文摘

平滑肌肉瘤(LMS)的特点是高基因组的复杂性,到目前为止,没有特定的靶向治疗。在全基因组的方法,我们在小群异形基因畸变八原发性肿瘤,两个复发,八转移在九个不同的病人。我们确认到放大作为经常性变更的18个样本在5 (27.8%)。之前它已经表明LMS细胞系SK-LMS-1 p16通路中的一个缺陷,该细胞系可以抑制到和CDK6抑制剂palbociclib。SK-LMS-1我们确认和SK-UT-1我们表明LMS细胞系表达到,此外,强劲SK-LMS-1 CDK6表达式,而Rb SK-UT-1 SK-LMS-1但不表达。我们确认抑制SK-LMS-1 palbociclib导致强烈的Phospho-Rb降低蛋白质含量(Ser780),减少细胞增殖,G₀/ G₁步逮捕与降低S / G₂分数。SK-UT-1没有回应palbociclib抑制。比较这些在体外发现与病人组织样本,p16,到,CDK6, p-Rb免疫组织化学染色法测定的LMS队列(159个样本)患者进行分配一个潜在的响应者表型每个病人,我们确定在29岁99名(29.3%)患者。综上所述,这些数据表明,CDK4/6抑制剂可能为靶向治疗提供了新的选择LMS病人的一个子集。

1。介绍

平滑肌肉瘤(LMS)是由平滑肌分化和具有复杂和高度可变基因异常(1- - - - - -3]。他们占多达24%的软组织肉瘤,和每年的发病率估计约1.23/100000 (4]。LMS的发病机理和遗传复杂性仍知之甚少(3]。

临床上,根治手术仍然是治疗的基石在当地LMS疾病,由辅助化疗和放疗(5]。然而,局部复发是常见的在39%,和LMS可能转移在81%的情况下(6,7]。化疗方案目前基于阿霉素/异环磷酰胺或多烯紫杉醇/吉西他滨(8,9),和新协议批准用于治疗包括物质如trabectedin和pazopanib [10- - - - - -12];但没有有效的靶向治疗。5年总体存活率在晚期仍然贫穷,和总体生存中值范围45至92个月(13- - - - - -15]。

放大和超表达的到在LMS已报告在过去(16),和其他活动等RB1删除和CDKN2A描述了启动子甲基化(17,18]。具体到和CDK6抑制剂,如palbociclib,提供了一个新的潜在目标在底层p16-CDK4/6-Rb通路(p16通路)palbociclib以来批准用于治疗乳腺癌和显示有利结果i ii期临床试验中不同类型的癌症,如套细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脂肪肉瘤,黑色素瘤,生殖细胞肿瘤(19- - - - - -25]。在老鼠中,有利的影响被观察到抑制平滑肌肉瘤(26]。此外,弗朗西斯等人表明palbociclib导致逮捕一个可逆的G₁阶段的细胞周期,Rb-positive细胞系SK-LMS-1和ht - 1080更敏感的代理工作优先s g₂相如阿霉素和WEE1激酶抑制剂在异种移植模型(27]。然而,这种现象的潜在机制还没有研究平滑肌肉瘤样本原位。我们旨在解剖分子基因组学在LMS,确认在LMS p16的作用途径在体外,最终分离一个潜在的响应者表型palbociclib LMS患者治疗的患者包括初级LMS、复发和转移的分析。

2。材料和方法

2.1。平滑肌肉瘤组织银行

石蜡块LMS样本99名患者可以从存档病理学研究所的,德国乌尔姆大学。24子宫肿瘤的起源与75 nonuterine肿瘤。从这些,20兴起于腹膜后腔和55在其他组织网站本地化(补充表S3)。

诊断时的平均年龄为60.3岁(范围:27 - 85年);39例男性和60女性。原发肿瘤大小不同的0.3到30厘米;61例转移性疾病。后续的数据来自98名病人:33还活着(平均随访时间:41.9个月)。诊断是根据组织学亚型(2013)和确定GII / GIII LMS在大多数情况下(GI, ;GII, ;GIII, )根据联邦国家des中心de Lutte靠le癌症(FNCLCC)评分系统。LMS病人样本pseudonymized符合德国法律管理档案组织临床研究的正确用法。所有实验符合赫尔辛基宣言和伦理委员会的指导方针的联邦综合医学委员会(28),和当地伦理委员会批准的这项研究是乌尔姆大学的(人类使用存档材料03/2014)。

2.2。CNV分析使用OncoScan FFPE Express 2.0数组

该方法结合了分子倒转探测技术与SNP检测。它提供了全基因组覆盖率∼330000探针,探针密度1探针/ 0.5 - 2 kb 201肿瘤抑制基因和致癌基因以及中间的支柱1探针/ 9 kb。我们分析了18石蜡LMS样本9不同的病人。拷贝数调用使用托斯卡纳和SNP-FASST2算法自动计算。电话是基于软件的默认阈值,为SNP-FASST2日志₂比例分类如下:高1.2副本获得,一个副本获得0.3−−0.3,损失和纯合子拷贝损失1.2。托斯卡纳的算法,只可调高复制得到调用,和默认阈值4副本总数是用来制造这些调用。

2.3。在体外实验

为我们的在体外研究中,我们使用了两个商用细胞系SK-LMS-1(由Karlisch et al .,妇产科,Marien医院威滕,威滕,德国)(29日)和SK-UT-1(从CLS细胞系购买服务GmbH德国,德国)。对于抑制实验,选择到/ CDK6抑制剂palbociclib (PD 0332991)使用。作为免疫印迹分析,控制我们使用海拉细胞(Leibniz-Institut DSMZ,波鸿,德国)。的pcr细胞系完成使用GenomeLab STR底漆集工具包(贝克曼库尔特,Krefeld,德国)和AmpliTaq黄金DNA聚合酶(生活技术,卡尔斯巴德,CA)。

2.4。免疫印迹分析

以下使用抗体:到(1:1000 dcs - 31.2, Zytomed系统,柏林,德国,603 - 1840),CDK6(英国剑桥1:1000、Abcam ab54576), Rb(1: 2000年,4 h1,细胞信号技术,丹弗斯,9309年),Phospho-Rb (Ser780 1: 1000年,细胞信号技术,9307),p16 (JC8 1: 500年,圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX, sc - 56330), ERK2(1: 2000年,碳14,圣克鲁斯生物技术、sc - 154),和β微管蛋白(1:2000年,浴缸2.1,西格玛奥德里奇,T4026)。

2.5。细胞计数

SK-LMS-1亚文化,接受100 nmol / l和1000 nmol / l palbociclib。盘子被随机分为3种不同的组,和自动执行的一组细胞计数每24小时3天使用Vi-CELL(贝克曼库尔特)。三个独立的实验进行。

2.6。流式细胞仪分析

在三个独立的实验中,SK-LMS-1细胞系被视为高于100 - 1000 nmol / l palbociclib 24和48小时。分析使用FACSCalibur (Becton Dickinson,富兰克林湖,新泽西),和数据分析与CellQuest软件(正)。

2.7。MTS细胞增殖试验

CellTiter 96水一个解细胞增殖测定Promega(菲奇堡,MA)是用来确定细胞生存能力。SK-LMS-1 SK-UT-1细胞种植在96孔板和孵化palbociclib浓度增加(0 - 1000 nmol / l)的媒介。经过3天的孵化在37°C, MTS添加到介质,吸收为490 nm使用microtitre板读者如前所述[30.]。MCF7 CAL51细胞作为积极的和消极的控制如前所发表(31日]。

2.8。鱼的分析

25例34个样本进行调查到放大。一个标准的鱼协议与Kreatech一起使用到(12问题)/ SE 12鱼类探测器(徕卡生物系统,位于德国,kbi - 10725)。在每个幻灯片,从100种不同的核分析荧光信号,的数量的比率到信号的着丝粒计算12信号。ZytoLight规范CDKN2A /岑9双颜色探测器(ZytoVision、不来梅港、德国,z - 2063 - 50)和Vysis LSI 13 (13 q14) SpectrumGreen探针(雅培分子、德斯普兰斯,08年l67 - 020)被用于细胞系SK-UT-1 SK-LMS-1。

2.9。免疫组织学

组织部分2µm代表石蜡块染色。简要为抗原检索,部分加热在柠檬酸缓冲在pH值6船20分钟。中使用的主要抗体是below-cited浓度磷酸缓冲盐(PBS);幻灯片和50孵化µl每部分在一个潮湿的室在室温下30分钟。作为一个检测系统,我们使用了想象工具包(美国Dako Carpinteria, CA)根据制造商的协议。细胞染色显示阳性的比例分类如下:“没有染色检测”(−);“30%染色”(+);“染色在30%以上和70%”(+ +)和“染色在70%以上”(+ + +)总数的肿瘤细胞分析。

以下使用抗体:到(1:100年,Zytomed系统),CDK6(1: 100年,Abcam) Phospho-Rb (Ser780;摘要细胞信号技术),p16(1: 100年,圣克鲁斯生物技术),ki - 67(1: 200年,克隆MIB-1 Dianova,汉堡,德国),和裂解caspase-3 (Asp175, 1: 1005 a1e,细胞信号技术,9664)。

2.10。统计分析

单向方差分析进行使用GraphPad棱镜软件版本6 (CA)圣地亚哥。SPSS 24.0统计(、IBM、纽约Armonk)是用于临床随访分析。我们执行kaplan meier分析结合Mantel-Cox测试和皮尔逊相关系数进行临床和病理参数。结果与被认为是具有统计学意义。重要性水平表示的数据如下: , , ,和 。

3所示。结果

18个样本分析包括肿瘤站点从九个不同的患者(3子宫和6 nonuterine)。从这些,七有先进的疾病(两个复发和五个转移),而剩下的两个患者局部肿瘤控制的分析(补充表S2)。

拷贝数变异(CNV)的分析表明在大多数情况下,大量的基因改变。拷贝数的平均值称为/样本在所有样本如下:243总畸变,74年亏损,132年收益,33高副本收益和损失4 biallelic副本。

主要肿瘤( )263年平均总畸变/样本88份损失,139年收益,30高副本收益,损失7 biallelic副本。转移( )227年平均总畸变有64份损失,121年收益,40高副本收益,损失2 biallelic副本。复发( )224年平均总畸变,56份损失,149年,17个高副本收益,损失和2 biallelic副本。

比较子宫和nonuterine肿瘤显示如下:子宫肿瘤( )220年平均总畸变/样本68份损失,127年收益,23高副本收益,损失2 biallelic副本。Nonuterine肿瘤( )与77年258总畸变/样本复制损失135副本收益,40高副本收益,损失和6 biallelic副本。复发性区域(截止< 25%,值< 0.05)染色体复制高收益确定在12和17(表1)。

该地区q14.1涉及到12日到轨迹,放大在5/18(27.8%)的样品,对应于2/9(22.2%)的患者(图1)。在第二步中,我们调查了这个发现在一个更大的群体;为此,鱼进行了分析到具体的调查。鱼的分析到显示放大4的25例(14.7%)。

分析的作用途径,我们进行免疫印迹分析两个细胞系SK-LMS-1和SK-UT-1。细胞系的来源证实了STR(补充表结果S4)。如补充图所示S1A,CDK6 SK-LMS-1表示到,Rb, p16蛋白是缺席。SK-UT-1显示到表情,但显示只有非常微弱的Rb蛋白和强劲的p16的表达。因此,SK-LMS-1被选为在体外palbociclib抑制模型。

通路分析,我们进行了免疫印迹分析SK-LMS-1与palbociclib孵化后。与不同浓度的palbociclib抑制后2天,我们发现明显减少p-Rb (Ser780)和持久Rb-expression palbociclib浓度增加(补充图印地)。这些发现表明,palbociclib块的有效途径。

在另一种方法,我们对待SK-LMS-1细胞如上所述,通过流式细胞仪进行细胞周期分析。补充图S2A显示了G的增加₁阶段和下降和G₂阶段。的sub-G₁阶段仅略有增加,没有检测到凋亡细胞裂解caspase-3染色(补充图S3B)。通过直接培养SK-LMS-1细胞玻璃幻灯片,我们研究了palbociclib对细胞形态的影响。如补充图所示3 c,有扩大多核的细胞的数量,这是一个观察衰老细胞形态学变化。我们进一步研究了palbociclib对细胞生长的影响,因此进行为期3天的治疗的效果100 nmol / l和1000 nmol / l细胞计数。补充图开通表明,治疗会导致降低扩散在比较处理未经处理的细胞,这种效应是浓度依赖性。这些发现符合我们immunocytological数据,因为我们观察到减少ki - 67治疗细胞染色(补充图S3A)。

对于SK-LMS-1, IC₅₀palbociclib价值是318.2 nmol / l。孵化的SK-UT-1 palbociclib没有效果(图2)。鱼SK-LMS-1分析显示70%的相对损失CDKN2A地区,一个放大的到5份,2RB1基因复制。在SK-UT-1,我们看到一个正常的CDKN2A星座和2份到和一个副本删除RB1。

在我们OncoScan病人组,基因扩增是伴随着过度到样品(4)和CDK6样本(2)。Biallelic损失RB1和CDKN2A蛋白质水平上的每个损失转化为在一个样本证实假设基因剂量效应蛋白轴(补充表S1)。

比较我们的在体外发现与病人组织样本,p16的免疫组织化学染色,到,CDK6, p-Rb (Ser780)每个样本进行更大的患者群99 159肿瘤样本。每个样本的队列是得分如上所述关于p16的表达,到,CDK6, p-Rb (S780)。从159年检查样品,92例(57.8%)阳性,到CDK6 138(86.8%), 90年为p-Rb (56.6%)。p16在54负(34.0%)样品和低于10%≤7(4.4%)样品。在我们的基础在体外结果,我们定义了四种类型的LMS得分从0到3的表达谱,和潜在应答类型分类如前所述31日]。因此,潜在nonresponder类型(类型0)被定义为超过10%的肿瘤细胞p16的表达情况,缺乏p-Rb分子,或到和CDK6的缺失。最好的假设响应者剖面的特征是表达p-Rb (S780)在70%以上的细胞(+ + +)。其他类别描述为p-Rb免疫反应性(S780)阳性细胞百分比的增加:0 = p16阳性> 10%;p-Rb阴性;到、CDK6负面;1 = p-Rb +;2 = p-Rb + +;3 = p-Rb + + +。上面的结果应用到我们的群,我们确定32 159样品(20.1%)为潜在的反应(图3)。使用以上概要响应,概要样本分层如下:14(1型),13(2型)和5(类型3)。进一步分层肿瘤站点,我们报告主要肿瘤( )为CDK6阳性为60.0%,到85.0%,p-Rb的60.0%,p16在10%≤37.5%。因此,22.5%合格的样品(18)的主要肿瘤潜在的反应。分层,这导致7 1型、2型,7和4 3型反应者。复发( )到阳性,CDK6, p-Rb在29.4%,64.7%,52.9%和52.9%,分别和p16蛋白表达≤10%。从这些数据,我们得出这样的结论:17.6%(3样本)的复发有资格作为潜在的反应者,1 1型、2型和2。转移( )到阳性,CDK6, p-Rb在62.9%,95.2%,35.5%和53.2%,分别和p16蛋白表达≤10%。综上所述,17.7%(11样品)的转移通过潜在的反应,包括6个1型,1 4 2型和3型应答。

vs nonuterine比较子宫平滑肌肉瘤显示如下:子宫肿瘤样本( )是积极的,到CDK6, p-Rb在65.2%,87.2%,和73.9%,分别;30.4% p16蛋白表达≤10%。综上所述,21.7%(10个样本)的子宫肿瘤有资格作为潜在的反应;4分为1型LMS, 5 2型,和一个3型。相比之下,nonuterine肿瘤样本( )到阳性,CDK6, p-Rb在54.9%,86.7%,和49.6%,分别表达p16蛋白10%≤41.6%。从这些,我们得出这样的结论:nonuterine肿瘤样本符合潜在反应者19.5%(22个样本)。进一步分析分层nonuterine LMS 10 1型,2型8例,和4 3型反应者。

鉴于个体患者的多个样本包括一个或多个患者积极的示例响应器配置文件被视为潜在的反应。这个确定29 99名(29.3%)患者的潜在的反应。此外,我们调查的影响主要肿瘤位点与潜在的响应者表型和发现潜在的反应患者的比例是高例子宫肿瘤(10/24,41.7%)比在腹膜后肿瘤(4/20,20.0%)或四肢和躯干(7/39,17.9%)。

临床随访数据来自98名病人。中位总生存期是4.21年。比较小的肿瘤(≤5厘米)和大肿瘤(≥5厘米)显示肿瘤大小对生存时间的影响,生存中值为9.13和3.61,分别在两组。诊断年龄细分为≤60,> 60年。在这些组中位总存活数是6.89比2.49年。总体生存中值女性(3.65年)显著短于男性(8.82年)。扣除妇产科肿瘤的患者显示相同的结果改变了3.38年的女性患者的中位总存活数。

组子宫平滑肌肉瘤的中位总存活数是5.34年相比,7.08年的nonuterine平滑肌肉瘤(无统计学意义 )。记录转移或复发患者往往比那些没有的平均总生存期较短(无统计学意义 )。潜在的应答状态,ki - 67指数、组织学分级、对生存和初级肿瘤位置没有影响,也没有转移(肺、肺外)的位置。

我们看到了ki - 67指数之间的相关性和组织学分级( )。之间没有相关性可见ki - 67指数和肿瘤大小。

4所示。讨论

LMS是一个高度侵略性的肿瘤具有高发病率和死亡率;因此需要新的临床治疗方法。我们已经建立了一个群主LMS转移和复发包括肿瘤组织的银行。我们报告一个4.21年的中位总存活数我们的LMS队列,在一个相似的范围内的其他研究[13- - - - - -15]。我们观察到肿瘤大小作为一个独立的预后因子之前报道(32]。虽然组织学分级被广泛认为是一个独立的预后标记在肉瘤(33),分级组之间没有差异生存曲线在我们组是可观测的。然而,这一发现的缺乏可能是归因于队列的大小。LMS的分子发病机制仍然知之甚少,先前的研究已经强调了缺乏一致的结果,和基因组的复杂性变化在LMS (34]。我们的DNA微阵列数据证实这一发现和文档没有区分的整体模式LMS遗传学(1,18]。在我们的研究中,我们分析了多个纵向样本个体病人,因此能够观察到随着时间的推移,这些肿瘤。这些数据表明在病人的肿瘤异质性和引出需要重复测试的疾病。我们发现畸变的主要肿瘤发生率高于在复发和转移,以及类似的结果也出现乳腺癌[35]。全基因组筛查放大显示复发模式LMS的畸变。这种模式的特点是频繁的放大在染色体12 q14.1 12最喜欢,和17 p12,包括基因等AGAP2,到,IL22,RAP1B,TSPAN31,MAP2K4,MYOCD。这些基因参与肿瘤发生,细胞生长,细胞迁移、分化和肌肉36- - - - - -39]。一个有前途的候选人发现被放大到在2 9例。到放大和连续过度曾被报道在平滑肌肉瘤,尽管如此,与脂肪肉瘤,这些发现似乎不太常见的(16]。到是一个关键的调节细胞周期进展,和底层p16途径因此经常改变在各种类型的癌症40- - - - - -43]。删除的13个p地区,包括RB1轨迹,在LMS的子集(44],LMS产生遗传性视网膜母细胞瘤被描述的设置(45,46]。两个的LMS细胞系,SK-LMS-1和SK-UT-1特征对分子参与这个途径。在基因层面上,我们看到的损失CDKN2A在SK-LMS-1和RB1基因型被确定为RB1+ / +RB1+ /−SK-LMS-1和SK-UT-1分别。在研究Coschi et al ., SK-LMS-1报道RB1+ /−和SK-UT-1RB1−−[/47]。STR资料证实我们的细胞系的起源,因此我们认为这些变化不同的积累或异构RB1基因型。在蛋白质水平,我们缺乏SK-LMS-1 p16的报告,但Rb和下游分子到CDK6, p-Rb表达;这是符合先前的报道显示功能Rb蛋白SK-LMS-1 [47]。相比之下,没有观察到Rb表达SK-UT-1结合p16蛋白的表达。这些发现证实数据弗朗西斯等人的细胞系SK-LMS-1 [27]。

损失与p16的强劲growth-inhibitory影响乳腺癌和结肠癌细胞,而高水平的p16是代孕的标志Rb损失,以及两者的结合被证明与无效palbociclib治疗(48,49]。由于有缺陷的p16在SK-LMS-1通路,这个细胞系是药物抑制这个途径的具体分析到/ palbociclib CDK6抑制剂。我们确认数据的弗朗西斯等人表明,Rb磷酸化是剂量依赖性的方式减少palbociclib治疗后的细胞系;符合这一观察,我们不断看到细胞生长速率的降低我们的细胞计数实验(27]。作为周期进展CDK4/6扮演重要的角色,我们预测,在这种背景下,LMS细胞的生长抑制作用应该导致一个独家块G₁阶段检查点。我们确认这个情况,观察选择性G₁阶段增加由此减少的细胞和G₂阶段。基于palbociclib的作用机制,抗癌活动主要是通过细胞周期阻滞,细胞凋亡似乎没有关键事件(31日,48]。符合这一发现,我们看到一个小sub-G增加₁阶段,没有看到凋亡活动,如图所示的缺席增加裂解caspase-3免疫组织化学。此外,我们确认palbociclib-treated细胞发生形态变化,如多核细胞的形成,它被描述在衰老的背景下(50]。这一发现与先前的研究,分析了这种途径在LMS细胞系SK-LMS-1摘要脊索瘤、乳腺癌和其他肉瘤(21,26,27,31日,48]。我们的研究证实,扩展知识已经发表的数据显示的积极影响palbociclib平滑肌肉瘤细胞系和平滑肌肉瘤样异种移植小鼠的移植(26,27]。没有抑制作用被SK-UT-1,确认之前所要求的有效palbociclib治疗。

最后,我们分析p16的表达,到,CDK6,和p-Rb样本,为了检测潜在的治疗应答表型palbociclib和随后将这些发现与细胞系已知反应治疗。我们分类的患者样本组根据治疗反应或nonresponders的概率。应答器组的特征是p16消极和p-Rb和到或CDK6。如果不能够实现所有这些标准,分为nonresponder样,,相比之下,也表现为p16积极性或没有到和CDK6 p-Rb [31日]。所有的平滑肌肉瘤患者中,65.7%是积极的到和CDK6。然而,近三分之一的患者(31.3%)有p-Rb分析蛋白质的消耗,因此这些患者必须被视为不适合潜在palbociclib治疗。其他肿瘤样本显示的表达到,CDK6 p-Rb蛋白质而且p16的表达,这与palbociclib无效,因此这些患者视为潜在nonresponders。

最终,我们的一位(29.3%)的患者数量符合所有的标准功能p16轴,使这些患者治疗的潜在反应细胞周期palbociclib等激酶抑制剂。大型队列允许我们分析成对个体病人的肿瘤样本收集的141个月。我们发现的各种成分的表达p16途径可能不同。这强调了多次的重要性评价蛋白质概要文件当搜索palbociclib等可能的治疗方案。后者获得FDA批准用于治疗转移性乳腺癌(2016年2月51),研究了在不同的临床试验研究其有效性在各种其他类型的癌症,如套细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、生殖细胞肿瘤,nonsmall细胞肺癌肉瘤和去分化脂肪肉瘤在阶段i ii。这些研究表明在无进展生存有利的影响,和治疗显示只有温和的副作用20.,23- - - - - -25,52,53]。因此,我们的数据可能被认为是一个新的治疗方案的起点,如palbociclib LMS。

5。结论

平滑肌肉瘤的治疗(LMS)是具有挑战性的,关于靶向治疗已经取得了什么进展到目前为止。

在这项研究中,我们发现到放大作为经常性变更在LMS全基因组的方法。在LMS分析到的作用,我们研究了LMS细胞系SK-UT-1 SK-LMS-1。两线表达到,此外,SK-LMS-1强烈CDK6阳性。p16蛋白没有在SK-UT-1 SK-LMS-1但不是。因此,在SK-LMS-1中,p16的缺失导致通用p16通路的激活。我们进一步研究是否这条通道在这些细胞系被到/ CDK6抑制剂。我们确认在SK-LMS-1,抑制palbociclib导致强烈的Phospho-Rb下降(Ser780)蛋白质含量,减少细胞增殖,G₀/ G₁步被捕。比较我们的在体外发现与病人组织样本,p16,到,CDK6, p-Rb免疫组织化学染色法测定分析大型LMS的队列(159个样本)患者进行分配一个潜在的响应者表型每个病人,我们发现99年29个(29.3%)病人。这些数据表明,CDK4/6抑制剂可能为靶向治疗提供了新的选择LMS病人的一个子集。

数据可用性

在这项研究中提出的所有数据都可以在合理的请求通过联系相应的作者。

的利益冲突

作者声明没有潜在的利益冲突。

确认

对于优秀的技术援助,我们感谢奥尔加·里兹Iwona Nerbas,茱莉亚Melzner,莉娜Kelsch, Juliane内尔,和麦克拉巴克。我们还要感谢CCCU肉瘤中心乌尔姆。特别感谢去妇产科学系Marien医院威滕提供SK-LMS-1细胞。

补充材料

补充图S1:免疫印迹(A)免疫印迹分析LMS细胞系SK-LMS-1和SK-UT-1 p16 Rb通路蛋白质,CDK6,到,p16与海拉细胞相比。β微管蛋白作为加载控制。(B)的抑制试验SK-LMS-1 24和48小时palbociclib浓度范围从100 - 2000 nmol / l。第二行从上面显示浓度降低p-Rb (Ser780)。ERK2显示为加载控制。补充图S2:流式细胞仪和细胞计数(A)流仪细胞周期分析SK-LMS-1 palbociclib 24和48小时后抑制。 , ,和 。(B)细胞计数SK-LMS-1图。孵化与100和1000 nmol / l palbociclib长达3天的浓度,其次是每24小时自动细胞计数。补充图S3:微观SK-LMS-1 palbociclib抑制后的结果。左边显示的是未经处理的样品进行比较。(一)治疗细胞显示减少ki - 67的表达抑制增长。(B)裂解caspase-3染色显示没有凋亡的活动。(C) May-Grunwald-Giemsa(“万人迷”女友)染色的细胞直接种植在显微镜幻灯片。治疗细胞显示形成多核细胞。酒吧:100µm。补充表S1:基因状态的相关性和蛋白质的p16的表达途径。对于每一个样本,OncoScan调用高收益和副本biallelic损失相比,积极通过免疫组织化学染色细胞的百分比。缩写:P,主要肿瘤;米,转移;R,复发;T,肿瘤类型;人类绒毛膜促性腺、高获得复印件;提单,biallelic损失;包含IHC,免疫组织化学。补充表S2:样本的概述Affymetrix OncoScan队列。 Uterine-derived tumours are marked with asterisks. Supplementary Table S3: Clinical data table. Age, gender, and primary tumour grading for each patient are given. Available data on primary tumour size (in centimetres) and documented metastasis are outlined alongside life status and observed survival. Abbreviations: f, female; m, male; 0, alive; 1, dead; OS, overall survival. Supplementary Table S4: STR profiles of leiomyosarcoma cell lines. Comparison of STR profiles from ATCC and ExPasY database to cell lines used in our in vitro experiments. Matching STRs are highlighted by green background.(补充材料)