文摘

水蛭胚胎发生是研究细胞和分子模型的发展过程。由于胚胎干细胞的异常大尺寸(端细胞:50 - 300年 米)glossiphoniid水蛭,Theromyzon tessulatum,的存在可识别的干细胞前体(proteloblasts),我们先前孤立的一组基因调节干细胞出生。在目前的研究中,我们表明,这些基因之一,指定Theromyzon扩散(Tpr),需要正常的干细胞起源;具体来说,瞬态Tpr击倒的实验与反义寡核苷酸通过半定量rt - pcr和监控,造成异常proteloblast扩散导致胚胎死亡,但没有明显影响neuroectodermal或中胚层干细胞发展一旦这些细胞出生。Tpr编码一个大型多为( ∼ 34%)域股份组成相似,并有很强的转录增强剂其中许多已经与三核苷酸重复障碍(例如,亨廷顿氏)。

1。介绍

干细胞(SCs)是独一无二的,他们自我更新和产生分化细胞类型;知识管理这些过程显然是重要的基因在决定他们的遗传潜力。各种转录分析工作已经确定了候选基因参与SC自我更新和效力1- - - - - -3),但小基因数据集之间发生重叠,称这些分析问题(4]。尽管如此,一些基因通常与干细胞起源或维护(例如,Oct4 [5];Nanog [6];Sox2 [7]),和某些转录因子的组合出现足以促进干细胞的命运当ectopically表达一些nonstem细胞类型(8,9]。

目前干细胞研究都集中在哺乳动物的SCs,但是我们探索这个主题在无脊椎动物模型系统中,水蛭Theromyzon tessulatum,这是暂时性的显示具有属性类似于哺乳动物的胚胎SCs成人SCs [10]。水蛭提供了一个新的视角来这个舞台上,因为干细胞前体(proteloblasts)和干细胞(端细胞)实验可以在开发过程中,与哺乳动物的胚胎细胞,均匀的水蛭细胞类型可以由相对简单的解剖(图1)。水蛭proteloblasts和端细胞特别大(50 - 400人 米),它允许细胞特定类型的显微镜下注射分子试剂(如血统追踪器,核酸),他们出现在可预测的时空位置在胚胎发生(图1)。具体来说,中胚层proteloblast (DM)和外胚层的proteloblasts (NOPQ左和右)来自D象限内大裂球 ∼ 受精后,持续10个小时 ∼ 1小时时间窗;此后,每个proteloblast产生各自端细胞(s)血统的速度 ∼ 每小时1劈理(即。,DM cleavage generates left and right M teloblasts, and NOPQ gives rise to N, OP, Q, O, and P teloblasts in successive cleavages).


图1
示意图glossiphoniid水蛭的早期发展。几个不对称分裂,proteloblasts DM(阶段4)和NOPQ(第五阶段)通常定位在胚胎的表面。一系列不平等的分歧导致五双边配对干细胞(10),或者端细胞(灰色细胞:M, N, O, P, Q,,引起链节段创始人细胞细带(阶段7、8)。通过外包,细带穿过表面的胚胎(箭头,阶段8)和融合节段中胚层和外胚层的组织形式。修改从Hohenstein沙恩[10]。

利用这些发展特性,我们以前使用微分display-PCR (DD-PCR)方法确定一套无偏(即。,非实际候选人基因方法),差异表达基因,其中一些是调节后端细胞[的诞生10]。在我们以前的工作后,我们在这里报告一个teloblast-specific基因,指定Theromyzon扩散(Tpr多为),编码一个蛋白质中起关键作用端细胞形成。具体地说,Tpr转换期间上调proteloblasts端细胞,然后呢Tpr击倒实验破坏正常细胞分裂模式导致的异常增殖proteloblast目标,但不是端细胞,细胞。

2。材料和方法

2.1。水蛭和胚胎收集

成人Theromyzon tessulatum标本,以前搞混了t .粗鲁的或t . trizonare(11),收集在金门公园的池塘(旧金山,CA)。水蛭是维持在 1 2 ∘ C 在0.03%的即时海洋盐(水族馆系统)。胚胎是由立体显微镜下目视检查和适当的阶段是收获(描述10]。

2.2。微分Display-PCR

单个细胞的显微解剖和收集从水蛭胚胎及其转录分析微分display-PCR (DD-PCR)进行描述(10]。DD-PCR乐队被放大根据制造商的协议(Clontech);乐队与Minielute凝胶凝胶纯化提取工具包(试剂盒)和克隆到pGEM-T容易(Promega)。DNA测序商业(北方DNA, Inc . Becida, MN)与标准T7或Sp6引物。

2.3。互补脱氧核糖核酸库筛选和种族(快速放大cDNA结束)

是由Triplex2 cDNA库 ∼ 100年第一阶段t . tessulatum胚胎(孕产妇库)和各式各样的阶段1 - 9胚胎(胚胎库)利用智能方法(Clontech)。库进行了筛选高紧缩下标准程序(12),与 3 2 P ]-dCTP PCR-labeled调查。RACE-PCR进行使用Tpr特殊技能寡核苷酸(TprA-D;见下文)来源于最初的差异表达Tpr片段(10]。

2.4。寡核苷酸显微镜下注射

寡核苷酸合成商业(Sigma-Genosys)。反义寡核苷酸是TprA-TTGATATTACTGCCAGCATG TprB-TGTAGTTGTCGTTGATGTTG;寡核苷酸是TprC-TGCAACACATTCGACATCAC, TprD-AACACACGACAACAACAACG。寡核苷酸resuspended在 H 2 O 在1毫米和coinjected荧光示踪血统(fluorescein-dextran胺(FDA、分子探针)或tetramethylrhodamine-dextran胺(RDA,分子探针))所描述的(13]。

2.5。成像

胚胎被认为在蔡司Axioplan配备了这项工作。图像捕获尼康Coolpix 5000相机和处理Photoshop (Adobe)。

2.6。半定量逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr),

总RNA提取的总RNA隔离系统(Promega)和反向转录Powerscript (Clonetech)。使用商业上合成第一链cDNA被放大(Sigma-Genosys) gene-specific引物和18 s核糖体RNA引物。下面列出了rt - pcr引物组与近似片段大小:Tpr1-TTGTCAAAACAACGTGACAAC, Tpr2-GGTTTTTGTTGTTGAATGCTG(270个基点);18 s核糖体RNA-GCTTGTCTCAAAGATTAAGCC AACTACGAGCTTTTTAACTGC(610个基点)。rt - pcr进行与钛Taq DNA聚合酶(Clontech)使用以下参数: 9 4 ∘ C (15秒); 5 7 ∘ C (1分); 7 2 ∘ C (1分钟),32个周期。每个车道代表提出至少有三个独立的实验。

3所示。结果

在多个基因调节在水蛭端细胞的诞生,Tpr显示一个明确的,虽然弱,teloblast-specific表达谱在微分(DD)分析(即显示。乐队在M和N端细胞通道和第七阶段的胚胎;参见图2(一个))。相对较弱的DD乐队符合负北部的屁股使用Tpr调查,表明Tpr可能是一种罕见的成绩单。验证的DD模式Tpr并进一步分析其时间表达在水蛭胚胎发生过程中,半定量的反向transcriptase-PCR分期(rt - pcr)进行使用Theromyzon tessulatum胚胎。胚胎在阶段1 - 4(包含proteloblast细胞),6(包含所有10端细胞)阶段,阶段7和8(包含端细胞和bandlets-see图1rt - pcr)收集和处理。正常反应,18 s核糖体RNA coamplified反应。这些分析表明,Tpr在胚胎含有端细胞调节,与他们的直接前体相比,DM和NOPQ(图2 (b))。令人惊讶的是,Tpr信使rna也发现受精卵(阶段1),表明它的存在作为一个母亲的信使rna。转录水平下降在早期分裂,直到到达第四阶段胚胎的背景水平附近,其中包含proteloblast细胞,DM和NOPQ。可比性下降的孕产妇成绩单一直在观察水蛭(例如,nano(14])和其他生物(例如,鼠标15])。端细胞诞生的同时,Tpr水平增加,直到达到峰值水平阶段7(包含端细胞和细带)在下降阶段之前8。

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图2
微分表达式Tpr在水蛭胚胎发生。(一)差异显示分析显示微弱Tpr乐队与小孔(盒装)在M和N端细胞车道,在第七阶段胚胎含有端细胞M, N, O, P和q带上方和下方出现在所有车道和可能“管家”基因。(b)半定量rt - pcr分析显示下降Tpr记录在第一阶段通过第四阶段(大概孕产妇);积累新的受精卵的成绩单之后明显,达到峰值阶段7。车道和18 s rRNA引物规范化。

只因为DD分析生成的基因片段,t . tessulatum互补脱氧核糖核酸数据库筛选中获取额外的努力Tpr互补脱氧核糖核酸序列。重叠cDNA片段从图书馆获得多个屏幕和RACE-PCR产品生成775个基点的线性序列相结合,包括多为( ∼ 34%)249氨基酸的开放阅读框(图3)。奇怪的是, 3 ′ 结束Tpr无代表的出现在我们的低聚糖dT-primed孕产妇和胚胎cDNA库,建议内部丰富的段(注意丰富的创新艺人经纪公司和CAG重复序列可用),我们无法获取额外 3 ′ RACE-PCR使用了1日链cDNA序列的模板。同样的, 3 ′ 序列图所示3没有检测到我们的吗t . tessulatum基因组文库。


图3
Tpr加入核苷酸和氨基酸序列预测(基因库。EU527977)。可用的ORF编码一种蛋白质域包含 ~ 34%的谷氨酰胺。阴影序列识别的位置寡核苷酸TprA (330 - 350), TprB (378 - 397), TprC (410 - 429), TprD (464 - 483), Tpr1(292 - 302),和Tpr2(529 - 549),用于显微镜下注射,RACE-PCR和rt - pcr(见部分2)。

检查的功能Tpr在胚胎发育阶段,各种各样的反义寡核苷酸(作为)产生瞬变击倒Tpr在胚胎发生mRNA水平。为特异性和毒性控制,独立意识寡核苷酸microinjected到发展在不同阶段的胚胎,没有造成明显的胚胎缺陷(图4(一))。然而,三个独立的显微镜下注射Tpr寡核苷酸进入第三阶段胚胎的D大裂球(见图1糖尿病和NOPQ)引起的异常细胞分裂的细胞,导致细胞集群紊乱(代表表型数据所示4 (b)和4 (c))。注意,寡核苷酸瞄准其他teloblast-specific基因识别原始DD-PCR分析显示完全不同的表型(如细带截断),所有这些都是与导致的异常增殖有关Tpr寡核苷酸(16]。总的来说,我们观察到这个集群细胞表型 > 300年实验胚胎 > 5独立的魔爪 ∼ 95%的胚胎的影响;剩余的胚胎通常overinjected和最初的显微镜下注射后没有进一步划分。独立的功效是寡核苷酸多样(与其他报告一致17]),TprB(磷酸二酯和phosphorothioate链接)显示一个比别人更强的表型测试;因此,寡核苷酸TprB是用于后续分析。注意,紊乱的细胞不能计算准确,因为他们形成三维数组;然而,我们的估计表明,TprB-injected胚胎细胞的总数近似正常的细胞数量相对胚胎,如果小裂球分解成计数(也比较控制和实验胚胎在图6)。大约48小时接受,细胞增殖停止和胚胎不久就夭折了。通常,几百个异常细胞(大致相等的大小;参见图4 (b)和4 (c))来自一个antisense-injected D大裂球。

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图4
扩散细胞集群microinjecting后生成Tpr反义寡核苷酸到发展中Theromyzon tessulatum胚胎。(一)正常,中期发展阶段8胚胎固定 ~ 后48小时coinjecting寡核苷酸TprC和RDA D大裂球(红色)。(b)代表胚胎固定 ~ 后48小时co-injecting反义寡核苷酸TprB和FDA(绿色)D大裂球。(c)抽样的胚胎(b)实验组一样。酒吧 = 100年 μ m (a)、(b);250年 μ m (c)。

半定量rt - pcr分析表明,Tpr信使rna水平撞倒了在上述实验(图5)。具体地说,Tpr记录中没有检测到AS-injected胚胎发生异常增殖6小时(6)阶段或12小时(7)阶段post-injection,然而是很容易检测到相应的uninjected和sense-injected控制胚胎,分别(图5)。通过 ∼ 24小时post-injection(在正常的胚胎早期8)Tpr记录出现在AS-injected胚胎,并进一步增加 ∼ 45小时(中期发展阶段8在正常胚胎),前胚胎杀伤力。


图5
瞬态的可拆卸的Tpr信使rna所监控的半定量PCR。反义寡核苷酸TprB microinjected D大裂球的 ~ 50的胚胎, ~ 12个胚胎收获6(6)阶段,12(7)阶段,24(8)早期阶段和45(中期发展阶段8)小时后,分别。Tpr24小时post-injection mRNA水平明显的扩散的胚胎。控制(没有注射)和意义(TprC)显微镜下注射进行相同的实验离合器和收获6(6)和(7)阶段的12个小时post-injection,分别。车道和18 s rRNA引物规范化。
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图6
细胞分裂导致扩散细胞集群的时间进程Tpr反义寡核苷酸显微镜下注射D大裂球。(一)正常胚胎 ~ 6小时后显微镜下注射与意义寡核苷酸TprC (co-injected RDA;红色)。(b) - (d)代表典型的分裂 ~ 6小时后显微镜下注射与反义寡核苷酸TprB(与FDA co-injected;绿色)。(e)正常胚胎 ~ post-injection 12小时。(f) - (h)反义注入胚胎 ~ post-injection 12小时。(我)正常胚胎 ~ 24小时post-injection。(j)——(k)反义注入胚胎 ~ 24小时post-injection。 规模 酒吧 = 200年 μ m。

确定的时间窗口Tpr表达是正常发展的关键,不同的细胞类型是microinjected作为异常增殖和寡核苷酸和监控(数字6和7)。胚胎注射随着寡核苷酸在1 - 2细胞阶段的发展通常直到第四阶段,此时的中胚层proteloblast (DM),通常将同样划分为前两个小裂球芽 米 l 和 米 R 端细胞(图6(一)),将偏心(和不可预知的)与正常相比乳沟模式(数据6 (b)- - - - - -6 (d))。此后,细胞分裂AS-injected细胞不规则并显示没有检测模式,但通常生成异常细胞集群大约大小相同的细胞(数字6 (e)- - - - - -6(左);cf。4)。同样,击倒的Tpr信使rna在proteloblasts DM和NOPQ引起异常分裂中胚层(M)和neuroectodermal (N, O P和Q)血统,(例如,图7(一)),也异常的细胞分裂,但在较小程度上比在早期注射。一般来说,每个胚胎的扩散程度直接关系到注射细胞的年龄;因此,早期胚胎注射(即。,stages 1, 2, and 3) resulted in larger cell clusters, while later injections (i.e., precursors DM and DNOPQ) were less severe (Figure7(一))。

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图7
Tpr反义寡核苷酸proteloblast影响,但不是端细胞,细胞的发展。(一)Proteloblast NOPQ microinjected(右)Tpr感觉寡核苷酸TprC (co-injected RDA;红色的)并显示正常的扁带模式,而NOPQ(左)microinjectedTpr反义寡核苷酸TprB(与FDA co-injected;绿色)扩散异常;代表胚胎收获在 ~ post-injection 36小时。(b) M(右)端细胞与TprC microinjected(意义;红色)出现正常 ~ 50小时后;M(左)与TprB microinjected(反义;绿色)也出现正常(每个胚带的差异在一定程度上导致的 ~ 2小时之间的延迟和反义显微镜下注射)。(f) N(右)端细胞与TprC microinjected(意义;红色)出现正常 ~ 72小时后;N(左)与TprB microinjected(反义;绿色)出现相对正常。规模的酒吧 = 200年 μ m。

最后,Tpr反义注入M, N, OP端细胞不能产生异常增殖,而是有很少或没有影响后续发展(例如,细带的形成)与对侧相比,sense-injected或noninjected端细胞谱系(数字7 (b)和7 (c))。注意,这些注射了几小时后比注入DM(造成戏剧性的异常),和水平的Tpr信使rna可能是比较不同试验阶段(见图2 (b))。因此,发展时间短窗口存在(即。出生,几小时前端细胞)内Tpr信使rna击倒实验阻止正常端细胞起源,这表明抑制既定合子的发病Tpr转录(cf。图2 (b))是比推倒端细胞的正常发展的关键Tpr记录曾经端细胞出生。

4所示。讨论

通过比较在proteloblast和端细胞细胞基因表达谱,我们孤立的相对较小的一组teloblast-specific基因(10),其中一个编码指定的多因素Tpr。定义的发育时间窗口内Tpr可拆卸的实验有效的(即。,a few hours prior to the birth of teloblasts) suggests thatTpr寡核苷酸阻止了既定的正常开始Tpr成绩单,这意味着Tpr proteloblast行为主要是 → 端细胞过渡的地方,而不是在维护端细胞分化。但是请注意,Tpr proteloblast劈理(即之前必须采取行动。proteloblast),Tpr击倒显然影响了proteloblast乳沟模式(见图6)。考虑到时空的表达Tpr这里介绍(即。,DD-PCR, RT-PCR), we propose thatTpr是一种罕见的转录表达前不久proteloblast乳沟,需要正常端细胞出生。

这个时间窗口对应大约与成熟的合子的转录的发病相关的水蛭,Helobdella罗布斯塔发现,尽管合子的转录有阶段(18]。水蛭类似于完全过渡到受精卵的控制模型像海胆一样,在受精卵的转录开始在早期分裂但完整的合子的控制不存在,直到后来在发展19]。在转录h·罗布斯塔抑制了 鹅膏蕈碱,异常的细胞分裂产生之前端细胞形成导致胚胎死亡(19),与我们接受表型(见图6 - 12小时6),但不同程度的异常细胞分裂和杀伤力的时间框架。尽管如此,两者之间的相似之处的研究明显,和差异可能与目标基因的数量在每一个研究和/或特有的发展变化;事实上,形态不容易区分的物种Helobdella不仅大幅偏离他们的基因组序列,但也显示的发育过程中差异显著(20.]。

4.1。细胞增殖

胚胎细胞扩散的程度Tpr注入proteloblast细胞在水蛭没有被观察到,但是胚胎细胞增殖异常的倾向已记录的misexpression几个基因,特别是在果蝇,黑腹果蝇。例如,一个致命的巨大的幼虫淘汰赛导致上皮细胞(成神经细胞异常增殖21)的突变Rpb9防止其表达阶段3蛋室导致cystocytes overproliferate导致卵巢肿瘤表型(22),和损失的notch信号在中枢神经系统引起广泛的细胞增殖(23]。虽然我们目前无法建立的机制Tprdownregulation引起异常的细胞增殖,受精卵的数据链接Tpr表达与正常出生的水蛭端细胞;当受精卵的Tpr表现为抑制,proteloblast细胞显示不规则分裂,导致异常细胞质量和胚胎死亡。原则上,Tpr基因产物可能与方向有关的proteloblast解理面;损失的控制可能会扰乱正常的分区,和信息交互和/或信号导致子细胞的组成部门(cf。致命的巨大的神经,Rpb9,和切口淘汰赛中前面描述的那样)。

4.2。多为蛋白质

多领域一直与蛋白质-蛋白质之间的关系(例如,极地拉链),影响转录。例如,Sp1的增强蛋白质与组件的交互TFIID通过多域(24),以及notch信号是由LAG3,多为转录因子,缺乏一个DNA结合主题(25]。的倾向CAG三核苷酸重复扩张在配子形成谷氨酰胺(导致的重复)杭丁顿氏症的根本原因和相关疾病26,27),导致缺乏序列相似性之间观察到的多为同系物的相关类群(28]。

我们却惊奇地发现只有成分匹配(即。,多为域)Tpr在基因库;另一方面,转录因子和homopolymeric运行特定的氨基酸(即。Gln Ser,阿拉巴马州,Pro, g)组件是守恒的Hox基因调控途径(例如,lag-3和sop-3在秀丽隐杆线虫;摄魂师在d .腹)没有明确的同系物在其他生物28]。也许Tpr迅速发展Theromyzon血统(派生群寡毛纲动物29日),或者差距可能存在于其他水蛭的基因组序列,可能与我们的困难在克隆Tpr 3 ′ 结束。无论如何,Tpr似乎函数在转录水平上新生儿端细胞根据其层次mRNA的表达情况,及其特点多为转录激活域(域,是一个标志27,30.]。

5。结论

我们报告一个谷氨酰胺丰富因子(Tpr会上调在干细胞起源)水蛭。的基因可拆卸的Tpr在早期胚胎防止正常干细胞起源,导致异常的细胞增殖和胚胎死亡;Tpr击倒干细胞出生后显示没有明显的发育异常。

承认

这项工作是由国家卫生研究院授予R15 HD 42548 - 01 - a3国土安全部。第一和第二作者同样起到了推波助澜的作用。