研究论文|
骨髓来源的影响间充质干小鼠血浆半胱氨酸的内毒素诱导的氧化和谷胱甘肽细胞
摘要
骨髓间充质干细胞(BMDMSC)正在成为各种炎症状态下的一种治疗方式,包括急性肺损伤(ALI)。炎症的一个标志,以及对ALI患者的一致观察,是系统氧化还原环境的紊乱。然而,BMDMSC对系统氧化还原状态的影响知之甚少。本研究的目的是确定外源注入BMDMSC是否能保护内毒素诱导的血浆半胱氨酸(Cys)氧化和谷胱甘肽(GSH)氧化状态。为了确定BMDMSC对氧化还原状态的影响,小鼠腹腔注射内毒素(1 mg/kg),然后静脉注射其中任何一种<小号vg height="14.5" id="M1" style="vertical-align:-0.3135pt;width:46.612499px;" version="1.1" viewbox="0 0 46.612499 14.5" width="46.612499" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg">
到病原体,物理创伤,或毒性刺激的炎症反应是在宿主防御的关键,但过度的和未发炎可能伤害肺部[<一个Href="#B1">1一个>]。在患有革兰氏阴性脓毒症,细菌内毒素的失调的炎症反应增加了急性肺损伤(ALI)的风险,这可导致严重的呼吸衰竭称为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)[<一个Href="#B1">1一个>]。急性呼吸窘迫综合征和急性呼吸窘迫综合征的发病率和死亡率很高[<一个Href="#B2">2一个>]。因此,减轻急性呼吸窘迫综合征和急性呼吸窘迫综合征炎症反应的策略是非常值得关注的。
在各种炎性疾病的新兴的治疗方式是采用骨髓来源的间充质干细胞/骨髓间充质基质细胞(BMDMSCs)<一个Href="#B3">3一个>]。BMDMSCs是可以从骨髓相对容易地分离并扩增在培养多能细胞。几项研究,包括我们自己,都显示出外生注入BMDMSCs对内毒素诱导的炎症,保护和ALI小鼠[<一个Href="#B4">4一个>-<一个Href="#B6">6一个>]。在这些研究中,BMDMSCs的保护作用是由循环中促炎细胞水平的降低介导的,并且似乎独立于BMDMSCs移植入肺。炎症的一个标志是细胞外硫醇/二硫化物氧化还原环境的紊乱,这在ALI患者中得到了一致的观察。然而,关于BMDMSCs对系统硫醇/二硫化物氧化还原环境的影响知之甚少。
半胱氨酸(Cys)和它的二硫化物胱氨酸(CySS),与谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽二硫化物(GSSG)一起,包括主要细胞外硫醇/二硫化物氧化还原控制系统。Cys和GSH是细胞因子表达的重要决定因素,和变更在Cys和GSH代谢是炎症的一个主要特点[<一个Href="#B7">7一个>]。由于硫醇/二硫化物氧化还原环境与炎症和组织损伤密切相关,本研究旨在研究外源性BMDMSC输注对血浆Cys和GSH水平的影响。越来越多的证据表明,Cys和GSH的氧化还原状态是独立调控的[<一个Href="#B8">8一个>]。因此辅助目的是要确定在两个氧化还原对是否BMDMSC输注不同的响应。小鼠接受腹膜内内毒素,随后静脉输注<小号vg height="14.5" id="M3" style="vertical-align:-0.3135pt;width:46.612499px;" version="1.1" viewbox="0 0 46.612499 14.5" width="46.612499" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg">
除特别说明外,所有的化学品均购自Sigma化学公司(Sigma公司,圣路易斯,MO)购买。蒸馏中,使用去离子水用于分析目的。HPLC质量的溶剂用于HPLC。
实验用10-14周龄,雌性C57BL / 6J小鼠(杰克逊实验室,巴港,ME)进行。小鼠饲养在笼子里,并维持在动物资源的埃默里大学司12小时光照,12小时黑暗周期。全部动物喂沉淀啮齿动物食物(测试膳食5015,实验室饮食公司,里士满,IN),并有自由饮水。所有的实验在光周期期间启动。所有动物方案进行了审查,并通过机构的动物护理和使用委员会的批准。因为雌激素可以发挥抗炎作用,发情周期的影响不能完全在当前实验[排除<一个Href="#B9">9一个>]。
将O55: B5大肠杆菌溶解于无菌PBS中,以1 mg LPS/kg体重腹腔注射。小鼠随后吸入异氟烷麻醉(百特制药、鹿田、IL),给予<小号vg height="14.5" id="M4" style="vertical-align:-0.3135pt;width:46.612499px;" version="1.1" viewbox="0 0 46.612499 14.5" width="46.612499" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg">
使用经优化的方法,以最小化由于收集和处理[错误收集样品<一个Href="#B11">11一个>]。Mice were anesthetized by isofluorane inhalation and blood was collected by submandibular bleeding using a 4 mm mouse-bleeding lancet (Medipoint, Inc. Mineola, NY). To minimize artificial overestimation of GSH due to hemolysis, blood was collected into a heparin-coated eppendorf tube to inhibit coagulation. Samples that showed evidence of hemolysis were not included in the analysis. 收集的血液(0.18 mL)立即转移到含有0.02 mL保存溶液的eppdendorf管中。保存液中加入肝素、丝氨酸硼酸盐,以抑制谷胱甘肽的降解<小号vg height="9.9375" id="M6" style="vertical-align:-2.34499pt;width:8.0625px;" version="1.1" viewbox="0 0 8.0625 9.9375" width="8.0625" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg">
用于HPLC分析(吉尔森医疗电子,米德尔顿,WI),衍生的样品离心,和35 <小号vg height="9.6750002" id="M11" style="vertical-align:-2.29482pt;width:9.6374998px;" version="1.1" viewbox="0 0 9.6374998 9.6750002" width="9.6374998" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg">
细胞维持在加湿的5% CO中<小号ub>2小号ub>在孵化器<小号vg height="11.0375" id="M16" style="vertical-align:-0.17555pt;width:20.200001px;" version="1.1" viewbox="0 0 20.200001 11.0375" width="20.200001" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg">
初级成纤维细胞是从8-10周龄的野生型C57BL / 6J小鼠的肺中分离,如先前描述的<一个Href="#B15">15一个>]。细胞保持在DMEM补充有10个%FBS和1%青霉素 - 链霉素(Mediatech公司,马纳萨斯,VA)多达10次传代。对于体内输注,收获细胞,并如上述进行处理。BMDMSC和初级成纤维细胞传代次数是所有动物每个实验重复内的所有时间点相似。
IL-1的水平<小号vg height="13.425" id="M19" style="vertical-align:-2.29482pt;width:8.8500004px;" version="1.1" viewbox="0 0 8.8500004 13.425" width="8.8500004" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg">
物上使用标准技术在FACScan流式细胞仪(Becton Dickinson公司)上进行流式细胞术表面标志物组的表达。BMDMSCs were harvested by trypsinization, washed in PBS, and stained with the following antibodies : Fluorescein isothiocyanate- (FITC-) anti-CD45, PE-anti-CD11b, and PerCP-Cy5.5-anti-Sca-1 (Pharmigen San Jose, CA). Acquired data were analyzed using FlowJo software (Tree Star, San Carlos, CA). 使用间充质干细胞中有功能鉴定试剂盒(R&d系统明尼阿波利斯,MN USA)测定BMDMSC的分化成多种间充质谱系的能力。成脂分化为14天诱导种子细胞<小号vg height="7.1750002" id="M20" style="vertical-align:-0.1254pt;width:8.9375px;" version="1.1" viewbox="0 0 8.9375 7.1750002" width="8.9375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg">
数据表示为平均值<小号vg height="9.3125" id="M24" style="vertical-align:-0.51414pt;width:10.825px;" version="1.1" viewbox="0 0 10.825 9.3125" width="10.825" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg">
通过选择既不表达造血细胞也不表达内皮细胞表面标记,但对粘附和基质标记表达阳性的塑贴人群,从原始骨髓悬浮液中富集骨髓源间充质干细胞[<一个Href="#B3">3一个>]。然而,由于缺乏一组明确的、明确的标记来区分间充质干细胞,建立间充质干细胞表型的金标准标准是三联分化试验,其中间充质干细胞的可塑性通过其在刺激下分化为脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞的能力来确认[<一个Href="#B16">16一个>]。
在本研究中,我们通过流式细胞术分析和通过分化测定证实MSC表型。通过流式细胞仪分析显示,细胞均匀阴性造血标志物,CD11b和CD45(蓝色,BMDMSC)。细胞染色呈阳性干细胞抗原(SCA)-1(图<一个Href="//www.newsama.com/journals/sci/2010/868076/fig1/" target="_blank">图1(a)一个>-<一个Href="//www.newsama.com/journals/sci/2010/868076/fig1/" target="_blank">图1(c)一个>)。分化测定表明BMDMSCs保留其分化成脂肪细胞,骨细胞,软骨细胞和多达10次传代(图能力<一个Href="//www.newsama.com/journals/sci/2010/868076/fig1/" target="_blank">1(d)一个>-<一个Href="//www.newsama.com/journals/sci/2010/868076/fig1/" target="_blank">1(e)中一个>)。因此,在本研究中使用的细胞群代表的表型,其与MSC一致。
1.介绍
2。材料和方法
2.1。物料
2.2。实验动物
2.3。有限合伙人管理
2.4。样品采集和半胱氨酸的分析,CySS,GSH和GSSG
2.5。细胞培养
2.6。细胞因子分析
2.7。流式细胞术
2.8。分化测定
2.9。统计方法
3.结果
3.1。骨髓间充质干细胞的表征
(一个)小号trong>
(b)中小号trong>
(C)小号trong>
(d)小号trong>
(e)中小号trong>
(F)小号trong>

(一个)小号trong>
(b)中小号trong>
(C)小号trong>
(d)小号trong>
(e)中小号trong>
(F)小号trong>