文摘

尽管许多癌细胞有明显高于铜浓度与正常细胞和组织相比,铜的作用在癌症生物学和转移性疾病仍知之甚少。在这里,我们研究了铜在骨肉瘤的重要性,经常转移到肺部和往往是chemoresistant。K12和K7M2鼠OS细胞不同转移表型:K7M2高度转移,而K12的所以要少得多。使用原子吸收测定细胞内铜水平。铜转运蛋白被qPCR量化。阿霉素的细胞毒性、戒酒硫和氯化铜(II)与细胞荧光染色可行性评估。此外,K7M2活细胞计数测定台盼蓝排斥染色后72小时的治疗。发现铜含量明显高于K12的OS细胞比K7M2细胞。qPCR表明K12的细胞移植铜泵CTR1涌入以及表达下调铜相比,射流泵ATP7A K7M2 OS细胞。联合治疗的氯化铜(50 nM)与戒酒硫(80海里)只有K12的细胞的细胞毒性。 Triple treatment with doxorubicin, disulfiram, and copper displayed potent and durable cytotoxicity of highly metastatic K7M2 cells. We demonstrate here that murine OS cell lines differing in metastatic potential also vary in endogenous copper levels and regulation. Additionally, these differences in copper regulation may contribute to selective cytotoxicity of K12 cells by extremely low doses of copper-potentiated disulfiram. The combination of doxorubicin, disulfiram, and copper should be explored as a therapeutic strategy against OS metastases.

1。介绍

骨肉瘤(OS)是最常见的原发恶性肿瘤的骨骼和主要影响儿童和青少年。实际上,所有的转移性肺疾病,最终导致病人死亡。仅仅通过手术前化疗时代,5年存活率仅为10 - 20%。现代治疗模式采用新辅助化疗(术前)、手术和辅助化疗(术后)。细胞毒性化疗和手术切除的结合提高了5年生存在大多数大型系列大约65%。尽管一些化疗药物用于治疗操作系统,阿霉素(阿霉素)充当OS化疗几十年来的支柱。阿霉素被认为是不可或缺的组件为全球治疗操作系统(1- - - - - -12]。

增加阿霉素治疗操作系统有显著提高的结果,但热情是有限的几个现实。最重要的是,孩子们的预测与操作系统没有改善在三十年尽管多个临床试验(13- - - - - -17]。孩子出现肺转移的诊断,或开发的过程中他们的治疗,尤其是可怜的预测15 - 30%的5年存活率(6]。此外,儿童生存OS付出了沉重的代价。阿霉素非常cardiotoxic,导致剂量依赖性心肌病导致充血性心力衰竭和死亡。最近两次的评论长期儿科肉瘤幸存者发现严重毒性的发生率(26%和28%18,19]。因此,两个最大的障碍,防止改进操作系统病人的预测是:(1)缺乏专门针对操作系统的治疗转移性生物,和(2)有害的长期后果的强力霉素治疗OS幸存者。传统操作系统的细胞毒性化疗方案的疗效可能达到了顶峰,迫使更多的生物智能的应用方法。

K7M2和K12的小鼠OS细胞系都源自同一父母的肿瘤在Balb / cJ鼠标。K7M2积极转移到肺,而K12显示弱转移表型。随着这些细胞系是无性生殖相关但显示截然不同的转移能力,他们是一个简单而强大的工具来研究操作系统转移生物学(20.,21]。以前的工作从我们组利用K7M2和K12的识别和调查因素赋予转移潜力OS细胞(22- - - - - -25]。K7M2细胞表达和产生显著更多的癌症干细胞标记乙醛脱氢酶(ALDH)与K12的细胞相比,表明ALDH是操作系统的一个转移相关因素23,24,26]。ALDH使OS细胞抵抗氧化应激,OS细胞高ALDH表达更能动的和侵入性较低的比OS细胞ALDH的表情。这些发现使我们调查的能力ALDH抑制剂,戒酒硫(Dis),改变操作系统的转移表型细胞。我们观察到Dis呈现OS细胞更容易受到氧化应激、细胞形态学改变的操作系统,减少了他们的生存能力和侵袭性。我们还演示了培养细胞的剂量依赖性的细胞毒性说骨肉瘤患者从我们的诊所27]。

铜(铜)是一个重要的微量营养素的生理氧化还原反应和同样重要的致癌过程入侵和转移(28,29日]。许多肿瘤条件显示更高水平的内生瘤内铜相比,正常细胞和组织(30.,31日]。更积极的和chemotherapy-resistant疾病患者已经证明血清铜水平升高(30.,31日]。一些基础和临床研究表明,说的抗肿瘤活性增强的铜(II)化合物(28,32- - - - - -37]。然而,铜代谢差异评价低品位和高转移性肿瘤,这直接关系到Dis +铜(II)的成功治疗没有被探索。

在这个报告中,我们调查了不同的铜代谢和Dis + CuCl2K12 K7M2细胞之间的治疗。细胞内铜水平的K7M2和K12的细胞有或没有治疗也被测量。我们也决定基因的表达水平与铜运输和化疗抵抗。最后,我们测试了CuCl的能力2改变的力量说治疗小鼠OS细胞,以及Dis + CuCl的潜力2降低阿霉素的细胞毒性剂量。我们假设操作系统与不同转移潜能细胞具有不同的内生铜水平和基因表达模式发生改变有关铜代谢及耐药性。我们怀疑铜会改变OS细胞Dis-mediated毒性的易感性,这说+ CuCl的结合2可能允许阿霉素剂量较低的细胞毒性。

2。材料和方法

2.1。细胞系和细胞培养

高转移性OS K7M2细胞系从写明ATCC购买,和K12的细胞被慷慨地提供的集卡纳博士在美国国家癌症研究所的儿科肿瘤学分支。两个细胞系被送到IDEXX生物学研究实验室来检测病原体的存在和支原体,种间污染,STR分析明确证明积极的身份无性生殖相关的OS细胞系。细胞系都使用相同的培养基和种植和维护条件。细胞生长在T75烧瓶(康宁)血压得到较好的控制与DMEM培养基(康宁)补充10%的边后卫(Gibco)和1%青霉素和链霉素Ab的解决方案(Gibco) 37°C湿润孵化器。

2.2。原子吸收光度铜分析(AA)

∼80% confluency,细胞系都用无菌杜尔贝科的磷酸缓冲盐(dPBS)和处理TrypLE (Gibco) 8分钟37°C。细胞被给定的边后卫(Gibco)包含文化媒体和离心机在1500 rpm 6分钟。细胞颗粒与冰洗冷,无菌dPBS (Gibco),使用一个自动细胞计数和细胞计数得到(Bio-Rad)。细胞被洗又冰冷dPBS,离心机,干电池丸是储存在−80°C。此外,K7M2和K12的治疗与Dis(3超过24小时μ米),CuCl2(1μ米),说+ CuCl2(0.1和0.25μ米)然后在与未经处理的细胞相同的方式处理。

铜浓度测定使用珀金埃尔默AAnalyst 600原子吸收分光光度计检测调整铜(324.8海里)。原子吸收光谱法是作为无焰炉操作系统。校准样品被稀释准备HNO铜储备溶液为1%3生成的浓度20、50、100、200、500和1000 ng / mL。质量控制样品准备在60岁时,400年,800 ng / mL。

修改器解决方案(不包括0.1% Pd和0.06%毫克3)2在水里,混合1:1 (v / v)与示例之前注射10μl .温度编程是按说明书。细胞颗粒(最低2·105与35个细胞)细胞溶解μL 0.25%卫。一个5整除μL是测定蛋白质使用Bio-Rad化验后,制造商的指令以牛血清白蛋白为标准。进一步的30μL细胞溶解产物与30孵化μL 63%的HNO3一夜之间60°C。接下来,与40个样本稀释μl 0.2%的HNO3与修饰符和明年稀释。其他任何稀释的样品(之前添加修饰符)HNO完成0.2%3。最后在媒体样品中铜的浓度计算总数μ克/毫升。细胞内铜浓度计算:(最终样本浓度的铜(ng / mL)) /(总样品蛋白质浓度(毫克/毫升))和记录为ng·铜/毫克的蛋白质。

2.3。定量聚合酶链反应

信使rna从K12的收集,K7M2使用RNeasy工具包(试剂盒),并使用逆转录酶互补脱氧核糖核酸得到装备(应用生物系统公司)。qPCR使用SYBR执行绿色Supermix (BioRad)。禁例,Rps17 Rps18参考基因选择从我们以前的工作38为最稳定的表现在多个小鼠细胞和组织类型。三角洲的几何平均CT值来自三个选定的管家基因。之间K12基因差异表达和K7M2决心铜流入泵(CTR1)和铜射流泵(ATP7A),乙醛脱氢酶(ALDH),和22种代号为ABCB1的()。

2.4。细胞毒性检测

K12和K7M2镀在斯达克96 -孔板(分别为5000和10000个细胞)和培养24小时。媒体与褶皱取代培养基稀释的强力霉素,CuCl2,说(1 nM-10μ米)。此外,说折叠稀释测试结合固定CuCl浓度2(50、200和800海里)。24小时后药物,细胞染色与哺乳动物的生活/死细胞生存工具包(表达载体)。与尼康显微镜的细胞进行ECLIPSE TE2000 U北部使用ECLIPSE的软件。生活从未经处理的控制信号减少(%)决心使用斐济图像平均荧光强度。

2.5。K7M2细胞毒性和恢复化验

镀K7M2细胞(0.1×106)6-well盘子和培养24小时。细胞治疗与CuCl超过72小时2(0.12 - 2μ米),Dis (0.5 4μM)、阿霉素(0.02 - -1.2,10μ米),Dis (0.12 - 2μ米)+ CuCl2(0.12 - -0.25μ米)。与dPBS细胞被洗,处理100μL TrypLE表达,resuspended文化媒体。活细胞计数得到用台盼蓝排斥试验和血细胞计数器。对待K7M2 recultured新媒体没有药物6-well板块和监控细胞的强劲复苏。此外,K7M2服用亚致死剂量的阿霉素(100海里),Dis(100海里),CuCl2(250海里),联合治疗,联合治疗的三倍。

2.6。统计数据

所有的统计方法进行使用Prism 7.0 (GraphPad,拉霍亚CA)。多个组使用一个普通的单向方差分析比较。两组使用一个未配对比较t以及。在所有情况下, , , ,和 被认为是重要的,因为在每个图表示。

3所示。结果

3.1。少转移K12 OS细胞显示更高的内生和治疗水平的细胞内铜与高转移性K7M2相比

我们第一次评估内源性细胞内铜水平差异无性生殖相关小鼠OS细胞株不同于转移性潜在使用原子吸收分光光度法(AA)。细胞内铜水平被发现在low-metastatic K12 OS细胞显著高于高转移性K7M2(图所示1(一))。原子吸收分光光度法也进行的边后卫多用于所有实验,,DMEM培养基(与10%的边后卫DMEM),和文化媒体包含Dis (3μ米),CuCl2(1μ米),说+ CuCl2(0.1 + 0.25μ米)(图1 (b))。不出意料,铜被确认为主要来源的边后卫在我们的细胞培养。K12的和K7M2都说,对待CuCl2,说+ CuCl2超过24小时。细胞内铜K12的浓度明显高于K7M2治疗后与1μM CuCl2和100说+ 250 nM CuCl2(图1 (c))。说+ CuCl2对待K12的细胞显示显著增加细胞内铜水平相比其他K12的治疗组。说+ CuCl2对待K7M2没有显示显著增加铜水平相比其他K7M2治疗组(图1 (c))。

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图1
小鼠OS细胞系K12显示更高水平的细胞内铜K7M2相比。无性生殖相关操作系统细胞系(K12和K7M2)在相同的条件下培养,然后收集蛋白质量化和细胞内铜使用原子吸收(AA)分光光度法分析。(一)低转移性K12细胞细胞内铜水平显著高于K7M2显示 。(b) AA的分析包含Dis(3媒体组件和媒体μ米),CuCl2(1μ米),说+ CuCl2(0.1和0.25μ分别为M) 。(c)和K12的K7M2细胞培养或媒体说,对待CuCl2,或说+ CuCl2在剂量之前AA测试 。铜分析使用三个独立培养和处理样品。 ; 。
3.2。显著改变表达水平在铜泵和药物抗性因素K12 K7M2细胞中观察到

由于显著差异在内源性细胞内铜水平之间K12 K7M2,我们接下来进行定量PCR比较基因表达水平差异对铜调控和重要函数在两个操作系统细胞系。qPCR表明高转移性K7M2细胞的转录水平有显著降低铜的流入泵CTR1与K12的(图2(一个))。相反,K7M2显示明显高于铜的转录水平射流泵ATP7A与K12的(图2 (b))。此外,我们测试记录转移水平的重要因素。符合我们之前的结果(25],qPCR显示更高的乙醛脱氢酶(ALDH)表达K7M2相比K12的(图2 (c))。有趣的是,K7M2还显示的表达明显高于ATP-dependent耐多药泵22种代号为ABCB1的()与K12的(图2 (d))。

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图2
K7M2显示改变表达式的铜流入和流出泵以及重要药物抗性相比K12的因素。K12和K7M2 OS细胞系在相同的培养条件的RNA提取处理。互补脱氧核糖核酸分析了生成qPCR OS细胞系和标准化之间的表达水平改变几何平均数的管家基因禁例,Rps17, Rps18。(一)铜流入泵CTR1 K7M2显著下调。(b)铜射流泵ATP7A K7M2与K12显著调节。(c)抗氧化酶和已知的癌症干细胞制造商ALDH显著调节相比,K7M2 K12的细胞。(d)此外,种代号为ABCB1的耐多药耐药性泵明显调节相比,K7M2 K12的细胞。分子分析使用技术进行了一式三份分别从三个养殖和加工样品 。 ; ; 。
3.3。CuCl2戒酒硫结果的增强作用显著的选择性细胞毒性K7M2 K12的细胞和少

鉴于ALDH的重大和戏剧性的upregulation K7M2表达式,以及细胞内铜水平K12的保留,我们测试了Cu-potentiated说这两个操作系统细胞株的细胞毒性,24小时。一般管理的蒽环霉素化疗药物阿霉素,显示在高剂量相当于细胞毒性K12的IC504.5μM和K7M2 IC505.2μM(图3(一个))。CuCl2没有明显细胞毒性在我们生活/死化验后24小时最大剂量(10μ(图)测试3 (b))。有趣的是,说作为一个单一的代理证明显著增加细胞毒性与K12相比K7M2 640海里。说治疗也更K12的细胞细胞毒性高剂量的5μM(图3 (c))。说单一疗法并没有减少K7M2活细胞信号超出10 50%未经处理的控制μm .添加一个固定CuCl 800海里2补充说在K12的IC治疗导致明显的增强作用5060 nM, K7M2 IC50120纳米(图3 (f))。进一步降低固定CuCl 200海里2补充也导致明显增强细胞毒性效应说的细胞系与K12的IC5050 nM和K7M2 IC5060 nM(图3 (e))。令人惊讶的是,说只有50 nM CuCl补充2导致明显的增强作用,有效减少细胞毒性剂量K12的细胞,以显著差异%住信号OS细胞系从80纳米到2.5之间μM(图3 (d))。这个剂量50 nM CuCl非常有限2补充,说IC50160 nM K12和4.4吗μM K7M2, /日志有效剂量的差异。

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图3
铜的强化低剂量戒酒硫K12的细胞K7M2相比细胞选择性的目标。K12的和K7M2细胞受到褶皱稀释的阿霉素(a), CuCl2(b),或说(c)单药治疗超过24小时。此外,细胞治疗说+ CuCl褶皱稀释2以固定浓度的50海里(d), 200海里(e),或800海里(f),治疗后细胞被沾住/死染色,显微镜图像。活的信号减少从未经处理的控制进行了分析使用斐济形象意味着荧光测量。50 nM CuCl2大大降低了信号在K12的%比生活在K7M2从80纳米到2.5μM说。所有的细胞毒性实验和三个独立的细胞培养技术一式三份 。 。
3.4。CuCl2强说要求低剂量阿霉素完全根除K7M2细胞在体外

评估长期治疗对细胞毒性的影响和细胞复苏的潜力高转移性操作系统更准确地说,K7M2治疗超过72小时单方和阿霉素的联合治疗,说,CuCl2。活细胞计数后,复苏细胞监测新鲜、免费治疗、文化媒体。K7M2没有显示任何细胞毒性在任何CuCl超过72小时2剂量(0.12 - 2进行测试μ米)(图4(一))。高剂量Dis (4μ米)K7M2活细胞计数降低超过90%超过72小时,但细胞可以生长在文化药物清除。所有CuCl2强说剂量组合测试可行K7M2细胞减少导致∼99%,但剩下的人口能够生长在文化药物后删除。K7M2细胞600 nM的阿霉素处理显示超过90%减少可行的细胞,无法生长在文化药物去除(图4(一))。我们对待K7M2超过72小时亚致死剂量的阿霉素(100海里),Dis(100海里),结合阿霉素和Dis (100 nM),说+ CuCl组合2(分别为100 nM和250 nM)和三的三种药物治疗。三重强力霉素治疗,说,CuCl2(100 nM、100 nM和250 nM)导致∼99%细胞死亡后72小时的治疗,而且,重要的是,不允许K7M2细胞生长在文化药物去除(图4 (b))。

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图4
联合治疗的阿霉素、戒酒硫和氯化铜有效减少K7M2细胞的生存能力,消除了复苏在体外。(一)与CuCl K7M2 OS细胞治疗2(0.12 - 2μM)、阿霉素(0.02 - -1.2,5μ米),Dis (0.5 4μ米),说+ CuCl2(0.12和0.25μ米)为72小时。治疗后,台盼蓝排斥染色进行活细胞计数。细胞培养在新媒体没有药物礼物和监控细胞的生长。与CuCl说强2显然杀死了大多数细胞超过72小时,但所有可能随后恢复文化。(b)强力霉素和Dis联合治疗也允许细胞复苏在体外,但三重强力霉素治疗,说,CuCl2导致超过90%的杀伤细胞在治疗期间和治疗后没有恢复药物清除。使用三个独立的细胞培养实验进行 。

4所示。讨论

在这里,我们研究了小鼠OS细胞内源性铜含量与不同转移潜能和证明K12的细胞有更高的内源性细胞内铜与高转移性K7M2细胞。评估铜代谢相关基因的表达水平和耐药机制还演示了改变之间的细胞铜转运蛋白水平两个细胞系,与K12的保留铜和铜在K7M2出口。最后,我们评估CuCl的能力2影响Dis和阿霉素的细胞毒性和发现联合治疗可以产生一个持久的,对高转移性K7M2细胞系细胞毒性的影响。

操作系统预测没有改善在几十年尽管多个临床试验,有力地说明我们目前Dox-based策略已达到其功效的极限。小说策略针对故意选择生物目标需要改善这些患者的预后。说的使用可以有多个可能的使用在改善治疗的成功转移操作系统。作为单一疗法,说可以帮助在螯合铜系统性发现在病人的血液,从而衰减Cu-associated转移机制的操作系统。说也可以用作chemosensitizer转移OS细胞,阻断ALDH抗氧化活性和提高ROS-inducing药物如阿霉素的疗效。

CuCl的能力2增加细胞毒性效果文献[Dis是有据可查的30.,34- - - - - -39]。使用这个组合有多个肿瘤临床试验(39- - - - - -43),但不是在肉瘤。我们已经证明,说有能力影响转移性肿瘤细胞的生存能力和转移表型在几个出版物(38),但我们和其他人都CuCl相结合2在肿瘤细胞直到现在说。易感性的差异说可能与铜代谢的差异有关,但确切的机制是对我们正在进行的研究和其他的来源。

Dox-based全球接受新辅助化疗和辅助系统治疗和护理标准是觉得负责改善操作系统生存与prechemotherapeutic时代(3,14]。小说,肿瘤学家因此不太可能接受治疗方案不包括阿霉素。这显然说明了最新的操作系统的临床试验,这是为了比较标准的护理和保健的标准加上小说代理(3,14]。考虑到这一现实,我们比较K7M2细胞的能力与强力霉素治疗后的恢复,CuCl说2,或两者结合。只有“三重治疗”这三个代理证明细胞的细胞毒性并没有恢复。有趣的是,这种效果观察低剂量阿霉素。这是临床上重要的因为cardiotoxic阿霉素是已知的剂量依赖的影响。任何治疗策略,降低阿霉素的累积剂量将必然导致毒性并发症更少。

这项研究有一些局限性。第一和最重要的是,上面描述的实验只使用两个鼠OS细胞株进行比较。虽然K12的和K7M2细胞系比较相关的操作系统提供了一个独特的和强大的机会不同转移表型的细胞,这仍然是一个小数量的细胞系。我们目前试图纠正这个缺陷通过调查这些现象在人类OS细胞群建立,以及主要细胞OS病人在我们的临床实践与已知转移的历史。

5。结论

在这项研究中,我们演示了不同OS细胞系的细胞内铜水平具有不同转移潜能。这些差异与铜运输相关基因的表达。重要的是,添加CuCl2强化了Dis细胞毒性的影响。最后,“与亚致死剂量的阿霉素三重治疗”,说,CuCl2是我们唯一的实验策略评估,导致细胞死亡,细胞不能恢复。根据这些数据,我们推测,高转移性和nonmetastatic OS细胞利用铜不同。我们推测高度转移K7M2积极泵铜细胞外调节细胞恶性入侵和迁移的过程,可能通过基质金属蛋白酶(MMPs)。相反,少转移K12的细胞保持大量的细胞内铜。这将表明,低水平的瘤内铜和高水平的血清铜将预示着更积极和转移表型。我们计划来验证这个实验样品和patient-derived血清和肿瘤。我们还观察到一个强力霉素的关系,说,CuCl2应该在我们的临床前评价小鼠模型的转移操作系统。未来的研究将确定如何利用这些强大的互动的利益转移患者操作系统。

数据可用性

铜水平,qPCR和细胞生存能力数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

库尔特·韦斯博士的部分支持由美国国家癌症研究所(K08CA177927-01和R21CA199472)和阿尔伯特·b·弗格森,医学博士骨科匹兹堡基金会的基金。作者感谢匹兹堡的支持治疗肉瘤和Jon Houy Houy家庭爱的记忆。这个项目使用了癌症药物动力学和药效学设施(CPPF), UPMC希尔曼癌症中心,支持部分奖号。P30CA047904 R50CA211241。作者感谢贝斯斯特罗纳克,办公室的研究,寻求帮助。