在骨髓基质微环境改变和细胞凋亡机制参与再生障碍性贫血:动物模型研究可能的疾病病理

文摘

再生障碍性贫血(AA)是一种异构疾病骨髓衰竭综合征。建议机制主要包括干细胞缺乏或缺陷,第二个干细胞缺陷由于细胞死亡之间的监管和分化异常,或有缺陷的微环境。在这项研究中,我们试图探讨造血微环境的改变和潜在机制参与这样的改变药物诱导AA的动物模型。我们研究的结果提出长期骨髓文化、骨髓大鼠,骨髓贴壁和造血祖细胞集落形成,flowcytometric分析骨髓干细胞和间质祖人口和细胞凋亡机制参与再生障碍性贫血。AA骨髓显示,细胞增殖和成熟障碍甚至未能生成功能基质微环境经过19天的文化。Ultra-structural分析表明AA的退化和畸形的骨髓细胞协会。集落形成单位(cfu)也严重降低AA。显著降低骨髓干细胞和间质祖人口与随后的表达水平增加细胞外和细胞内凋亡诱导物标记的AA骨髓细胞本质上指向有缺陷的造血作用;此外,缺乏和凋亡微环境和微环境组件可能扮演了重要的角色在AA的可能发病机制。

1。介绍

再生障碍性贫血(AA)是一种获得疾病的特点是一个极其hypocellular骨髓和外周血全血细胞减少症由于慢性抑郁骨髓的造血作用[1- - - - - -3]。确切的原因和机制在再生障碍性贫血骨髓衰竭仍然稳步不解释;然而,很明显,获得再生障碍性贫血是一种异质性疾病引起的不同病理生理条件下(4,5]。可能的病理生理条件占AA包括造血干细胞(HSC)数量减少,骨髓造血干细胞功能受损,增加细胞凋亡水平和骨髓造血微环境的功能性和结构性缺陷和几个微环境组件6- - - - - -9]。

造血干/祖细胞更新和经济增长一直是讨论的控制下各种细胞因子和生长因子释放的骨髓造血微环境(10]。骨髓腔内的干细胞/祖细胞健康的秘密已经被发现是非常依赖于微环境组件的变化和多样化的自然11- - - - - -13]。最近的研究表明,骨髓造血微环境中异构对骨成骨细胞,成纤维细胞,multilaminar支基质屏障细胞和网状内皮细胞(14,15]。事实上,正常的造血作用需要一个复杂的造血细胞和骨髓微环境之间的相互作用是打开几个增殖和分化所必需的信号级联(16- - - - - -18]。再生障碍性贫血的特点之一是缺乏造血系统和造血微环境的功能。多项研究表明,原始造血祖细胞的数量(长期骨髓造血能力的文化)是大幅减少在绝大多数AA患者。此外,当长期骨髓文化(LTMC)建立了再生障碍性贫血骨髓的造血祖细胞的增殖发现只维持了几天,还在非常低的水平。因此,很明显,严重的定量和定性变化存在的隔间内造血干/祖细胞,在某些情况下,还在疾病AA造血微环境内(19- - - - - -22]。

细胞凋亡(程序性细胞死亡)是增加在一些血液疾病,其特征是骨髓衰竭。优良的平衡正常造血细胞的分化和凋亡在AA获得改变。接触nonphysiological程序性细胞死亡可能放松这个平衡,导致过度和不受控制的细胞凋亡在AA造血细胞的23- - - - - -27]。事实上,它已经表明,这种机制不受监管的细胞死亡的原因是贫穷的生产在AA造血细胞和一个无效造血作用[28]。此外,正常骨髓细胞需要某些可行性因素,由骨髓微环境,保持可行和凋亡当这些因素并撤回。因此,生产可行性因素减少了骨髓微环境也可以贡献问题扩散的缺陷和/或骨髓细胞的过度凋亡在AA (29日- - - - - -33]。

本研究的目的是调查的定量和定性变化造血干/祖细胞室,骨髓基质造血微环境和微环境几个组件在动物模型的药物引起再生障碍性贫血。目的进一步包括从再生障碍性贫血小鼠骨髓细胞的研究而言,单独使用功能潜力和AA的凋亡信号模式。使用以下四个方法:(1)分析骨髓微环境通过长期骨髓外植体培养(LTBMC-Ex)系统、骨髓超微结构的扫描电子显微图和骨髓附着基质细胞的集落形成功效,(2)确定偏差在单独使用潜在的再生障碍性贫血骨髓衍生细胞与正常对照组相比通过半固体集落形成试验,(3)flowcytometric茎(Sca1的表征⁺c - kit⁺)和基质(Sca1⁺CD44⁺祖细胞群;(4)评估骨髓细胞凋亡水平和随后的变化表达谱的一些细胞外的细胞凋亡标记(CD95 / APO-1)和细胞内(pASK-1 pJNK,裂解Caspase-3)凋亡诱导蛋白质AA事件下的疾病。在上述的基础上观察,在这里,我们报告改变AA的基质微环境的生理状态。受损的细胞增殖、分化和细胞凋亡增加再生障碍性贫血骨髓也被显示。本文希望在更好地理解底层机制提供新的见解,参与疾病的发生和发展中AA。

2。材料和方法

2.1。动物疾病和感应

天生的瑞士白化小鼠混合性别的正常控制()和实验()组织被安置在控制室温25°C在过滤器上的笼子里正常的饮食和水随意。20周大的老鼠体重约- gms收到20毫克/公斤体重白消安和80毫克/公斤体重环磷酰胺腹腔第0天、28日,分别。控制了相当数量的盐(34- - - - - -37]。

2.2。血血像配置文件

12周后第二个注入大约200 - 300L通过尾静脉穿刺血收集每个实验和正常对照组的动物使用肝素化瓶。血红蛋白浓度、白细胞(白细胞),红细胞(红血球)计数、血小板、网织红细胞、中性粒细胞计数测定使用标准的实验室技术。

2.3。隔离的骨髓

12周后第二次注射的实验组小鼠显示进步的疾病状态牺牲隔离长骨头(股骨和胫骨)。从上述骨骨髓刷新了一个注射器包含rpmi - 1640媒体补充10%胎牛血清的边后卫。一些孤立的骨髓的部分被切成小块(大约0.2毫米³),并保存在媒体包含的边后卫进行进一步的文化协议和扫描电子显微镜的样品的准备工作。其余的骨髓混合与重复移液,通过细胞过滤器分离单个细胞。孤立的单个细胞被耗尽的红细胞表面使用RBC-depletion缓冲区(美国BD-Biosciences)。最后,细胞被保存在rpmi - 1640媒体补充的边后卫。

2.4。长期骨髓的文化

孤立的小0.2毫米³骨髓移植组织受到文化的碎片一式三份(每个实验组和正常的)在75毫米培养皿(美国康宁公司)包含4毫升的rpmi - 1640补充30%的边后卫。培养基还包括1%的牛血清白蛋白(BSA) 10⁻⁴M 2-mercaptoethanol, 100 ng / mL重组鼠标(rm)干细胞因子(SCF)(美国E-Biosciences), 50 ng / mL rm Interleukin-3 (IL-3)(美国BD-Biosciences)和50 ng / mL rm granulocyte-macrophage集落刺激因子(gm - csf)(美国BD-Biosciences)。文化是在37°C的环境的氛围中5%的股份有限公司₂在空气中。在不同的时间课程文化是监控和细胞增长模式在倒置显微镜下观察和拍摄的实验组和正常。

2.5。样品制备和扫描电子显微镜

一小部分的完整的从每个正常的骨髓组织控制和实验再生障碍性组保存在2.8% gluteraldehyde一夜之间固定。干组织多次通过30%,50%,70%,和100%梯度酒精最后临界点干燥。后,涂层与黄金(Au)在IB-2离子镀膜机,涂层样品经过扫描电子显微镜检查使用s - 5330日立SEM和照片记录。

2.6。骨髓贴壁细胞集落形成

骨髓贴壁细胞集落形成,骨骨髓来源的细胞悬浮在rpmi - 1640浓度的媒体细胞/板,补充30%胎牛血清的边后卫,100 U /毫升青霉素、链霉素和100 U /毫升0.01% (v / v) 2-mercaptoethanol。四个75毫米petridishes每个实验和对照组镀4毫升的媒体包含细胞和放置在一个有限公司₂孵化器在37°C和5%的公司₂。每72小时间隔,媒体被排干和新鲜的媒体补充30%的边后卫和0.01% (v / v) 2-mercaptoethanol添加维护的文化。后14、19和25天的文化殖民地的数量用倒置显微镜。

2.7。造血集落化验

造血祖细胞在methylcellulose-based化验半固体的文化。甲基纤维素培养基由1.2%,30%的边后卫,1% BSA, 10⁻⁴M 2-mercaptoethanol, 100 ng / mL重组鼠标(rm)干细胞因子(SCF), 50 ng / mL rm Interleukin-3 (IL-3)和50 ng / mL rm granulocyte-macrophage集落刺激因子(gm - csf)。RBC-depleted骨髓细胞被镀在最终的浓度细胞/毫升一式三份和文化孕育在37°C的氛围中5%的股份有限公司₂在空气中。经过16天的文化,殖民地在同一道菜使用倒置显微镜。造血殖民地分类如下:CFU-E,红色的殖民地含有25 - 50 hemoglobinized细胞;BFU-E,红色的殖民地包含50多个hemoglobinized细胞组合在一个或多个集群。骨髓殖民地由纯粒细胞殖民地的可识别的亚种群(CFU-G),包含粒细胞和巨噬细胞(CFU-GM)殖民地。混合类型的殖民地含有红细胞和髓细胞(CFU-GEMM)和附着的nonhematopoietic殖民地(CFU-F)也发现成纤维细胞的细胞。

2.8。流仪分析细胞表面标记物的表达

流式细胞仪是用来检测相结合的标记的表达与造血干细胞(hsc)相关(Sca1⁺c - kit⁺)和基质祖细胞(Sca1⁺CD44⁺)[38在正常和病变情况。骨髓细胞被洗和3%多聚甲醛固定(PFA)。那么简单,在一个管PFA固定细胞处理2L每个鼠标anti-Sca1 PE和anti-c-kit FITC共轭单克隆抗体(mab)(美国BD-Biosciences)。在另一个管,PFA固定细胞处理2L每个鼠标anti-Sca1 PE和anti-CD44 FITC(美国BD-Biosciences共轭mab)。所有的管子都孵化在黑暗在37°C 30分钟。最后,这些细胞被洗在PBS和BD流式细胞仪分析了石中剑(美国Becton-Dickenson),使用细胞追求pro软件(美国正欲v9.1迪金森)。

2.9。骨髓细胞凋亡的研究

骨髓细胞凋亡的两个不同方面概要文件被监测两组实验。使用以下两种方法:(1)表达水平的细胞外的细胞凋亡标记CD95 / APO-1骨髓细胞从正常的控制以及实验再生障碍性组织和(2)细胞内凋亡诱导蛋白的表达水平像pASK-1 pJNK,裂解Caspase-3骨髓细胞从正常的控制以及实验再生障碍性组织。(一)第一协议PFA固定骨髓细胞孵化与2小鼠抗CD95 PE共轭马伯的L(美国BD-Biosciences)在黑暗在37°C 30分钟。最后,这些细胞被清洗和BD流式细胞仪分析了石中剑(美国Becton-Dickenson),使用细胞追求pro软件(美国正欲v9.1迪金森)。(b)对胞内pASK-1 pJNK和裂解caspase-3分析约骨骨髓来源的细胞混合1.5%多聚甲醛。细胞被孵化的固定剂10分钟在室温和颗粒状。然后他们被permeabilized 500年通过resuspending有力的涡流L冰冷的甲醇/在4°C细胞和孵化15 - 20分钟。细胞被洗两次染色媒体(PBS包含1% BSA)和划分为三种不同的排序包含染色媒体集中的管子细胞每100l .因此,2L的兔子anti-mouse pASK-1、pJNK和裂解caspase-3主要马伯(细胞信号技术,美国)被添加到各自的标签管和孵化在室温下30分钟紧随其后的山羊抗兔二次抗体共轭Alexa萤石- 488(美国表达载体)的主要包含管抗体和孵化进一步在室温下30分钟。染色的细胞被洗15卷媒体和颗粒状。最后,小球,resuspended在各自包含100管L染色媒体每BD流式细胞仪分析了石中剑(美国Becton-Dickenson),使用细胞追求pro软件(美国正欲v9.1迪金森)。

2.10。统计分析

统计分析是利用学生的表现以及,接受为显著。

3所示。结果

3.1。血血像配置文件

为了证实实验的进步该病的临床地位AA组老鼠,血血图概要文件包括血红蛋白浓度、白细胞(WBC)计数,红细胞(RBC)计数、中性粒细胞、血小板和网织红细胞计数测定。结果显示中度到重度的抑郁在血液中血红蛋白浓度在AA (11.14 g / dl)比正常(15.99 g / dl)。总血细胞微粒计数也严重降低均匀网织红细胞计数减少AA(0.22%)比正常(0.89%)。总白细胞、红细胞、中性粒细胞计数也减少了在实验(白细胞- AA组老鼠/L, RBC -/L,中性粒细胞- 9.95%)比正常同行(白细胞-/L, RBC -/L,中性粒细胞- 22.75%)。

3.2。长期骨髓的文化

分析骨髓造血微环境和特定的微环境组件基本维持正常造血作用,长期骨髓移植文化(LTBMC-Ex)提供系统的模型展示正常骨髓微环境协会及其改变骨髓衰竭等疾病AA。正常骨髓外植体显示健康细胞一代文化(图的第三天1(一))相比,再生障碍性骨髓显示阻碍细胞生成模式(图1 (b))。经过7天的文化、基质的正常外植体显示效率矩阵的形成(图1 (c))相比,AA的外植体似乎扭曲和脆弱,几乎没有细胞生成(图1 (d))。在11天的文化,从创建的正常骨髓基质细胞矩阵在整个培养皿远端从外植体的不同区域(图1 (e))AA骨髓相比,显示没有这样的基质矩阵生成主要外观的不成熟的间质前体和基质成纤维细胞(图1 (f))。在16天的文化,从正常骨髓细胞生成一个有组织的网络的成熟的成纤维细胞的细胞间质基质小造血集落形成可以注意到(图1 (g))相比,细胞形成未能生成的AA骨髓功能成熟的基质矩阵可以维持造血作用(图1 (h))。经过19天的文化,正常骨髓基质生成矩阵似乎更与外观协调大型造血殖民地与之关联(图1(我)),AA骨髓相比,没有这样的功能观察基质矩阵形成频繁出现的大的不成熟的间质前体和间质成纤维细胞(图1 (j))。

3.3。骨髓超微结构的扫描电子显微图

扫描电子显微(SEM)的正常和AA骨髓表现出令人信服的微环境超微结构的差异。正常骨髓的扫描电子显微图(图2(一个))代表一个组织良好的紧凑的细胞结构和细胞内的阀杆和基质之间的联系在正常骨髓微环境。扫描电子显微图从AA骨髓(图2 (b))显示一个整体稀疏和退行性骨髓没有这样交织stem-stroma结构和扭曲的蜂窝组件apoptic频繁出现漏洞。

3.4。骨髓贴壁细胞集落

的定量分布图表骨髓贴壁细胞集落数(图3)显示,骨髓粘附细胞的集落形成能力的人口再生障碍性组老鼠总是低与正常对照组相比,数量在整个天的文化。定量分布图表显示,后第14天,19日文化、AA组动物实验平均值只有15%和33%的控制意味着(),分别。经过25天的文化,殖民地数字仍然下降和AA的平均值被发现只有21%的控制意味着()。的总体平均值附着在AA骨髓细胞集落数只有26%的控制意味着()。

3.5。克隆形成实验

骨髓衍生细胞的克隆形成正常的老鼠和再生障碍性贫血组描述整体减少AA骨髓祖细胞集落形成的与正常骨髓祖细胞进行比较。克隆形成单位红细胞(CFU-E)(图4(一)),红细胞破裂形成单位(BFU-E)(图4 (b))显示一个整体AA表明显著下降()在成熟的红细胞生成减少。粒细胞集落形成单位(CFU-G)(图4 (c))、粒细胞巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)(图4 (d))、粒细胞集落形成单位红细胞单核巨噬细胞(CFU-GEMM)(图4 (e))记录了中度到重度()减少AA表明骨髓干细胞/祖细胞的功能障碍的能力在AA multilineage分化。成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)也显示减少(在AA对正常价值(图4 (f)),是与缺乏基质功能通过长期观察骨髓的文化。所有的结果代表了相对再生障碍性贫血的菌落数量比正常和中值对应±s.d水平观察从15 ()研究样本()。

3.6。流仪分析细胞表面受体的表达

Sca1和c - kit受体表达的表型鉴定骨髓原始干细胞表示高度表达下调Sca1⁺c - kit⁺AA组的细胞群的动物(0.90%)(图5 (b))比正常对照组(8.68%)(图5(一个))。

此外,骨骨髓来源基质祖的表型特征(Sca1⁺CD44⁺)细胞表现出抑郁基质祖人口AA组(9.16%)(图5 (d))比正常(33.38%)(图5 (c))。结果记录在差别明显对这些干细胞和骨髓基质祖细胞人口AA是高度相关通过长期骨髓与我们所观察到的文化,来源于祖细胞的集落形成骨的功效在AA。

3.7。细胞凋亡的研究

骨髓细胞凋亡剖面监测通过两个不同的方面。(一)高细胞外CD95表达式被证明骨骨髓来源的细胞AA组(28.21%)(图6 (b))比正常(4.66%)(图6(一))表明一个增强骨髓细胞凋亡水平在AA是与AA的干细胞和间质祖人口下降。(b)流仪分析细胞内凋亡诱导蛋白质含量在正常再生障碍性骨髓细胞显示,增加细胞内凋亡蛋白表达水平AA相比正常。这里给出数据平均荧光强度值沿设在。再生障碍性骨髓细胞有显著提高细胞内p-ASK1(图7(一)),p-JNK(图7 (b))和裂解Caspase-3(图7 (c))水平与正常骨髓细胞。结果代表增加细胞内凋亡诱导蛋白质表达模式在再生障碍性贫血明显与我们之前的数据增加Fas-R (cd - 95)在AA骨髓细胞表达。

4所示。讨论

AA的发病机制仍不清楚。虽然其他研究表明,微环境缺陷可能会扮演一个角色在AA骨髓衰竭的进展,但确切的机制还不清楚。我们使用长期骨髓外植体培养作为一个有用的工具来评估AA的基质微环境缺陷。长期骨髓文化代表了大多数生理系统评估骨髓细胞体外的生长和扩散。骨髓造血细胞的增殖动力学之间的复杂的相互作用依赖于造血细胞和汇合的基质,因此我们的系统研究基质和评估功能基质的能力组件代表生理体外监测系统。在本文中,我们主要是评估了基质(附着)功能功效和AA骨髓细胞的造血能力通过长期骨髓文化和集落形成功效骨骨髓来源的细胞,分别。在文化、正常骨髓外植体显示健康细胞一代模式与后续开发的功能基质矩阵能够长期维持造血作用。在正常场景形成鲜明对比,AA骨髓外植体记录了细胞生长特点,几乎没有迹象表明功能基质附着层的形成。然而,20%的AA骨髓移植组织表现出温和的骨髓基质附着层快速形成,但也拒绝与天的文化发展与并发数量减少的不依从,祖细胞比正常对照组暗示一个缺陷在干细胞水平或支持造血的骨髓基质细胞的能力。利用长期骨髓外植体培养我们演示了一个缺陷不仅造血细胞的再生能力也支持基质。 Our result clearly showed a defective proliferative capacity of the AA bone marrow cells in culture. The defective hematopoiesis may have resulted from either the failure of the stromal microenvironment to produce growth factors essential for hematopoiesis or the absence of proper growth factor receptors on the AA bone marrow cells.

骨髓超微结构的分析描述了AA的退行性骨髓腔室。复合正常的细胞组织在AA骨髓完全没有大量的频繁apoptic坑。骨髓微环境的结构完整性,是至关重要的维持正常造血作用被发现完全迷失在AA。杂乱无章的骨髓微环境暗示的“正常造血微环境依赖变性”AA。

我们的研究证明了一个显著的降低水平的集落形成附着在AA(基质)骨髓细胞群。这个数据是另一个证据在AA基质存在的缺陷。考虑基质细胞的主要作用早期HSC的监管功能,基质细胞功能障碍可能抑制在AA造血作用的关键。

抑制AA造血微环境的影响也证明显著低cfu形成能力的骨髓造血干/祖细胞在AA。CFU-E的下降值、BFU-E CFU-G, CFU-GM, CFU-GEMM指向残余缺陷在骨髓造血干/祖细胞室的单独使用AA的潜能。的缺陷可以是造血干/祖细胞水平或nonhematopoietic基质细胞水平取决于他们的生理相声造血微环境。扩展的讨论这一事实可能包括两个基本要点:(1)功能性阳痿stroma-dependent抑制造血干/祖细胞增殖和(2)一个障碍在生理成熟和细胞表面受体表达至关重要的造血干/祖细胞细胞造血微环境的维护。

功能不正常成纤维细胞已经被记录在AA。骨髓成纤维细胞显示缺陷的生产纤维母细胞集落形成单位(CFU-F) AA。减少CFU-F进一步暗示有缺陷的微环境基质成纤维细胞的功能。然而,的大小和浓度CFU-F被发现在AA(图增加8 (b)(图)比正常8(一个))。这个矛盾的数据可能占骨髓补偿机制和额外的有丝分裂的结果由于激活基质支持间质细胞前体细胞在AA强调骨髓条件下。

流仪分析骨髓细胞代表茎(本来就量化损失⁺c - kit⁺)和基质(本来⁺CD44⁺)在AA祖人口。虽然在这里所代表的研究主要集中在co-evaluation交织在一起的微环境缺陷的组件,然而我们具体量化孤立骨髓干细胞和基质祖细胞,这些组件指定最重要和造血微环境的组成单位。干细胞和间质祖大幅减少人口提供所需的支持基础来解释实际的疯狂事件在AA造血作用。

细胞凋亡或程序性细胞死亡(PCD)是最与再生障碍性疾病进展相关的病理生理机制进行讨论。细胞凋亡的病理生理学最近才被确认,但有大量的证据表明,扰动控制细胞死亡的机制可能发挥重要作用在与异常相关的疾病细胞死亡和/或细胞增殖。细胞凋亡之间的关系和再生障碍性疾病进展是可逆的;即增加骨髓细胞凋亡导致疾病的增加出现再生障碍性贫血。在这本文,我们想照亮一些凋亡监管者(细胞外的跨膜受体蛋白(cd - 95)和细胞内凋亡诱导蛋白质像p-ASK-1 p-JNK,和裂解caspase-3)中扮演了主要角色控制正常的细胞凋亡和AA的后续修改。再生障碍性贫血骨髓细胞显示增加跨膜CD95 (Fas-R)表达式。Fas-R表达的增加导致更高的AA的细胞凋亡率。的解释增加表达的Fas-R AA骨髓细胞可能包括两点:要么(1)有一个水平的增加抑制分泌的基质微环境因素作为配体可能诱导细胞凋亡的Fas-R或(2)有一个免疫介导contact-mediated破坏骨髓细胞的跨膜信号已被证明涉及表面分子Fas-R (CD95)目标骨髓细胞及其配体在细胞毒性T淋巴细胞(ctl)。然后增加FasR-FasL交互可能开启细胞凋亡信号通路的激活(磷酸化)等细胞内凋亡诱导物蛋白质ASK-1,物,caspase-3阶段特定的方式。在我们的研究中,我们具体分析了这些胞内蛋白的活性形式,pASK-1, pJNK,和caspase-3裂解,得到所有的激活水平的增加蛋白质在AA的骨髓细胞。 The result obtained has helped us to understand the apoptosis pathway involved in AA (Figure9)。

总之,我们可以说,AA骨髓记录改变基质微环境的某些组件,包括缺陷的能力支持正常的造血作用,粘附细胞集落形成和CFU-F形成。同时,干细胞群似乎也严重影响与单独使用减少潜在的再生障碍性贫血明显的菌落形成和流仪分析。文化长期骨髓基质微环境的抑制性影响透露,负责造血细胞的增殖缺陷。基质微环境的改变为AA的发病机制可能占大多数。因此,我们建议进一步调查基质微环境和所需的基质组件AA将更好地理解这种疾病的机制。

确认

作者感谢科技部,印度政府和科技部门,西孟加拉邦政府赞助。作者也感谢导演,加尔各答热带医学学院。

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