文摘

骨肉瘤是最常见的原发恶性肿瘤骨。病人化疗诱导反应不佳的风险较高,预后不良。这种不良预后的分子基础尚不清楚。我们调查microrna的表达在八开活检样本识别microrna预测反应的诱导化疗和因此可能用于危险分层治疗。从四个劣质坏死患者获得的样本(Huvos I / II)和四个优越坏死患者诱导化疗后(Huvos III / IV)。我们发现六个microrna,包括mir - 125 b和mir - 100,是差异表达> 2倍()患者对治疗反应不佳。不良预后之间的关系和丰富的米尔- 125 b和mir - 100定量证实了反向transcriptase-polymerase 20个额外的骨肉瘤患者的连锁反应。因此,过度mir - 125 b和mir - 100在三个增强骨肉瘤细胞株细胞增殖、侵袭性和抵抗化疗药物如甲氨蝶呤、阿霉素、顺铂。此外,过度的mir - 125 b封锁这些化疗药物诱导细胞凋亡的能力。作为开放例行活检是诊断骨肉瘤,mir - 125 b和mir - 100在这些样本可能被用作危险分层的基础治疗。

1。介绍

骨肉瘤是最常见的原发性骨恶性肿瘤和癌症在儿童和青少年死亡的主要原因1,2]。15 - 20%的治愈率在1970年代取得了单靠手术患者局部骨肉瘤。这些利率显著提高到80%后,引入高剂量与可替换主体化疗方案和诱导化疗3,4]。诱导化疗前台的肿瘤和促进通过抑制micrometastatic完整切除肿瘤和减少肿瘤的血管。反应诱导化疗是组织学评估根据Huvos分级系统(5),这是基于肿瘤手术切除组织坏死的程度。≥90%患者肿瘤坏死后诱导化疗被认为是良好的急救员,和其他所有人反应被认为是糟糕2]。值得注意的是组织学反应诱导化疗是最可靠的预后因素,除了转移时诊断(6- - - - - -15]。因此,预测反应诱导化疗可能用于确定最合适的治疗方案(16]。

尽管Huvos分级是广泛使用,它是化疗后的获得,因而无法预测。另一方面,临床上有用的预测生物标记没有被确认,尽管骨肉瘤广泛的特点。这阻碍了有效的分层的患者根据耐药性的风险和可能在治疗防止进一步的创新。因此,必须了解药物抗性的分子基础开发更有效的治疗方法。

骨肉瘤是异构的患者中,基因在肿瘤,肿瘤(17,18]。事实上,骨肉瘤分析表明大量的数值和结构性变化(19]。因此,组学方法综合调查分子事件在多个水平可能确定新的分子机制抵抗治疗。考虑到复杂的机制,可以促进药物抗性、重要生物的见解可能会发现。

以前,我们调查开放活检样品的蛋白质组学概要文件获得骨肉瘤患者化疗和之前确认的酶类2 (PRDX2)作为小说预测生物标志物与响应与异环磷酰胺诱导化疗、阿霉素、顺铂(20.]。随后,我们还发现PRDX2预测反应的诱导化疗药物的不同组合,我们为其功能意义(21]。作为开放例行活检是诊断骨肉瘤,预测生物标记,可以测量收集的样本中,在这个过程中可能会被证明是有用的在临床的设置。

小分子核糖核酸(microrna)很小,非编码RNA -核苷酸长度控制增长、发展和分化转录后的基因表达调控。人类基因组编码1000多microrna [22)调节成千上万的人类基因(23,24]。在骨肉瘤,全球microrna的表达研究了与发作(25,26],进展[27,28),反应治疗(29日,30.],和预后[31日]。然而,这些microrna的临床意义尚未完全建立。

在这项研究中,我们探索的可能性,microrna的表达可能有实用程序在预测响应在骨肉瘤患者新辅助化疗。我们分析了microrna的表达在冷冻诱导化疗前获得的组织样本。我们发现丰富的mir - 125 b的表达和mir - 100与化疗反应差显著相关。我们验证了这个结果使用中存在一个独立的样本集和验证这些microrna的功能意义在体外化验。

2。材料和方法

2.1。病人和临床信息

冰冻的临床标本,收集的开放活检在化疗之前,从国立癌症中心医院检索,日本。从表8例(获得的样本1)2009年和2011年之间被诊断和治疗根据标准治疗协议与甲氨蝶呤、阿霉素、顺铂,被认为是关键药物(32]。术前化疗反应由病理组织学检查评估根据Huvos分级系统(2];不到10%的肿瘤细胞被发现时是可行的,病人被定义为反应者,如果没有,他们被视为nonresponders (chemoresistant)。样品在液氮snap-frozen时收集和储存在−80°C。

一个独立的群20例(表2)是用于验证结果中存在,使用formalin-fixed石蜡包埋标本收集的还开放化疗前活检。这些患者被诊断为1990年和2008年之间。9名患者chemoresistant和11是敏感的。所有患者监控从0.5到11.1年,平均7.7年。七个病人不断无病,七死于这种疾病,六人生活在骨肉瘤。

书面知情同意是来自所有患者,这项研究是国家癌症中心的伦理委员会批准。

2.2。RNA提取和microrna的mRNA数组

粉在液态氮冷冻组织使用Multi-beads震惊(Yasui Kikai,大阪,日本)。那时总RNA提取使用miRNeasy迷你包(试剂盒、Venlo、荷兰)。Formalin-fixed石蜡包埋标本切片在10μm,总RNA提取等几个片使用miRNeasy FFPE工具包(试剂盒)。

microrna的表达谱的冷冻样本杂交获得的总RNA人类microrna的安捷伦芯片V3 (021827、8×15 K v12.0,安捷伦科技,圣克拉拉,CA),遵循制造商的指示。杂化微阵列与DNA芯片扫描仪扫描(安捷伦G2565BA)默认协议和设置。microrna的表达分析在GeneSpring GX软件(安捷伦科技)。microrna表达时被认为是差异表达增加或减少> 1.5倍,在一个未配对以及。

杂交获得的mRNA表达谱的骨肉瘤细胞总RNA SurePrint G3人类通用微阵列(8×60 K, Ver3.0,安捷伦科技,圣克拉拉,CA),遵循制造商的指示。DNA微阵列数据分析Bioconductor agilp包(http://bioconductor.org/packages/agilp/)。探测器被选中,当他们的强度是相当(超过1.5倍变化)两个样本之间的不同。

2.3。验证mir - 100和mir - 125 b在独立样本

mir - 100和mir - 125 b被定量实时反向放大transcriptase-polymerase连锁反应(存在)formalin-fixed石蜡包埋标本。首先,10 ng总RNA的互补脱氧核糖核酸合成使用TaqMan MicroRNA hsa - mir - 100和hsa - mir - 125 b(应用生物系统公司)和TaqMan微RNA逆转录工具包(应用生物系统公司)。目标microrna放大超过45岁变性的周期为10秒95°C,退火60°C 10秒,在65°C 10秒和扩展,在95°C初始变性后10分钟。PCR是一式三份96 - 7300孔板使用实时PCR系统(应用生物系统公司),和microrna的表达是规范化的小核RNA RNU6B(应用生物系统公司)。

2.4。细胞培养和转染

差异表达microrna在骨肉瘤细胞株MNNG-HOS功能特点,143 b, MG63,美国文化集合类型。简单地说,细胞培养在37°C调湿有限公司5%₂室使用10%胎牛血清的DMEM补充,1 L更易与丙酮酸钠,不必要的氨基酸,和2更易与L谷氨酰胺。细胞转染25 nM -控制microrna (Cosmo生物、东京、日本),mir - 100 (Bonac公司、福冈、日本)和mir - 125 (Bonac公司、福冈、日本)使用DharmaFECT转染试剂(热科学、东京、日本),遵循制造商的协议。

2.5。细胞增殖实验

细胞增殖测定使用标准MTS试验。总之,细胞被播种在3×10³细胞/在一个包含100个96孔板μL培养基,一夜之间,生长和转染microrna描述或孵化条件培养基。媒体在转染细胞被替换为新的媒介转染后24小时。细胞生存能力确定3 d之后通过细胞计数Kit-8 (Dojindo、熊本、日本)根据制造商的协议。在这个试验,WST-8脱氢酶活性降低的可行的细胞产生甲瓒染料,溶于组织培养基,化验在450海里(吸光度33]。甲瓒染料生产的量直接与可行的细胞的数量成正比。三个井检查每个治疗和独立实验重复三次。结果报告为平均数±标准差。统计显著性进行了测试以及。

2.6。细胞入侵检测

细胞入侵是评估使用BD BioCoat™入侵室(BD生物科学),遵循制造商的协议。总之,细胞转染mir - 125 b和mir - 100 24 h被播种到膜在参议院的transwell 5×10⁵细胞在500年μ无血清培养基。在下议院中含10%胎牛血清的化学引诱物来源。细胞,通过Matrigel-coated膜沾Diff-Quick (Sysmex、科比、日本)和统计。独立实验进行了三次,是由统计意义以及。

2.7。细胞凋亡检测

细胞转染描述25 nM -控制microrna, mir - 100,和mir - 125 b和72 h与甲氨蝶呤治疗24小时之后,阿霉素48 h,顺铂48 h。蛋白质提取和凋亡蛋白的表达受到西方墨点法测量。

2.8。蛋白质提取和免疫印迹

粉在液态氮冷冻组织Multi-beads震惊和resuspended 6 mol / L尿素,2摩尔/ L硫脲,3%的家伙,1% Triton x - 100。当时上层清液通过离心30分钟的15000 rpm。培养细胞与PBS洗,固定与10%柠檬酸为30分钟,30分钟和细胞溶解在同一个缓冲区。离心后的上层清液收集了30分钟。

蛋白质分离SDS-polyacrylamide凝胶和转移到硝酸纤维素(Bio-Rad)。阻塞1 h后Tris-buffered盐水和渐变20 (TBS-T)补充5%脱脂牛奶,一夜之间,膜被孵化在4°C主要Bak1抗体(单克隆,1:250年,MBL), PARP(1: 1000年,BD) Caspase-3(1: 1000年,BD) Caspase-9(1: 1000年,MBL) Caspase-2(1: 1000年,BD) BMF(多克隆,1:1000年,MBL),彪马(单克隆,1:1000年,BD)、bcl - 2(单克隆,1:500年,BD), PP2A-catalyticα(1:1000年,BD), mcl1(1: 1000年,BD)β肌动蛋白(1:1000年,BD)。膜被广泛用TBS-T和标记辣根peroxidase-conjugated二级anti-mouse(1: 1000年,通用电气)或anti-rabbit免疫球蛋白g(1: 2000年,通用电气)。与TBS-T额外的洗后,抗原抗体复合物与ECL-Prime可视化工具包(GE)。

2.9。骨肉瘤细胞转染的microrna其次是全球基因表达分析

准备的RNA样品,MG63细胞转染25 nM -控制microrna, mir - 100, mir - 125使用DharmaFECT转染试剂。转染后细胞收获在72小时。mRNA表达谱的microrna的转染细胞获得全球mRNA表达研究使用DNA微阵列如上所述。

3所示。结果

我们分析了全球microrna的表达在八冷冻诊断开放的活检标本。临床和病理数据表进行了总结1。肿瘤包括在组织学上成骨细胞的microrna的表达研究,起源于股骨或胫骨。因为先前的研究表明对化疗的反应有显著相关性,组织学34),我们旨在省略组织学偏见在我们的研究中通过使用样本相似的组织学和解剖背景。患者不到10%可行化疗后的肿瘤细胞被认为是良好的急救员,和其他被认为是不良反应者根据Huvos评分系统。表达式分析确定了六个microrna表达明显不同水平()良好的急救员和穷人之间反应者(图1(一)、补充表1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/1390571)。其中,microrna 483 - 3 - p, 100, 124, 125 b,和127 - 3 - p在不良反应者表达更丰富,而mir - 887表达被抑制。临床或病理因素没有明显与微分表达式。确认结果,放大了这些microrna中存在相同的8个样本。这个试验证实明显不同(mir - 125 b的表达和mir - 100在贫穷的反应(数字1 (b)和1 (c))但不是microrna的124年,127 - 3 - p 483 - 3 - p和887(数据1 (d)- - - - - -1 (g))。然而,表达水平衡量存在微阵列数据显示相同的一般趋势。

进一步调查这些观察,我们测量microrna的表达存在于20 formalin-fixed石蜡包埋开放活检样本原发性骨肉瘤(补充表)。肿瘤组织用于验证异构;chondroblastic,他们包括成骨细胞或成纤维细胞的肿瘤,原产地和他们的网站包括胫骨、股骨或髂骨。通过探索这种异构的肿瘤样本,我们旨在展示这些大鹏展翅的通用性预测响应新辅助化疗。我们还发现mir - 125 b和mir - 100表达水平显著升高(在贫穷的反应者(图)2(一个)和2 (b))。接受者操作特性曲线曲线下面积有0.909和0.899的mir - 125 b和mir - 100,分别是(,数据2 (c)和2 (d))。

根据这些结果,我们为特征的功能意义mir - 125 b和mir - 100超表达在骨肉瘤细胞。在细胞增殖实验中,我们观察到mir - 125 b和mir - 100显著提高增长MNNG /居屋计划,143 b, MG63(数字3(一个)- - - - - -3 (c))。此外,我们发现mir - 125 b提升细胞侵袭性MNNG /居屋计划和143 b,而mir - 100增强(所有三个细胞株细胞侵袭性的人物4(一)和4 (b))。这些观察表明,过度的mir - 125 b和mir - 100致瘤性有明显影响。

我们调查的影响,mir - 125 b和mir - 100对化疗药物的有效性。过度的mir - 125 b明显阻止甲氨蝶呤的细胞毒性效应,阿霉素、顺铂在所有细胞(补充图1,表3补充)。mir - 100也阻止了细胞毒性,除了阿霉素的MNNG / HOS细胞(补充图1,表3补充)。随后,我们专注于mir - 125 b,因为它能够阻止所有的化疗药物在所有细胞检查。

我们假设已知mir - 125 b抑制细胞凋亡的能力驱动肿瘤进展和抵抗化疗。事实上,我们发现mir - 125 b超表达显著减少细胞凋亡蛋白的表达,包括p53、Caspase-2, mcl1,彪马,PP2A催化(补充图2 (A))。我们还发现mir - 125 B了甲氨蝶呤的能力,阿霉素、顺铂诱导表达Bak1和裂解PARP(补充图2 (B))。另一方面,过度的mir - 100导致减少的表达CTDSPL和Rb(补充图2 (C))。这些结果与我们的假设一致,mir - 125 b可能导致耐药通过抑制细胞凋亡。

探索的影响mir - 100和mir - 125 b,我们调查了全球mRNA的表达使转染后mir - 100或mir - 125 b。mir - 100的转染和mir - 125 - b诱导的微分表达式35和88个基因,分别为(补充表4和5)。16 mrna一般,或表达下调的转染mir - 100和mir - 125 b(表3)。

4所示。讨论

骨肉瘤病人预后明显有利的新辅助治疗反应良好,这种反应的分子生物标记物预测可能有助于确定适当的疗程。一些这样的生物标记已报告,包括22 (15)和PRDX2与抵抗新辅助治疗在两个独立的研究20.,21]。相比之下,有着et al。35)报道,p16与治疗反应相关。尽管这些研究关于mir - 100和mir - 125 b出现承诺,没有足够的证据来支持他们的实际应用。广泛验证研究需要建立之前的预测效用这些生物标志物应用在诊所。

我们现在报告,丰富表达mir - 100和mir - 125 b在骨肉瘤组织治疗前预测的新辅助化疗反应差。值得注意的是,mir - 100的表达和mir - 125 b被发现在骨肉瘤组织中低于邻近健康组织(36,37]。我们只研究这些microrna的表达在肿瘤组织中,它可能是有益的调查是否表达在邻近组织以某种方式相关的临床和病理参数。mir - 100的优越性和mir - 125 b /其他之前报道预测生物标记应该注意。PRDX2 ROC曲线下的面积是0.90 ()[20.,21]。mir - 100的预测性能和mir - 125 b注意(ROC曲线下的区域大约0.9在每种情况下)相当于PRDX2。然而,PRDX2的表达被西方墨点法测量,无法轻易自动化的一种方法。相比之下,mir - 100的表达水平和mir - 125 b测量中存在,这可以很容易地自动化。mir - 100的实用性和mir - 125 b应该进一步探索。

的报道影响mir - 100和mir - 125 b骨肉瘤细胞的增殖是有争议的。黄等。36)表明,mir - 100抑制Saos-2和MG63细胞扩散,影响反向反义RNA对mir - 100。相比之下,我们发现mir - 100以及mir - 125 b刺激增殖在MNNB /居屋,143 b, MG63细胞(图3)。这种差异的一个可能的解释是使用不同的分析测量细胞增殖33]。骨肉瘤是一种异构的恶性肿瘤,为了建立药物抗性的分子机制,我们可能需要探索一系列骨肉瘤细胞系。

我们发现一般的mrna表达调节的转染mir - 100和mir - 125 b。其中,sirtuin蛋白的表达(沉默交配类型信息监管2同族体5、SIRT5)以前的抵抗在体外和在活的有机体内治疗与cis-diamminedichloroplatinum、5 -氟尿嘧啶或博来霉素在非小细胞肺癌38]。的异常调节SIRT5在各种类型的恶性肿瘤。例如,在乳腺癌,SIRT5的表达与肿瘤的位置有显著关系,年级,和雌激素受体和孕激素受体的表达39]。然而,SIRT5受microrna的异常表达与骨肉瘤没有涉及到我们的研究。sirtuin蛋白家族基因发挥重要作用在致癌作用和癌症进展(40,值得挑战的调查sirtuins蛋白在骨肉瘤的监管和功能。

我们的下一个挑战是建立mir - 100的临床效用和mir - 125 b。作为本研究的病例数有限,临床应用之前可能需要更多的验证研究。预测一个贫穷回应新辅助化疗可能阻止使用费时但最终无效的治疗方法,从而防止病人出现不必要的副作用。不幸的是,没有替代治疗策略。然而,立即手术切除由于预测药物抗性的风险可能改善部分患者的临床结果。识别chemoresistant患者在临床试验也证明他们的包容的新型抗癌药物。最后,我们可以确定新的治疗目标特征之间的相关性的分子基础mir - 100和mir - 125 b表达和应对新辅助化疗。

全球microrna的表达,尤其是mir - 100的表达水平和mir - 125 b在转移性肿瘤是有趣的。最近,Berlanga等人相比,原发性骨肉瘤肺转移性骨肉瘤和识别26个microrna与两者之间明显不同的表达式(41]。尽管mir - 100和mir - 125 b没有确定在他们的研究中,这是他们表达值得研究配对小学和转移性肿瘤组织的病人在化疗治疗的不同反应。mir - 100之间的相关性和mir - 125 b表达水平和肿瘤复发也值得探索。Sanchez-Diaz等人曾报道microrna的身份与小儿骨肉瘤肿瘤复发有关(42]。可能是因为他们关注儿童骨肉瘤,mir - 100和mir - 125 b没有确定是与肿瘤复发有关。新辅助化疗的反应与良好的预后有关,mir - 100的表达和mir - 125 b可能与骨肉瘤预后不良有关。这个假设在未来研究中应解决的。

总之,mir - 100的表达和mir - 125 b预处理的骨肉瘤化疗反应差的显著相关,是一种很有前途的生物标志物指导治疗决策。

信息披露

目前地址Daisuke日本久保田公司矫形外科学系,日本东京顺天堂大学医学院。目前地址Nobuyoshi小坂的动物学、牛津大学,英国牛津大学。现在的藤原地址“矫形外科、日本冈山大学医学院毕业,牙科,和制药科学、冈山、日本。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究受到了实际研究创新的癌症控制(15 ck0106089h0002 15 ck0106089h0003)从日本医学研究和发展机构,由国家癌症中心发展基金(26-A-3),并通过科学研究补助金25871161。

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