文摘

中间和高风险横纹肌肉瘤(RMS)患者不良预后与可用的治疗方案,突显出一个清晰的未满足的需要确定新的治疗策略。Ezrin-radixin-moesin (ERM)家庭成员membrane-cytoskeleton链接器蛋白质有定义良好的角色在肿瘤转移,经济增长,和生存。ERM蛋白质活动是由动态的变化在守恒的苏氨酸残基磷酸化的c端actin-binding域。ERM家庭成员,有趣的是,在RMS ezrin表达升高,组织。尽管如此,针对ERM家族蛋白质的转化范围在这些肿瘤药物抑制从未考虑。本研究探讨ERM磷酸化的抑制使用小分子药效团NSC668394作为一个潜在的策略对RMS。在体外治疗NSC668394, RMS细胞表现出剂量依赖性降低细胞生存和增殖,诱导caspase-3乳沟和细胞凋亡。siRNA-mediated击倒的个人ERM蛋白表达显示每个调节RMS生存在不同的程度上。体内NSC668394管理局在RMS异种移植导致肿瘤生长明显降低,对体重没有不良影响。总的来说,这项研究强调了ERM蛋白质的活性构象的重要性在RMS发展和生存,支持药物抑制这些蛋白质作为一种新颖的治疗方法。

1。介绍

横纹肌肉瘤(RMS)被认为是最常见的小儿软组织肉瘤发病率为4.4情况下每年每百万(1]。间充质来源的肿瘤一样,因此发生在不同的解剖位置,包括头部、颈部、躯干地区,在泌尿生殖系统,和腹部2- - - - - -5]。RMS的两个主要组织学亚型胚(erm)和肺泡(武器),与erm诊断更常见(∼60%情况下)相比,武器(∼20%情况下)(6]。主轴/硬化性和多形性RMS占其余的病例(6]。erm通常呈现在年幼的儿童(1 - 14岁)。相对于武器;然而,两个主要子类型最常被诊断为小儿肉瘤(7,8]。在分子水平上,染色体易位t (2;13)(q35;q14)和t (1;13)(p36;q14)融合成对框转录因子(PAX3/7) 3/7 forkhead盒蛋白1 (FOXO1),与武器(9]。有趣的是,组织病理学分类fusion-negative武器已被证明是分子和临床区别erm [10]。频繁的基因改变在erm包括杂合性丢失(LOH)和印迹11 p15.5轨迹,导致IGF2的过度11- - - - - -13]。RMS的风险分类是基于多个标准包括组织学亚型、肿瘤位置和转移潜能(6]。最近,PAX3/7-FOXO1融合状态也已成为一个重要的遗传预后指标,fusion-positive患者表现出恶化的结果相比,fusion-negative患者(14]。RMS的标准治疗方案包括化疗和手术和/或辐射,导致事件免费五年存活率∼90%本地化,低风险的患者。然而,估计患者的存活率下降∼70%中间值和高风险的RMS∼25%,凸显出需要新颖的治疗选项(15- - - - - -17]。

有趣的是,研究表明,人类RMS组织相对较高的ezrin表达(VIL2)正常骨骼肌相比18]。此外,ezrin表达的程度增加而晚期RMS和与更大的转移潜力有关18,19]。抑制ezrin表达在高转移性RMS细胞系可以减少他们的转移潜力,同时增加ezrin表达差转移RMS细胞系导致较高的转移(18]。Ezrin属于ezrin-radixin-moesin (ERM)家族的蛋白质和由一个高度保守的N终端丰贸领域,一个中间α螺旋形域和一个肌动蛋白结合c端域。ERM蛋白质构象之间切换显示封闭和开放的构象,后者对应于桥梁的活性形式质膜和肌动蛋白细胞骨架20.]。在封闭的构象,erm是磷酸化,与肌动蛋白结合位点蒙面的丰贸域(20.]。在其c端苏氨酸残基磷酸化将它们转换成一个开放的构象从而使绑定与丝状肌动蛋白的糖和跨膜和适配器蛋白质丰贸域(20.]。这种交联能力允许一系列细胞过程相关的发展和可持续性的肿瘤细胞,包括生存、增殖、凋亡、迁移和入侵21- - - - - -26]。尽管这种守恒的苏氨酸磷酸化ERM蛋白质功能的重要性,它从未被药物针对RMS评估对肿瘤生长的影响。

为了确定RMS新颖的治疗方法,我们假设药物抑制ERM与NSC668394蛋白质,ERM磷酸化作用的小分子抑制剂,将在RMS诱导抗增殖和凋亡的影响。

2。材料和方法

2.1。细胞系

RD (ccl - 136)和Rh18 erm,而Rh30和Rh41武器。RD是来自写明ATCC, Rh18 Rh30, Rh41获得癌症肿瘤组(齿轮)存储库。从遗传的角度来看,RD和Rh18 PAX-FOXO1 fusion-negative,而Rh41和Rh30 fusion-positive。所有RMS细胞系培养在37°C公司为5%₂。RD和Rh41生长在杜尔贝科修改鹰中补充10%胎牛血清的边后卫,而Rh18和Rh30杜尔贝科是生长在Iscove修改中有20%的边后卫和1 x的胰岛素,转铁蛋白,亚硒酸(它)。

2.2。生存能力和扩散分析

细胞被播种在12-well或96孔板,台盼蓝和MTT检测,分别和细胞孵化完成生长介质包含NSC668394(1、2.5、5或10μ米)或车辆控制(DMSO)为0,24日,48岁,72和96 h。活细胞计数与血细胞计数器是由锥虫蓝可视化。MTT (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)被添加到细胞的最终浓度为10%和孵化为4 h 37°C。培养基被移除,和减少肝癌产生的甲瓒晶体盐溶解在DMSO溶液。在562纳米吸光度测定的分光光度法。

2.3。细胞凋亡检测

RD细胞被播种在6-well盘子和孵化与包含NSC668394完全培养基(5或10μ米)或车辆控制(DMSO)为0,48和96 h。细胞凋亡分析使用PE膜联蛋白V凋亡检测设备(BD生物科学,富兰克林湖,新泽西,美国制造商的指导方针。细胞受到使用BD LSRFortessa流式细胞术^TM细胞分析仪系统(BD生物科学,富兰克林湖,新泽西,美国)和分析使用FlowJo软件(版本10;新创软件、亚什兰,美国)。

2.4。siRNA可拆卸的

RD细胞被播种在0.25×10⁶每在6-well盘子,24小时后,媒体的增长是替换为2毫升Accell交付媒体补充2%的边后卫和2μ小干扰rna对ezrin M, radixin、moesin或者这三者的结合(美国Dharmacon拉斐特公司)。2μ米不属预定目标的小干扰rna被用作炒消极的控制。孵化后48 h, 1毫升新鲜交付媒体2μ小干扰rna被添加到每个M。在96 h,活细胞计数由锥虫蓝,并为西方墨点法细胞细胞溶解。

2.5。西方墨点法

细胞细胞溶解(如前所述)(27]。蛋白质浓度估计使用皮尔斯^TMBCA蛋白质分析工具包(ThermoFisher科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。蛋白溶解产物分离通过sds - page和受到西方墨点法使用表示主要抗体(ezrin、radixin moesin, phospho-ezrin (Thr567) / radixin (Thr564) / moesin (Thr558)裂解caspase-3,和β肌动蛋白1:1000年,细胞信号,丹弗斯,马)。HRP-linked山羊α兔免疫球蛋白二次抗体(1:000;美国杰克逊ImmunoResearch西树林,PA)和Amersham^TM发射极耦合逻辑^TM免疫印迹检测试剂(美国通用电气医疗集团,麦迪逊,WI)被用来可视化蛋白质乐队。相对带强度量化使用ImageJ软件(NIH;https://imagej.nih.gov/ij/)。

2.6。异种移植模型

NOD-SCID -γ^{- / -}(NSG)小鼠作为免疫力低下小鼠模型,以实现成功的传播RMS肿瘤体内。皮下(n= 12)和原位(n= 20)肿瘤是在6 - 8周大女NSG小鼠注射5×10⁶RD细胞悬浮在基底膜基质为两国侧翼或双边股二头肌肌肉,分别。一旦变得明显,肿瘤小鼠随机分为两组治疗和接收每日腹腔内管理车辆的控制(DMSO)或20毫克/公斤体重NSC668394皮下和40毫克/公斤体重NSC668394原位模型。每周肿瘤尺寸测量三次,每周体重记录一次。治疗方案之后,直到控制老鼠的肿瘤负荷太大,和安乐死是必要的。肿瘤被数字卡尺,测量和计算量 (28]。进行了动物实验在动物肿瘤的核心设施Lerner研究所按照指南克利夫兰诊所的机构批准的动物保健和使用委员会。

2.7。免疫组织化学

皮下肿瘤异种移植是收获的后期,在福尔马林固定,石蜡块嵌入,切割5点μ米厚度。程度的增殖和细胞凋亡测定使用Ki67抗体(罗福斯生物制剂;纪念、CO)和裂解caspase-3(细胞信号,丹弗斯,MA)。进行免疫组织化学染色发现使用超自动化色料(罗氏诊断,印第安纳波利斯)。总之,抗原检索使用执行发现CC1三羟甲基氨基甲烷/硼酸/ EDTA缓冲液(罗氏诊断,印第安纳波利斯),pH值8.0 - -8.5,56分钟,40分钟,分别在95°C。幻灯片是孵化Ki67抗体(1:1000)1小时在室温下和裂解caspase-3抗体(1:200)在室温下了40分钟。抗体是可视化使用OmniMap anti-Rabbit合二级(罗氏诊断,印第安纳波利斯)和ChromoMap民建联检测工具(罗氏诊断,印第安纳波利斯)。最后,幻灯片和苏木精复染色和发蓝处理解决方案。幻灯片是莱卡SCN400幻灯片上成像扫描仪(美国伊利诺斯州鹿田徕卡微系统公司)和分析使用斐济ImageJ的图像处理方案29日]。量化Ki67的强度和裂解caspase-3染色,DMSO的图像或NSC668394-treated肿瘤部分受到颜色反褶积,而孤立的DAB染色面具苏木精复染色。民建联面具被转换为8位,和五个同样大小的选择感兴趣的区域(ROI)。在每个ROI(平均灰度值测量30.),然后转换成光密度值(OD)使用公式ImageJ用户指南中描述(https://imagej.nih.gov/ij/docs/user-guide-USbooklet.pdf)

2.8。统计分析

所有数据都表示为平均值±标准平均误差(SEM)。GraphPad棱镜7中统计分析软件(GraphPad软件公司,拉霍亚,CA,美国)。双向方差分析(方差分析)与Dunnett多个比较测试是用于分析细胞生存能力、MTT和膜联蛋白V / 7-AAD数据。单向方差分析与Dunnett或Holm-Šidak多个比较被用来分析裂解caspase-3西方墨迹和目标蛋白表达siRNA KD实验,分别。肿瘤生长数据受到重复措施与Holm-Šidak多个双向方差分析比较。的集成电路₅₀值抑制细胞代谢是源自对肝癌和96 h数据非线性回归。

3所示。结果

3.1。NSC668394抑制ERM磷酸化和RMS细胞系细胞生存能力

鉴于phosphorylated-ezrin (Thr567) -radixin (Thr564) -moesin (Thr558)水平确定细胞内活动的程度,这些蛋白质的磷酸化状态检查两个erm亚型(RD和Rh18)和两臂亚型(Rh30和Rh41)细胞系来源于不同的亚型。RD和Rh18代表fusion-negative RMS肿瘤,而Rh30和Rh41 fusion-positive。免疫印迹显示ERM蛋白质结构上在监管苏氨酸残基磷酸化RMS细胞系,不管亚型或融合状态(图1(一))。然而,RD和Rh41显示最高ERM磷酸化和Rh30(图1(一))。

检查接触NSC668394是否会影响烫水平,erm细胞系RD和手臂细胞系Rh41 NSC668394浓度增加处理(0.5、1和5μ米)或车辆控制1 h。NSC668294导致剂量依赖性减少烫发与显著的抑制浓度大于0.5μM(图1 (b))。探讨NSC668394对细胞活力的影响,利用台盼蓝化验。NSC668394治疗有效地减少RD, Rh18、Rh41 Rh30剂量和时间的方式,尽管Rh30受到影响(图1 (c))。进一步评估影响细胞的代谢活动来衡量细胞生存能力,MTT检测进行。NSC668394治疗后,所有四个RMS细胞系表现出剂量依赖性降低代谢活动趋势近似锥虫blue-based可行性测量(图1 (d))。的集成电路₅₀抑制细胞的新陈代谢在96 h是Rh41最低(2.766μ米),其次是Rh18 (3.291μ理查德·道金斯(4.115米)μ7.338米)和Rh30 (μ米)(图1 (e))。

3.2。NSC668394 RMS细胞发生凋亡

探索损失的细胞生存能力是否与诱导细胞凋亡有关,RMS细胞处理浓度增加NSC668394 96 h,沾膜联蛋白V / 7-AAD并通过流式细胞术分析。细胞染色阳性膜联蛋白V但不利于7-AAD视为早期凋亡,而那些积极染色膜联蛋白V和7-AAD被限定为晚期凋亡或死亡。尽管所有RMS细胞系增加了水平的早期和晚期凋亡细胞与NSC668394治疗,细胞系之间有明显的变化类似于生存能力下降和新陈代谢的变化观察(图2(一个))。erm细胞系RD增加早期和晚期凋亡细胞的比例48和96 h后10μM NSC668394治疗趋势朝着更高的水平在96 h 5μM(图2 (b))。erm行Rh18,水平的早期和晚期凋亡增加5和10μNSC68394 48和96 h。尽管如此,诱导细胞凋亡在10μ米治疗似乎是低Rh18相比RD 96 h。武器细胞系Rh41 10μM NSC68394治疗导致增加早期和晚期凋亡细胞48 h后在96 h和维护水平升高,而5μ治疗后早期和晚期凋亡细胞增加96 h。手臂线Rh30显示增加的早期和晚期凋亡在48和96 h 5μ米和10μM处理样品;然而,细胞凋亡的水平相比大大降低,在其他三个细胞系。进一步证实诱导细胞凋亡,RD和Rh41细胞治疗与10μM NSC668394 caspase-3劈理水平检测到免疫印迹。两RMS细胞系表现出显著诱导裂解caspase-3 NSC668394治疗后,与最大增加观察到48 h(图2 (c))。

3.3。siRNA击倒ERM蛋白质减少RMS细胞生存能力

作为NSC668394治疗减少了所有三个ERM家族蛋白的磷酸化,我们旨在阐明ezrin的个人贡献,radixin,对RMS moesin细胞生存能力。因此,siRNA击倒在RD细胞系实验检查的影响抑制ezrin, radixin或moesin单独和这三个ERM蛋白质在一起。RD细胞治疗与每个核中描述的方法。RD细胞处理核与radixin moesin实现∼95%和90下降表达式,分别为(数字3(一个)和3 (b)),而ezrin实现只有∼50%减少相对于相应的目标表达控制siRNA-treated细胞(数字3(一个)和3 (b))。同时对所有三个治疗RD细胞siRNAs ERM蛋白质减少导致∼75% ezrin表达,radixin∼90%, moesin∼95%(数据3(一个)和3 (b))。在96 h,活细胞计数是由锥虫蓝。相比控制siRNA-treated (3.4×10∼⁶细胞)RD细胞,ezrin和radixin击倒均显示减少细胞生存能力(2.24×10∼⁶细胞)(图3 (c))。Moesin KD对细胞生存能力影响最大的(1.24×10∼⁶细胞)在单独可拆卸ERM蛋白质(图3 (c))。不出所料,所有三个ERM蛋白质的结合抑制对RMS影响最大的细胞生存能力(0.8×10∼⁶细胞)在96 h(图3 (c))。

3.4。NSC668394减少RD体内肿瘤的生长

我们下一个检查如果NSC668394会改变人类RMS细胞的生长line-derived肿瘤体内。初始NSC663894对肿瘤生长的影响建模使用皮下(平方)异种移植(n= 12)RD细胞系的NSG老鼠。一旦肿瘤明显,老鼠接受每日腹腔内(IP)管理的车辆控制,DMSO (n= 6肿瘤)或20毫克/公斤体重NSC668394 (n= 6肿瘤)。NSC668394政府明显降低RD肿瘤的生长(图4(一))。平均平方NSC68394-treated组肿瘤体积(x̅= 216.8毫米³)明显低于车辆控制(x̅= 747.7毫米³)队列在36天( ),这一趋势和相对较低的成交量保持通过随后的测量时间点(图4(一))。检查NSC668394在原位模型的影响,肌内(IM) RD异种移植(n= 20)也成立于NSG老鼠。肠肿瘤占被隔离在肌肉内,NSC668394剂量升级到40毫克/公斤体重,以确保足够的水平NSC668394到达肿瘤。治疗后,IM NSC68394-treated组肿瘤体积(n= 10肿瘤,x̅= 291.3毫米³)明显低于车辆control-treated队列(n= 10肿瘤,x̅= 914.2毫米³)开始的21天治疗( ),这剩余体积相对减少坚持通过测量时间点(图4 (b))。治疗方案为平方和IM异种移植随访了38天,26天,分别,此时,车辆control-treated老鼠的肿瘤负荷太大,和安乐死是必要的。平均体重比较治疗组之间的系统性毒性的指标。在这两个平方(图4 (c))和我(图4 (d))异种移植模型,NSC668394-treated老鼠并没有表现出任何重大改变体重比车辆在任何时间点测量控制队列。没有其他的发病率或系统性毒性的迹象,如修饰行为的变化,是公认的队列。调查根本原因减少了肿瘤的生长,皮下异种移植在收获的日子安乐死,福尔马林固定,嵌入在石蜡块切片。部分从每个队列是彩色Ki67或裂解caspase-3作为增殖和凋亡的标记,分别。定量图像分析NSC668394-treated肿瘤部分(n= 5)显示Ki67下降( )(图4 (e))和增加裂解caspase-3 ( )(图4 (f))染色相比DMSO-treated肿瘤部分(n= 5)。

4所示。讨论

尽管ezrin被认为是RMS的进展和转移的重要推动力,药理效应的抑制和ERM家庭其他成员的贡献radixin和moesin曾被认为是(18]。我们旨在揭示潜在的治疗抑制ERM RMS中蛋白质的性质。这里,我们展示的重要性ERM蛋白质在RMS增长使用细胞培养和异种移植模型和支持ERM蛋白质在RMS治疗可操作的目标。

开创性的研究中ezrin抑制骨肉瘤的疗效(OS)最初确定了两个小分子,NSC50787 NSC668394,都脱去磷酸ezrin Thr567残留,导致失活(23,31日]。迄今为止,NSC668394报道显示在多种肿瘤包括抗癌活动,操作系统,弥漫型大b细胞淋巴瘤(DLBCL)、胶质母细胞瘤、乳腺癌(21,23,32,33]。然而,没有之前的研究调查的影响小分子抑制RMS ERM蛋白质细胞生存能力、代谢、细胞凋亡。我们在体外实验显示,NSC668394有效减少RMS细胞生存能力和代谢与IC剂量依赖性的方式₅₀从2.766 - -7.338μm代表两个细胞系ERM和手臂回应NSC668394治疗,强调ERM蛋白质的重要性的生长和存活RMS不管组织学亚型或PAX3/7-fusion地位。同样值得注意的是,这些发现符合那些记录在DLBCL和操作系统,报告了类似的集成电路₅₀值为5.8μM和5.9μ米,分别32,34]。此外,我们表明,抑制ERM蛋白质有效减少RMS可行性通过诱导细胞凋亡。与观察到的细胞生存能力的减少和新陈代谢,ERM抑制引发细胞凋亡的程度是变量之间的细胞系和似乎并不取决于亚型或PAX3/7-fusion状态。总体而言,我们的研究结果证明能力的一种小分子抑制剂ERM磷酸化在RMS显示肿瘤抑制活动。体内ERM抑制两种异种移植模型证实其肿瘤抑制的特点在生理上相关的设置。此外,包含IHC透露Ki67降低,增加裂解caspase-3染色NSC668394-treated肿瘤部分,支持ERM抑制体内的抗增殖和凋亡诱导特性。此外,缺乏小鼠的减肥治疗NSC668394表明良好的安全性,这表明它可以影响RMS肿瘤生长没有呈现衰弱系统性副作用。

我们的研究结果的解释依赖于NSC668394的特异性。嗯可以由多个蛋白质激酶的磷酸化,包括PKC [20.,35- - - - - -37]。因此,先前的研究考虑了两种机制NSC668394 activity-direct绑定ezrin和预防或抑制激酶磷酸化,通常磷酸化ezrin。Bulut等人表明NSC668394对PKC没有显著的抑制效果α,PKCγ,或者PKCι在浓度高达100μM和PKC报道更弱的亲和力ι(KD = 58.1μ米)相比ezrin (K_D= 12.59)(23]。此外,DLBCL我们先前的研究显示,过度的细胞中ezrin NSC668394大大减少其处理能力降低细胞的生存能力,支持特异性NSC668394 ezrin及其高度同源的家庭成员(32]。同样,另一项研究报道antimetastatic NSC668394在乳腺癌的属性显示ezrin-deficient细胞处理NSC668394不再显示减少迁移(38]。我们的研究结果也支持的几个NSC668394的特异性。NSC668394的功效在减少RMS细胞生存能力和诱导细胞凋亡水平似乎与基底烫在RMS细胞系。RD和Rh41相对较高的烫在静息细胞也表现出了极大的减少凋亡细胞生存能力有较大增加,而Rh18和Rh30水平相对较低的烫发和经验相对较少NSC668394可行性和细胞凋亡的影响。作为先前的研究主要是集中在RMS ezrin作为一个司机,我们感兴趣的观察对细胞生存的影响是否完全是因为打断ezrin函数或者radixin moesin也导致了RMS的生存。有趣的是,核击倒ERM蛋白质显示所有三个调节RMS生存在某种程度上。而radixin和moesin siRNAs取得了几乎完全击倒,ezrin只有部分拆除,这表明它可能造成更少的细胞生长比转移。Moesin最大降价导致个人对生存的影响,与ezrin radixin减少细胞生存能力较小。然而,最大的观察对细胞活力的影响在所有三个ERM蛋白质同时撞倒了。在一起,这些发现表明,NSC6683894可能抑制的结果的影响ezrin, radixin, moesin函数与小分子的脱靶效应。

尽管目前的研究主要集中在ERM蛋白质在RMS生存和凋亡的作用,重要的是要考虑汇率机制的完善作用蛋白质prometastatic分子。打断ERM-family蛋白质的功能已被证明在其他肿瘤类型影响迁移。例如,ezrin抑制减少操作系统和乳腺癌的转移扩散,而沉默moesin和radixin显示减少黑色素瘤的迁移和入侵和结肠癌,分别。在RMS,转移是最常见的与武器相关亚型由于其显著更高的侵略性和迁徙的潜力。为此,未来的研究将调查在RMS ERM抑制转移的影响。

RMS的标准化疗方案一般包括长春新碱、放线菌素d,和环磷酰胺(休假)组合疗法,提供∼70 - 90%的5年存活率低风险病人(15,39]。然而,存活率大幅减少中间和高危病人的化疗方案变得越来越密集,和额外的佐剂通常包括,从而突出创新的必要性,目前的治疗方案(15,39,40]。因此,使用药理ERM抑制剂可能值得现实考虑将来作为辅助标准化疗RMS。

作为本研究的结论,我们提供的证据表明,药物抑制ERM蛋白质的小分子NSC668394诱发RMS的损失增长的基础细胞培养和异种移植模型。总的来说,我们的研究表明,ERM蛋白质可能在RMS临床可行的目标。

缩写

erm:	胚胎性横纹肌肉瘤
武器:	肺泡横纹肌肉瘤
ERM:	Ezrin-Radixin-Moesin。

数据可用性

所有的数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

NG负责研究的概念和设计,解释数据和项目的财政支持。美联社、NB和DP进行体外实验。YP和DL肿瘤异种移植实验。NG,美联社写了手稿。

确认

作者承认援助冯飞培养细胞系。这个项目是由一个创新拨款支持亚历克斯的柠檬水站儿童癌症基金会NG和共享动物肿瘤Lerner研究所的核心和成像的核心。