通过添加6个不匹配的活脐带血单元，在成人造血移植中增强植入极低剂量脐带血单元

摘要

该报告描述了添加多个可行的hla不匹配的不相关脐带血单位的可行性，以低细胞数匹配的不相关脐带血，以协助临床移植。在一个患有复发急性淋巴细胞白血病(ALL)的成人患者中进行了消融性干细胞移植，使用单个hla匹配的脐血单位(单核细胞剂量))，辅以6个不匹配的脐带血单位(每10公斤受者体重一个单位)。输注不匹配的单元后没有发生不良反应，亚最佳剂量匹配单元的植入迅速发生，没有不匹配的索植入的分子证据。在白血病克隆中使用一种新的线粒体DNA突变的PCR方法证实了ALL的早期分子缓解。匹配的脐带细胞剂量远低于70公斤受者的推荐剂量。我们认为，一个或多个因素在不匹配的脊髓增强/支持的植入匹配的脊髓。

1.介绍

脐带血(CB)作为成人移植干细胞来源的价值已经得到了提高，关键的观察表明，使用两个部分匹配的脐带血可以促进移植和结果[1，2］．这种方法已被用于增加整体干细胞数量，并似乎创造了一种移植模式，临床结果类似于匹配的不相关的成人骨髓移植[3.］．cd34 +细胞剂量被认为是安全移植的关键，建议的阈值水平是公斤(4，或有核细胞总剂量(TNC)被认为是必要的[5，因此，在移植成人时，要使用两条导线来克服剂量问题。然而，通常只有一个注入的脐带移植，这就提出了非移植脐带中可能促进移植过程的附加因素的问题。

在NOD/SCID小鼠模型中出现的证据表明，即使与包含相同细胞数目的单个单元相比，使用两条连线也会增强植入[6］．这些研究的作者得出的结论是，结果表明，植入可能通过添加第二个不相关的CB而增强，这可能归因于细胞剂量增加或由于未知的因素提供了移植物促进作用，因为在这种情况下，通常只有一对索能成功嫁接。

此外，在人体移植实验中观察到多个完全不匹配的导线，这表明一些植入[7，8，也提供了有趣的证据，表明在其他致命的临床情况下，加强脐带植入的新方法是必要的。

在这个初步报告中，我们描述了使用非常低的剂量，匹配的脐带单元(/kg单个核脐带细胞)，成功地用多个(6个)不匹配的活脐带支持一个成年患者，这些活脐带本身没有移植。

2.病历

2001年，一名31岁白人男性(体重70公斤)在2000年11月出现急性淋巴细胞白血病。外周白细胞是/ L。肿瘤为CD10+、CD13+、CD19+、CD20+、CD33+、CD34+、HLADR+、TDT+。标准细胞遗传学失败，但经PCR检测细胞BCR/ABL阴性。他接受了为期6个月的积极多剂化疗计划(北方地区血液学组NEALLVI)。在治疗结束时，采集外周血干细胞的尝试失败了。没有同胞或成人匹配的无血缘关系的造血干细胞供体。在完成治疗六个月后，他又复发了。进一步的积极化疗(flag -氟达拉滨，胞嘧啶阿拉伯糖苷和GCSF)完成了再诱导，导致持续和不可恢复的骨髓发育不良，持续出现少量白血病细胞。

由于没有成年HSC供者，我们确定了一个完全匹配hla的男性脐带血单位(总有核细胞剂量)/kg，单个核细胞剂量/kg)，无法获得cd34剂量。这个匹配的单位是O型血，而接受者是a型血。这个单位(2002年移植日期)被认为不足以保证在一个70公斤的接受者体内移植。经过与患者和亲属的详细讨论，并考虑Gryn等人的初步数据[7]，另外6个完全hla不匹配，血型匹配，从纽卡斯尔脐带血库中选择女性脐带血单位，以增加干细胞成分。

预处理包括Rituximab(抗cd20抗体)四剂(325 mg/sq .)M /剂)，8天以上。经此处理后，骨髓母细胞含量直接无变化。额外的预处理包括静脉注射美法仑120 mg/m²加上3天内6次TBI为1200cgy。鞘内也使用甲氨蝶呤。hla匹配的脐带单元先于不匹配的脐带单元，以促进与匹配元件的主要植入。其余的脐带都在四天后的一个小时内注射。这些单位的有核细胞含量见表1．


样品描述	脐带血机组的血型和Hla类型	NUC细胞总数 $\times 10^{7}$	有核细胞计数 $10^{7}$ /公斤	跨国公司 $\times 10^{7}$ 总计	CD34 $\times 10^{8}$ 总计	CTLA4微卫星基因型	肿瘤坏死因子微卫星基因型

白血病病人	- - - - - -	- - - - - -	- - - - - -	- - - - - -	- - - - - -	27日、28日	a2, 7;d3, 4

匹配的线	O位和A29, A68, B44, B1402/04/06 Cw08, Cw1601, DRB1, DQB1, DPB1	102	1.46	56.2 (0.8 $\times 10^{7}$ /公斤)	- - - - - - NK	16、19	a2, 7;d4 4

Nonmatch线1	A2, A11, B8, B35, Cw7, Cw4/18, DR1	66.6	0.95	- - - - - - NK	0.36	8、16	a6, 10;d3, 3

Nonmatch线2	POS和A1，A11，B18，B38，CW12，CW7，DR13，DR15	132.8	1.89	- - - - - - NK	0.292	8、8	a2, 2;d1, 4

Nonmatch线3	A Pos和A1, A26, B8, B49, Cw7, DR1, DR17	159.8	2.28	- - - - - - NK	0.639	8日,22日	a2, 5;d1, 3

Nonmatch线4	A Pos和A1, A2, B8, B27, Cw2, Cw7, DR17	80.2	1．15	- - - - - - NK	0.217	8日,19	a2, 2;d1, 4

Nonmatch线5	A、A2、B44、B60、Cw5、Cw10、DR13、DR15	64.6	0.92	- - - - - - NK	0.058	19日,22日	a4, 11;d3, 3

Nonmatch线6	A、A2、A3、B7、B60、Cw7、Cw10、DR4、DR17	91.4	1.31	- - - - - - NK	0.165	8、8	a2, 11;d3, 4

患者血液+21天		- - - - - -	- - - - - -	- - - - - -	- - - - - -	16、19	a2, 7;d4 4

表1

脐带移植装置的细节。细胞特征和HlA类型的脐带单位用于移植。没有人尝试在不匹配的脐带中找到匹配的组织类型。匹配的脐带不同于A+血型患者匹配的脐带O+。Class 1 DR时匹配的脐带组织类型相同，DP完全匹配，但DQ不匹配。所有脐带捐献均为女性，CMV抗体阴性基因型为CTLA4和TNFA位点标记的等位基因ID(参考文献)。匹配的脐带细胞剂量大大低于成人移植的推荐剂量(

0．8 \times 10^{7}

/kg)，但粒细胞移植迅速、简单。NK-not知道。

2．1.移植

单匹配的脐带移植的详细信息列于表中2．白细胞重建显示出+28天/L，粒细胞计数惊人/L后随着GM CSF(开始于+7天)停止使用而减少。所有的白细胞都来自匹配的脐带单元。血小板植入，如预期的，是缓慢的，没有达到的水平/L直到第120天不支持(表2）.


（ $\times 10^{9}$ / l)	第一天	一天15	21天	28天	32天	36天	40天	一天50	一天75	一天100	一天140

“总	0．00	0.4	0.6	2.3.	8．8	6.8	5．0	10.3	5．6	4．6	11．1
中性粒细胞	0.03	0.04	０．３３	1.3.	7.45	3.5	2.46	7.37	2.53	1.98	5.97
淋巴细胞	0．01	0.29	0．15	0.26	0.19	0.84	0．8	0.29	0	1.0	1.03
单核细胞	0．00	０．０２	０．１６	0.65	1．02	1.43	1.14	1.63	0.91	0.95	2.60
嗜酸性粒细胞	0．00	0．00	0．00	0．12	０．０２	1.1	0.56	0．8	1.78	0．3	1.4
嗜碱粒细胞	0．00	0．00	0．00	0．01	0．15	0．01	0．08	0．14	0．14	0．13	０．０５
血红蛋白	8．7	11．1	10．8	10．4			11．1	10.6	10．4	１０．０	11.6 (unsupptd)
血小板	22	24	18	42			14	8	14	36	58 (unsupptd)
血液gp a -线粒体DNA突变(骨髓)+ve IgH (V2) +ve				线粒体DNA突变(骨髓) $- 已经$				O +血型确诊		线粒体DNA突变(骨髓) $- 已经$ 本(V2) $- 已经$	线粒体DNA突变(骨髓) $- 已经$

白血病克隆的分子标记物(免疫球蛋白重链标记物(IgH/VH1/VH2)和T细胞γ基因重排(由伦敦皇家自由医院L. Foroni博士提供)在化疗后临床缓解期消失，随后复发时恢复。在脐带血移植后的第100天样本中，这些标记物不再被识别。

使用三个微卫星位点(TNFa和TNFd (6p21.3)和CTLA4位点(2q33))进行VNTR分析，对所有输错配的脐带血单位进行基因型跟踪。使用这些标记物，所有输血单位均具有独特的基因型(见表)1）.在第5天可检测到患者的基因型痕迹，随后无法检测到。从+7天开始检测hla匹配的脐带单位基因型，在5-7天之间检测到任何不匹配的脐带基因型的微弱信号，之后它们消失了。(检测灵敏度为2% - 5%)。

在另一项关于血液系统恶性肿瘤线粒体突变的研究中，该患者的白血病细胞显示有体细胞线粒体DNA突变细胞色素b他等人[9])。一种敏感的特异性PCR检测方法显示该突变在诊断和复发细胞中都存在。在脐带单元移植后，骨髓中没有这种突变的证据，无论是在+28天，+100天，还是+140天，表明在那个阶段的分子缓解(检测的敏感性0.1%使用SYBR Green实时荧光定量PCR检测，参见He等人，[9]详情)。第100天骨髓只被匹配的脐带填充(FISH 100%嵌合)。

3.讨论

脐带血移植可以安全地考虑成人使用单个合适的脐带血单位，当没有合适的成人捐赠者时，结果足够好，可以推荐这种方法[10］．这个问题涉及到细胞的剂量、速度和移植的安全性，任何能持续改善这一点的东西都有明显的好处。最近的研究结果证实，这是移植的一个主要问题/公斤有核细胞[11，12尽管Takahashi等人在7例移植中发现了延迟移植/公斤。

显然，双脐带移植与部分匹配的单位有很大的价值[1- - - - - -3.，以及Gryn等人的惊人观察[7在Lister等人后来的报告中证实[8即持续植入可能发生在完全不匹配的脐带单位，导致了这里描述的方法，即不匹配的脐带单位支持一个小的匹配的脐带单位。由于该手术发生在2002年，当时还没有建立部分匹配的双脊髓移植，所以我们不确定还需要多少完全不匹配的脊髓。另外6条导线的选择与单独使用完全不匹配的单元的少量数据有关(7)，所以这个数字是任意采用的，以确保提供高总剂量。在附加脐带之间选择脐带HLA类型不是一个考虑因素;主要特征是他们与接受者是同一血型;所有女性捐赠者都能追踪，巨细胞病毒阴性。

临床上，这是一种简单的干细胞移植，对不匹配的脐带单元没有立即或延迟反应。单用环孢素A进行免疫抑制，在+30天停用，没有发生急性移植物抗宿主病。

粒细胞系快速移植(见表)2)，而在移植后早期，只有来自其他六个脐带单元的DNA的短暂证据。在双脐带移植中观察到的固定模式是，通常出现单个单线作为主导元素，但也可能出现混合嵌合体。然而，在双脊髓移植中，通常至少有与患者和另一脊髓部分匹配[1］．

在该患者中，低剂量hla匹配的CB单位骨髓移植的速度和范围，中性粒细胞为/l，提出了其他脐带单位是否支持SCID模型所建议的植入的问题[6］．总共使用7条线与Gryn等人的观察有关[6每10公斤体重使用一根绳子。在我们的患者中应用这种方法并不复杂，并为进一步的实验应用提供了模型。随后的疗程被一种由HHV6感染引起的脑病所中断，这种病在使用膦甲酸钠治疗数周后得到了满意的治疗。

在白血病克隆中出现的新线粒体DNA突变使我们能够评估移植后早期患者的生物学缓解状态。晚期ALL的血液学缓解很少发生在化疗-放疗和匹配的异体移植后复发。在这种情况下，在移植后的早期阶段取得的“分子缓解”表明，如果发生了GVHD/GVL，那么缓解可能已经增强。不幸的是，在缓解8个月后，白血病复发了，所有克隆分子标记都恢复了。(无论干细胞来源或治疗方式如何，在复发时接受移植的病人在移植后疾病复发的可能性最高[12])。

显然，任何一种能够在匹配单位非常小的成人身上更快更安全地植入脐带干细胞的方法都值得进一步探索，并表明双脐带方法的成功可能不仅仅与干细胞数量的增加有关。我们在这个案例中的发现可能会诱使实验人员用动物模型来进一步定义在多索移植中可能的生物学机制。

致谢

作者希望感谢2000年骨髓和干细胞移植基金的财政支持。他们要感谢皇家自由医院血液科的Letitia Foroni对IgH和T细胞基因重排研究的评估。他们感谢肯·布里格姆、贾尼斯·邓恩和克里斯汀娜·奥利弗出色的技术支持。

参考文献

J. N. Barker, D. J. Weisdorf，和J. E. Wagner，“在移植来自两个部分匹配的无血缘关系的捐赠者的脐带血后创造了一个双重嵌合体，”新英格兰医学杂志第344期第24页，1870-1871页，2001。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
J. N. Barker, D. J. Weisdorf, T. E. DeFor等人，“移植2个部分hla匹配的脐血单位以加强血液恶性肿瘤成人的移植。”血第105卷第1期3，页1343-1347,2005。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
c·g·布伦斯坦和j·e·瓦格纳的《成人脐带血移植》肝病杂志第91卷第1期3，页195-205,2006。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
J. E. Wagner, J. N. Barker, T. E. DeFor等人，“102例恶性和非恶性疾病患者的非亲属供体脐带血移植:cd34细胞剂量和HLA差异对治疗相关死亡率和生存率的影响，”血号，第100卷。5，页1611 - 1618,2002。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
E. Gluckman和V. Rocha，“急性白血病儿童脐带血移植:一项欧洲脐带血登记分析”血细胞、分子和疾病第33卷第3期3，页271-273,2004。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
a . J. Nauta, a . B. Kruisselbrink, E. Lurvink等人，“通过共同移植第二个不相关的脐带血单位，增强脐带血来源干细胞在NOD/SCID小鼠中的植入，”实验血液学第33卷第3期10，页1249-1256,2005。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
J. Gryn, D. T. Harris, R. K. Shadduck等，“多个不匹配的脐带单元(MUCs)用于成人异体移植，”血第98卷第1期11, p. 666a, 2001。视图:谷歌学术搜索
J. Lister, J. F. Gryn, K. L. McQueen, D. T. Harris, J. M. Rossetti，和R. K. Shadduck，“多单位hla不匹配的性别不匹配的脐带血移植治疗晚期血液系统恶性肿瘤，”干细胞与发育，第16卷，第5期。1，页177-186,2007。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
L. He, L. Luo, S. J. Proctor et al.，“成人白血病的体细胞线粒体DNA突变”，白血病，第十七卷，第二期12，页2487-2491,2003。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
E. Gluckman，《脐带血移植》血液和骨髓移植生物学，第12卷，第808-812页，2006。视图:谷歌学术搜索
L. Lekakis, S. T. Giralt, D. Couriel等人，“非亲缘脐带血移植对高风险血液恶性肿瘤成人的II期研究，”骨髓移植第38卷第2期6，页421-426,2006。视图:谷歌学术搜索
A. Bacigalupo, T. Lamparelli, F. Gualandi等人，“异基因造血干细胞移植用于复发急性白血病患者;长期的结果,”骨髓移植第39卷第3期6，页341-346,2007。视图:谷歌学术搜索

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