利、苏格兰)。1克DNase-treated RNA转录成cDNA使用200单位的上标二世逆转录酶(表达载体)和150 ng的随机引物(表达载体)。由此产生的cDNA整除,以避免重复冻结/解冻周期。使用ABI棱镜7700序列执行实时PCR检测系统(美国应用生物系统公司,加州福斯特城)。18岁基因作为内部参考。所有的引物和探针来自应用生物系统公司。

其他基因放大使用SYBRgreen化学,GAPDH基因作为内部参考。比利时列日从Eurogentech引物都是()。

为化学反应,PCR进行重复使用TaqMan主混合或SYBR绿色主混合10 ng cDNA和300海里的引物在最后一卷25l . 2分钟孵化后50°C, AmpliTaq黄金在95°C激活10分钟的孵化。总共40放大周期运行的退火温度60°C。校准曲线建立了检查PCR效率相似目标基因和引用。给定目标基因的相对表达的方法(18),代表未知样本的差异(天8、11、15、18文化)和控制(第0天文化)目标基因规范化控制基因(18岁或GAPDH)。本计算方法适用于研究基因表达水平的生理变化。

3所示。结果

从FL-derived CD34⁺细胞中,我们使用一个三步刺激协议。首先,细胞增殖和红细胞分化诱导干细胞因子(SCF), interleukin-3 (IL3)和促红细胞生成素(Epo)。其次,细胞与其他促红细胞生成素cocultured独自一个在体外重组BM微环境(人类胎儿MSC或小鼠基质细胞系)5级。在第三个步骤中,所有的外生因素被撤回,细胞培养基质。

3.1。从FL-Derived大规模扩张和承诺的人类红细胞细胞CD34⁺细胞

在FL人口开始,细胞涂片检查表明,大多数属于红色的血统,50%以上被原红细胞。流式细胞术分析,大多数细胞表达的标记红色的血统(69%双阳性CD235a / CD36 74%, CD235a / CD71),和是CD34⁺/ CD38⁻HSC。其他细胞属于髓系血统而未发现淋巴B和T细胞(表1)。后CD34⁺immunomagnetic分离,我们获得了纯度超过90%。三步协议导致CD34的急剧放大⁺干细胞的倍的六种不同的肝脏样本)(平均18天。这个放大代表1或2日志更高的扩张与CB (倍,)和BM (倍,)细胞,分别(图1)。

一个大的发展,几乎纯红细胞细胞群可以归因于优先生成红细胞的祖细胞增殖及其随后的分化和成熟。3天,100%的细胞被单独使用,大多数属于红色的血统(CFU-GM CFU-E BFU-E 44%, 7%, 33%和16% CFU-mix)。8天,5%的细胞被单独使用,90%的被BFU-Es。晚红细胞CFU-E祖细胞广泛扩散,构成57%的单独的细胞群白天10(图2)。文化失去了他们的不成熟细胞CD34,早在第八天的CD117、CD33的消极,而红色的承诺被CD235a证实,CD71, CD36积极性。天18 CD235a细菌培养红细胞表面⁺。这些细胞仍然表示CD36 CD71标记,也观察到在我们的模型中使用CB和BM(图源3(一个))。

在一个5级基质层,FL CD34⁺细胞CD34红细胞成熟动力学一样显示⁺细胞从其他来源(CB、BM或外周血、数据未显示)到15天。然而,红细胞成熟被天18在嗜酸性阶段,很少和核驱逐观察(3 - 15%)(图3 (b))。假设一个胎儿微环境将提供一个更合适的细分来实现完整的成熟,我们建立了cocultures自体或同种异体msc从FL CD34 -分数,但是没有改善去核效率甚至通过扩展文化24天。

3.2。血红蛋白分析FL-Derived红细胞细胞

定量实时PCR分析总RNA在不同时期的文化(天8、11、15和18)表明,除了球蛋白基因的表达是常数不管文化的舞台,信使rna表达水平的其他球蛋白基因编码是调节红细胞分化过程。

更特别,球蛋白基因表达的FL-derived红细胞细胞显示主要是胚胎(和球蛋白链)和胎儿(球蛋白链)。没有成年球蛋白基因表达可以被探测到。BM-derived红细胞细胞显示成年球蛋白形象他们主要表达球蛋白链和胎儿(在较小程度上)球蛋白链。没有胚胎基因(和球蛋白链)可以被检测出来。CB-derived红细胞细胞表现出类似的基因档案,但有较强的表达的胎儿球蛋白链;胚胎基因(和球蛋白链)可以检测到,但一个变量(图和低表达4(一))。

高效液相色谱法分析()对红细胞进行细胞主要来源于FL显示胎儿血红蛋白(Hb)无论文化的时间。8天,细胞含有68%(59 - 77%)胎儿血红蛋白(住宅)包括一个乙酰化分数。很早就发现迁移小分支,可以认定为巴特Hb,对应于四个协会球蛋白链。文化的末尾(19到24天),86%(80 - 89%)的细胞包含住宅和不到2%(1.2 -1.8%)成人HbA(图4 (b))。

3.3。基因表达明确的红细胞生成的因素

为了解释堵塞的嗜酸性阶段FL-derived红细胞细胞,我们分析了表达式模式被认为与明确的红细胞生成的因素。我们比较PCR结果获得了BM和CB样本同时红细胞文化(天8、11、15、18)。的方法应用于建立基因的相对表达(图5)。

与BM和CB样本,rt - pcr显示所有FL-derived细胞的基因差别一个强大的对这些不管文化的舞台。BM和CB有相同的表达模式的因素除了STAT5a因素(CB显示相同的概要文件FL)。我们还观察到的基因表达水平都更高的BM比CB。

4所示。讨论

各种各样的个体发育的HSC的来源已经探索了细胞疗法。由于需求不断增加在血液供应,某一个感兴趣的领域是输血。因此,我们和其他人所描述的实验程序,允许CD34的大规模扩张⁺从各种来源的细胞和成熟的红细胞表面的生成1,2,19- - - - - -22]。迄今为止,最增生性和访问来源的干细胞生成红细胞表面培养(cRBCs)脐带血。这礼物,然而,限于自愿捐款的缺点不是无限的;1 CB单位给一批cRBC生产。

因为他们是无限的干细胞来源,许多研究正在进行胚胎干细胞和iPS最近。关键的进步让进展在体外生产功能的红细胞在几年内从这些来源。然而其扩张的能力有限在体外是一个限制大规模生产。

在人类发展,FL富含造血祖细胞在8日和22周妊娠是红细胞生成的专属网站。尽管“传统”的来源HSC生成cRBC包括成人(动员外周血或CB)和原始的干细胞(胚胎或“诱导多能性”细胞),有证据表明,FL可能代表丰富的“早期”肝星状细胞,替代来源显示多能——具有高增殖和重新繁衍潜力[23- - - - - -26]。事实上,它已被证明是有效的在移植27- - - - - -29日]。

在目前的工作中,我们解决的问题产生的可能性在体外成熟细胞HSC的中级个体发育的来源(FL细胞)在胚胎干细胞和成年细胞之间。在我们的实验条件,FL细胞成熟主要是阻塞在嗜酸性阶段。事实上,只有少数细胞(3 - 15%)实现终端分化。我们假设成熟的封锁在体外是一个不合适的微环境的结果。假设同一个体发育的微环境阶段将更好地支持红细胞分化,我们cocultured FL-derived CD34⁺5级细胞FL-derived MSC的小鼠基质细胞系。然而,没有观察到不同的终端成熟,大多是有核细胞产生,而在相同的培养条件成体干细胞可以生成完全阐明cRBC。当我们分析了rt - pcr球蛋白的成绩单FL-derived红细胞细胞转录组配置文件主要是胎儿(球蛋白链)和胚胎(和球蛋白链)。同样,BM-derived红细胞细胞显示成年球蛋白形象他们主要表达球蛋白链和胎儿链(在较小程度上球蛋白链)。没有胚胎基因(和球蛋白链)可以被检测出来。相比之下,CB-derived红细胞细胞表现出类似的基因档案,但有较强的表达的胎儿球蛋白链和胚胎基因(和球蛋白链)可以检测到,但一个变量和低表达。通过分析球蛋白基因表达,我们可以观察到我们的文化起源于模仿系统在开发过程中,导致球蛋白基因表达模式符合细胞的个体发生。

调节红细胞分化过程的精确的分子机制仍有待阐明,尽管许多基因和通路已被描述在红细胞生成是必不可少的。为了理解摘出术的原因缺乏观察和FL细胞,我们通过rt - pcr分析一些基因的表达被认为与明确的红细胞生成(即。GATA-1,雾1 SOX6 - 1 b, STAT5a FOXO3a)以下理由。GATA-1发现只在造血细胞和红细胞和巨核细胞的谱系中尤为重要。在体外在GATA-1缺席的情况下,可以观察到成熟赤字,表明其在终端红细胞分化至关重要的作用[30.]。FOG-1-null胚胎存在一个缺陷在原始的和明确的红细胞生成的堵塞原红细胞的成熟阶段31日]。

转录STAT5信号传感器和催化剂的负责控制增殖,分化,细胞凋亡,通过其对基因表达的影响。STAT5蛋白(32)建议在造血作用发挥重要作用,但也有许多矛盾的报告STAT5在正常造血细胞发展的作用。最近的一项研究[33)表明,过度的激活突变(STAT5)诱导红细胞生成,增加长期人类造血干/祖细胞的增殖。siRNA沉默FOXO3a以及- 1 b的失活导致红细胞分化堵塞(34,35]。最后,据报道,在CD34⁺从CB SOX6加速红细胞成熟的动力学和增加细胞的数量,达到最终摘出术步骤(36]。

我们的研究结果清楚地表明,在我们的文化条件,我们研究的所有基因在FL细胞强烈表达下调,而他们是调节在BM和CB的细胞,尤其是在BM细胞。基因表达的模式,我们观察到的是一致的去核缺陷中观察到但无法完全解释。事实上这是定性的而不是功能性的分子分析。不过,这表明基因在终端分化不同监管的功能细胞个体发生和可能至少部分解释观察到的差异生成红细胞的能力在体外。由于许多原因,ES或“诱导多能性”细胞的自然再生医学候选人明天。通过这个模型红细胞生成,可以了解不同的细胞行为根据其个体发生。因为它是出版的题为威廉姆斯et al。“孩子不是小成年人:问问自己的造血干细胞”(37]。广泛的分析模型解释这些差异会极大的兴趣完全控制干细胞的分化途径,有利于下一代的干细胞治疗。

即使红血球的生成胚胎干细胞或iPS一直相当经常通过一些团队(6- - - - - -13),没有成功地阐明100%人口的文化条件。原始细胞似乎表现不佳的完全成熟cRBCs的生产产量在体外。怀疑这是由于他们的个体发生或与之相关的不适当的培养条件仍然开放。

如果FL没有优势最终成熟的多能干细胞,我们观察到放大方面感兴趣。造血途径而言,FL已知包含一个隔间的细胞克隆形成高增殖潜能[14,23- - - - - -25]。这些观察结果证实了我们的发现的(i) CD34的强劲扩张⁺FL细胞和造血祖化验(2)克隆效率100%红细胞诱导3天之后,相比10 - 15%对于成人CD34克隆效率⁺细胞(17]。不同来源的干细胞的增殖能力与个体发育的起源相关的部分。ontogeny-related人类造血细胞的增殖潜能的变化在体外已经建议的文献,分析表明,通过比较骨髓、外周血、脐带血,和胎儿肝脏,,FL似乎代表一个好的目标体外干细胞扩张(38,39]。

我们复制这个观察在我们的文化条件。事实上,我们观察到的100000 - 25000倍扩张细胞CB,分别BM。引人注目的是,对于FL-derived CD34⁺细胞,在相同的培养条件,扩大达到超过倍。

FL仍然是一个模型的研究并不是一个候选人直接的干细胞来源体外红血球生产输血。相反,因为“诱导多能性”细胞能无限增殖,他们显然是最好的候选人建立互补红血球来源输血。但是他们的临床应用需要一个急剧增加的增殖能力在体外。目前的观测与红细胞生成从FL铺平了道路设计的新策略产生诱导多能干细胞。这个想法是由金等的工作。40]。在小鼠模型中,这些作者观察到iPS港残留甲基化签名体细胞组织的起源,这有利于他们分化成供者细胞相关的血统而限制其他细胞的命运。根据这个逻辑,我们可以想象,一个细胞就可以选择具有高增殖能力从而红细胞的生产。

确认

这项工作是支持由协会Combattre La Leucemie (CLL)和Etablissement法语杜唱(EFS)。g . Pourcher和c Mazurier同样贡献这个工作。

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